POTENCIAL INSETICIDA DO EXTRATO DE Piper tuberculatum (PIPERACEAE) SOBRE Alabama argillacea (HUEBNER, 1818) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) 1

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1 557 POTENCIAL INSETICIDA DO EXTRATO DE Piper tuberculatum (PIPERACEAE) SOBRE Alabama argillacea (HUEBNER, 1818) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) 1 JOSÉ EDNILSON MIRANDA 2, JOSÉ EUDES DE MORAIS OLIVEIRA 3, KELLY CRISTINA G. ROCHA 4, SÉRGIO ANTONIO DE BORTOLI 5, HOSANA M. D. NAVICKIENE 6, MASUO J. KATO 6 e MAYSA FURLAN 6 RESUMO: Plantas da família Piperaceae são conhecidas por conterem em sua composição, substâncias com propriedades inseticidas. A identificação e o isolamento de extratos vegetais se configuram numa alternativa aos produtos químicos convencionais, representando alternativa promissora à incorporação de novas substâncias ao manejo de pragas, com vantagens ecológicas bastante interessantes, pelos baixos impactos ao ambiente e ao homem. O presente estudo foi desenvolvido para avaliar o potencial inseticida do extrato de pimentalonga, Piper tuberculatum (Piperaceae) sobre o curuquerê-do-algodoeiro, Alabama argillacea. O bioensaio consistiu da aplicação tópica de extrato de P. tuberculatum no tórax de lagartas de terceiro ínstar, usando-se microaplicador com seringa calibrada para a liberação de 2mL de solução. Registros da mortalidade larval foram efetuados a 24, 48 e 72 horas após a aplicação. Os dados foram avaliados pela análise de Probit, através do Programa Polo PC. As respostas dos insetos às aplicações do extrato de P. tuberculatum mostraram-se dosedependentes, verificando-se, 72 horas após a aplicação, DL 50 correspondente a 219 mg de extrato.inseto -1. Os resultados confirmaram o potencial inseticida do extrato de P. tuberculatum sobre o curuquerê-do-algodoeiro. Termos para indexação: Insecta, curuquerê-do-algodoeiro, planta inseticida, algodão, toxicidade aguda. INSETICIDAL POTENTIAL OF THE EXTRACT OF Piper tuberculatum (PIPERACEAE) ON Alabama argillacea (HUEBNER, 1818) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) ABSTRACT: Plants from Piperaceae family are known to contain in their composition substances with insecticidal properties. Identification and isolation of compounds from these plants represent an alternative to conventional chemical insecticides, representing a promosing alternative to the incorporation of nex substances to the pest management, with important ecological advantages, like low environmental and human impact. The present study was developed to assess the insecticidal potential of the long-pepper, Piper tuberculatum (Piperaceae), on cotton leafworm, Alabama argillacea. The bioassay was carried out through topical application of P. tuberculatum extract on the thorax of third instar larvae, using an micro-applicator calibrated to liberate 2 ml solution. Larval mortality was recorded at 24, 48 and 72 hours after application. Data were evaluated by Probit Analysis, through the Polo PC Program. The insect reponse to the extract showed dose-dependence, and at 72 hour application the LD 50 corresponded to 219 mg extract.insect -1. The results confirmed the insecticidal property of the P. tuberculatum extract on the cotton leafworm. Index terms: Insecta, cotton leafworm, insecticide plant, cotton, acute toxicity. 1 Aceito para publicação em 12 de Março de Eng. Agr., D.Sc., Embrapa Algodão, , Campina Grande, PB, miranda@cnpa.embrapa.br 3 Eng. Agr., M.Sc., Doutorando em Entomologia Agrícola pela FCAV/ UNESP, , Jaboticabal, SP. 4 Graduanda do curso de Agronomia da FCAV/UNESP. 5 Eng. Agr., Prof. D.Sc., Dep. de Fitossanidade da FCAV/UNESP. 6 Eng. Quím, D.Sc., Instituto de Química, UNESP, , Araraquara, SP.

2 558 J.E. MIRANDA et al. INTRODUÇÃO O uso intensivo de pesticidas para o controle de pragas tem promovido a contaminação do ambiente, causando efeitos maléficos em seres vivos, como seres humanos, animais domésticos, organismos aquáticos e insetos não-alvo, através de exposição direta, ingestão de alimentos e rações contaminadas e contaminação de mananciais (BATISTA et al., 1992). Devido aos problemas ocasionados pelo uso indiscriminado de inseticidas sintéticos, surgiu a necessidade de obtenção de novos produtos para controle de pragas. As plantas constituem a mais importante fonte de compostos químicos orgânicos. Enquanto seu metabolismo primário sintetiza compostos essenciais a todas as espécies vegetais, seu metabolismo secundário produz compostos com diversas funções específicas, entre elas a estratégia de defesa contra o ataque de insetos (VILLALOBOS, 1996). A identificação e o isolamento de compostos vegetais com propriedade inseticida representam alternativa promissora à incorporação de novas substâncias ao manejo de pragas, configurando-se, assim, numa alternativa aos produtos químicos convencionais, visto que a evolução contínua da resistência de pragas a pesticidas limita a adoção, por tempo indefinido, de estratégias baseadas em mortalidade de insetos (TABASHNIK & ROUSH, 1990). Ao contrário de muitos inseticidas sintéticos, os bioinseticidas são rapidamente biodegradados, razão pela qual são menos danosos ao ambiente. Além disso, compostos vegetais costumam apresentar características mais específicas e seletivas, curto efeito residual e baixa toxicidade a mamíferos (DANTAS, 1993; VENDRAMIN, 2000). Entre as plantas cujos extratos apresentam potencial inseticida estão as espécies da família Piperaceae. O gênero Piper se destaca dentro da família por conter espécies que apresentam metabólitos secundários, como lignanas e amidas, usados na defesa contra a herbivoria. Duh & Wu (1990) identificaram o alcalóide piplartina como um dos componentes de efeito tóxico de P. aborescens. Várias lignanas, amidas de longa cadeia e ésteres graxos, foram isolados de extratos de plantas do gênero Piper, substâncias estas reconhecidas por sua ação inseticida, comparável à de piretróides (BOLL et al., 1994). Relatos têm sido apresentados sobre o uso de algumas espécies do gênero Piper como inseticida, na África, como é o caso de P. rotundistipulum e P. guineense (IVBIJARO & BOLAJI, 1990). Outras espécies provenientes da Índia, como P. longum, P. beetle, P. peepuloides e P. cubeba, apresentam atividade inseticida sobre espécies de Coleoptera e Diptera (MIYAKADO et al., 1989). As folhas de P. tutokatsura são conhecidas como deterrentes de alimentação de Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) (MATSUI & MUNSKATA, 1975). Uma amida pirrolidina foi isolada de folhas de P. hispidum e apresentou ação letal contra fungos Cladosporium sphaerospermum (ALÉCIO et al., 1998). A cultura do algodão é atacada por um complexo de insetos, em que espécies da ordem Lepidoptera assumem posições de destaque pela frequência e intensidade de dano na parte aérea das plantas, dentre as quais o curuquerê-doalgodoeiro, Alabama argillacea (Lepidoptera: Noctuidae) pode provocar elevados prejuízos devido à desfolha intensa das plantas, que pode reduzir a capacidade fotossintética, resultando em danos significativos à produção. Com base nesses fatos, o presente estudo foi desenvolvido visando avaliar o potencial inseticida do extrato diclorometano-metanólico de pimenta-longa, Piper tuberculatum (Piperaceae) no controle do curuquerê-doalgodoeiro. MATERIAL E MÉTODOS Criação de manutenção de A. argillacea A criação de A. argillacea foi mantida no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, SP, com condições controladas de

3 POTENCIAL INSETICIDA DO EXTRATO DE Piper tuberculatum 559 temperatura (28±1ºC), umidade relativa (60±5%) e fotoperíodo de 14 horas, seguindose a metodologia sugerida por Oliveira et al. (2001). Cinco casais de A. argillacea foram acondicionados em gaiola de PVC medindo 21,5 cm de altura e 14,5 cm de diâmetro, forradas com papel sulfite, como substrato para oviposição. A parte superior da gaiola foi fechada com tela de tecido voil e sua base apoiada sobre prato plástico forrado com papel-filtro. Os adultos foram alimentados com solução de mel (30%) embebida em esponjas de 0,5 cm de espessura, mantidas no interior da gaiola. Forneceu-se água através de vidro de 10 ml vedado com chumaço de algodão. Diariamente, durante o período de oviposição das fêmeas, o papel contendo a postura foi transferido para gaiolas iguais às usadas para os adultos sendo, após dois dias, transferido para folhas de algodão, mantidas com o pedúnculo imerso em água. Diariamente as folhas eram trocadas e a água responsável pela hidratação da folha reposta. Os insetos permaneceram nestas gaiolas durante toda a fase larval. As pupas, após serem sexadas, foram transferidas para placas de Petri (9,0 x 1,5 cm) e, após seis dias, transferidas novamente para as gaiolas de PVC, para emergência de adultos e coleta de posturas. Extração Plantas de pimenta-longa, Piper tuberculatum (Piperaceae) foram coletadas no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, AM. A obtenção dos extratos foi efetuada no Núcleo de Bioensaio, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais do Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP. Sementes de pimenta-longa foram secadas, moídas e posteriormente extraídas em aparelho Soxhlet, usando-se solvente orgânico diclorometano-etanol (2:1) por período de 48 horas, a temperatura ambiente. Os resíduos foram submetidos a nova extração, para melhor concentração dos extratos obtidos. Esses materiais foram então concentrados a vácuo. Bioensaio de aplicação tópica O bioensaio foi realizado no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, SP, e consistiu da aplicação tópica de extrato de sementes de P. tuberculatum em lagartas de terceiro ínstar do curuquerê-do-algodoeiro, A. argillacea. 100 mg de extrato bruto foram dissolvidos em 200 ml de etanol. Concentrações inferiores foram obtidas por diluições seriadas da solução inicial. Antecedendo o bioensaio de toxicidade aguda, realizou-se um pré-teste para definição de doses, utilizando-se cinco doses (100 ng; 500 ng; 1 mg; 100 mg e 500 mg por inseto) com dez indivíduos por dose, além de um controle com solvente puro. Com base nos resultados do pré-teste, determinaram-se as doses a serem utilizadas, as quais foram: 0,95; 1,90; 3,80; 7,50; 15; 30; 60 e 120 mg por inseto. Um tratamento-controle consistiu da aplicação de solvente puro sobre as lagartas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com nove tratamentos e quatro repetições utilizando-se, em cada tratamento, quarentas lagartas. As aplicações foram efetuadas diretamente sobre o tórax das lagartas, através de um microaplicador modelo Burkard 900-x com micro-seringa Hamilton de 0,5 ml, calibrada para a liberação de 2 ml. Após aplicação, os insetos foram mantidos nas mesmas gaiolas destinadas à criação de manutenção. Registros da mortalidade larval foram efetuados a 24, 48 e 72 horas após a aplicação. Como critérios de avaliação, os indivíduos foram classificados como ilesos ou mortos, conforme resposta ao estímulo de um leve toque com espátula (WILSON, 1990). Os dados foram avaliados pela Análise de Probit (FINNEY, 1971) através do Programa Polo (LEORA SOFTWARE, 1980). RESULTADOS E DISCUSSÃO Em bioensaios de resposta binária (sim ou não, morte ou sobrevivência), a seleção de doses de um produto é baseada em sua letalidade sobre

4 560 J.E. MIRANDA et al. indivíduos-alvo e deve estar funcionalmente relacionada com a dose, de modo que o aumento desta implique em maior suscetibilidade dos organismos envolvidos (ROBERTSON & PREISLER, 1992). De fato, as respostas de A. argillacea às aplicações do extrato de sementes de P. tuberculatum mostraram-se dosedependentes (Figura 1). Assim, quanto maior a dose aplicada, maior foi a taxa de mortalidade dos insetos. Os testes estatísticos componentes da análise de Probit são apresentados na Tabela 1. Os valores preditos pela análise diminuíram a medida em que o intervalo de tempo entre a aplicação e a avaliação aumentou. 72 horas após a aplicação, registrou-se a menor DL 50, correspondente a 219 mg de extrato por inseto. Os testes t, c 2 e o índice de significância g, testaram o conjunto de dados submetido à análise de Probit (FINNEY, 1971). Pelo teste t, que experimentou a linearidade da função doseresposta, verificou-se que todos os valores observados foram significativos e esta hipótese foi aceita em todos os casos. O teste c 2 comprovou a adequabilidade dos dados ao modelo de análise de Probit (ROBERTSON & PREISLER, 1992). Finalmente, o índice de significância g estimou os limites de confiança dos valores médios de cada dose. Segundo Robertson & Preisler (1992), se g é maior que 0,5, o valor da dose letal pode sair fora dos limites de confiança. No presente estudo, os valores mostraram-se apropriados. Quando testada a hipótese de paralelismo para as linhas de regressão obtidas em cada avaliação da ação do extrato, esta foi aceita, indicando que o extrato afetou os insetos com similar modo de ação, porém com intensidade crescente da primeira para a terceira avaliação. Verificou-se, portanto, a ação do extrato no decorrer do tempo, sendo que o maior período avaliado (72 horas) registrou a maior suscetibilidade dos insetos (Figura 2). Os resultados corroboram diversos trabalhos envolvendo o potencial inseticida de plantas da família Piperaceae. Scott & McKibben (1978) efetuaram aplicação tópica de extrato bruto de P. nigrum no bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae) verificando taxa de mortalidade de até 98% e definindo FIG. 1. Mortalidade média de lagartas de terceiro ínstar de Alabama argillacea (Huebner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae) após 72 horas da aplicação tópica em função da dose de extrato de sementes de Piper tuberculatum. Jaboticabal, SP, 2000

5 POTENCIAL INSETICIDA DO EXTRATO DE Piper tuberculatum 561 TABELA 1. Testes estatísticos componentes da análise de Probit e respectivas DL 50 e DL 90 preditas com base nos dados de resposta de Alabama argillacea à aplicação tópica de extrato de Piper tuberculatum. * Significativo (P<0,05). uma DL 50 de 9,6 mg de extrato por inseto. Su & Horvat (1981) isolaram três amidas de P. nigrum e contataram sua ação tóxica contra Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) estimando DL 50 de 2,18 e 6,70 mg por inseto para machos e fêmeas, respectivamente. Bernard et al. (1995) após testarem extratos de diversas espécies do gênero Piper, identificaram lignanas e isobutilamidas entre os compostos de maior toxicidade pós-digestiva para a lagarta do milho, Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Noctuidae). Recentemente, Navickiene et al. (2000) verificaram atividade antifúngica de várias amidas de Piper tuberculatum, entre elas piplartina, pelitorina e piperlonguminina. Toxicidade aguda do extrato de sementes de P. tuberculatum foi constatada sobre a lagarta-dasoja, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) em doses entre 40 e 140 mg por inseto, com taxas de mortalidade de até 82% (MURATA et al., 2000). Escala de Probit y = 0,9655x - 2,2603 R 2 =0,98 y = 0,7785x - 2,1558 R 2 =0,97 y = 0,6576x - 2,2669 R 2 =0, Log da dose 72 h 48 h 24 h FIG. 2. Curvas de mortalidade (em escala de Probit) de lagartas de terceiro ínstar de Alabama argillacea (Huebner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae) em função do logaritmo da dose do extrato de sementes de Piper tuberculatum L. (Piperaceae). Avaliações efetuadas a 24, 48 e 72 horas após a aplicação tópica. Jaboticabal, SP, 2000.

6 562 J.E. MIRANDA et al. CONCLUSÕES 1. O extrato de Piper tuberculatum apresenta efeito tóxico agudo contra lagartas de terceiro ínstar de Alabama argillacea, sendo estimada a DL 50 de 219 mg/inseto após 72 horas de exposição. 2. O potencial inseticida de Piper tuberculatum configura-se como alternativa promissora, sugerindo-se seu fracionamento e isolamento das substâncias ativas, através das quais novos testes deverão determinar sua letalidade a insetos, com vistas à possibilidade de produção comercial de uma nova molécula sintética a ser agregada ao manejo de pragas agrícolas. AGRADECIMENTOS Este estudo foi apoiado pela FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e pelo CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. J.E. Miranda, J.E.M. Oliveira e K.C.G. Rocha são gratos à FAPESP e H.M.D. Navickiene agradece ao CNPq pelo fornecimento de bolsas de estudo. REFERÊNCIAS ALÉCIO, A.C.; BOLZANI, V. da S.; YOUNG, M.C.M.; KATO, M.J.; FURLAN, M. Antifungal amide from leaves of Piper hispidum. Journal of Natural Products, v.61, n.5, p , BATISTA, G.C. de; PARRA, J.R.P.; NAKANO, O. Toxicologia de inseticidas. In: FEALQ. Curso de Entomologia Aplicada à Agricultura. Piracicaba: FEALQ, p BERNARD, C.B.; KRISHNAMURTY, H.G.; CHAURET, D.; DURST, T.; PHILOGÈNE, B.J.R.; SANCHEZ-VINDAS, P.; HASBUN, C.; POVEDA, L.; SAN ROMÁN, L.; ARNASON, J.T. Insecticide defenses of Piperaceae from the neotropics. Journal of Chemical Ecology, v.21, n.4, p , BOLL, P.M.; PARMAR, V.S.; TYAGI, O.D.; PRASAD, A.; WENGEL, J.; OLSEN, C.E. Some recent isolation studies from potential insecticidal Piper species. Pure & Applied Chemistry, v.66, n.10, p , DANTAS, I.M. Toxicidade de isoflavonóides de sementes de Pachyrrhizus tuberosus (Lam.) Spreng (Leguminosae) var. Preta, sobre adultos de Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae) p. Tese Mestrado (Agronomia). Lavras: Escola Superior de Agricultura de Lavras, Lavras, DUH, C.; WU, Y. Cytotoxic pyridone alkaloids from the leaves of Piper aborescens. Journal of Natural Products, v.53,n.6, p , FINNEY, D. J. Probit analysis. Cambridge, England: Cambridge University Press p. IVBIJARO, M.S.; BOLAJI, O.O. Effects of cypermethrin plus dimethoate and extracts of P. guineense and Azadirachta indica on the pests and yields of Cowpea, Vigna Unguiculata. Journal of Agricultural Science, v.115, n.4, p , LEORA SOFTWARE. Polo PC: A user guide to Probit or Logit analysis. Berkeley, CA: LeOra Software, MATSUI, K.; MUNSKATA, K. The structure of piperenone, a new insect antifeedant substance from Piper futokadzura. Tetrahedron Letters, v.15, n.10, p , MIYAKADO, M.; NAKAYAMA, I.; ONO, L. Insecticidal unsaturated isobutylamides: From natural products to agrochemical leads. In: ARNASON, J.T.; PHILOGÈNE, B.J.R.; MORAND, P.J. Insecticides of plant origin. New York: American Chemical Society, p. MURATA, A.T.; NAVICKIENE, H.M.D.; MIRANDA, J.E.; BOLZANI, V.S.; FURLAN, M.; KATO, M.J.; PAREDES, G.E.D; DE BORTOLI, S.A. Susceptibility tests of 4,5-

7 POTENCIAL INSETICIDA DO EXTRATO DE Piper tuberculatum 563 dihidropiperlonguminina isolated from Piper tuberculatum seeds on velvetbean caterpillar. In: INTERNATIONAL CONGRESS OF ENTOMOLOGY, 21., 2000, Foz do Iguaçu. Abstracts... Londrina: Embrapa-CNPSo, p.178. NAVICKIENE, H.M.D.; ALÉCIO, A.C.; KATO. M.J.; BOLZANI, V. da S.; YOUNG, M.C.M.; CAVALHEIRO, A.J.; FURLAN, M. Antifungal amides from Piper hispidum and Piper tuberculatum. Phytochemistry, v.55, n.2, p , OLIVEIRA, J.E.M.; TORRES, J.B.; CARRANO- MOREIRA, A.F.; ZANUNCIO, J.C. Efeito da densidade de presas e do acasalamento na taxa de predação de fêmeas de Podisus nigrispinus (Dallas) (Heteroptera: Pentatomidae) em condições de laboratório. Neotropical Entomology, v.30, n.4, p ROBERTSON, J.L.; PREISLER, H.K. Pesticide bioassays with arthropods. London: CRC Press, p. SCOTT, W.P.; McKIBBEN, G.H. Toxicity of black pepper extract to boll weevils. Journal of Economic Entomology, v.71, n.2, p , SU, H.C.F.; HORVAT, R. Isolation, identification, and insecticidal properties of Piper nigrum amides. Journal of Agricultural Food Chemistry, v.29, n.1, p , TABASHNIK, B.E.; ROUSH, R.T. Introduction. p.1-3. In: ROUSH, R.T.; TABASHINIK, B.E. (Eds.). Pesticide Resistance in Arthropods. New York: Chapman & Hall p. VENDRAMIN, J.D. Plantas inseticidas e controle de pragas. Informativo da Sociedade Entomológica do Brasil, v.25, n.2, p.1-5, VILLALOBOS, M.J.P. Plaguicidas naturales de origen vegetal: Estadio actual de la investigación. Madrid, España: Monografias INIA, p. WILES, J.A.; JEPSON, P.C. The susceptibility of a cereal aphid pest and its natural enemies to deltamethrin. Pesticide Science, v.36, p , WILSON, O. Proposed insecticide/acaricide susceptibility tests developed by Insecticide Resistance Action Committee (IRAC). EPPO Bulletin, v.20, p , 1990.