DETECÇÃO DE FUSOBACTERIUM NUCLEATUM NO SULCO GENGIVAL DE BEZERROS COM E SEM LESÕES PERIODONTAIS PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

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1 1 DETECÇÃO DE FUSOBACTERIUM NUCLEATUM NO SULCO GENGIVAL DE BEZERROS COM E SEM LESÕES PERIODONTAIS PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE DETECTION OF FUSOBACTERIUM NUCLEATUM IN GINGIVAL SULCUS OF CALVES WITH AND WITHOUT PERIODONTAL LESIONS BY POLYMERASE CHAIN REACTION Thamiris Naiasha Minari Ramos (1) Ana Carolina Borsanelli (2) Juliana Vaccari (3) Júlia Rebecca Saraiva (4) Natália Cristina de Souza (5) Robson Varlei Ranieri (6) Elerson Gaetti- Jardim Jr. (7) Iveraldo dos Santos Dutra (8) Resumo A gengivite é uma doença periodontal comum aos seres humanos e aos animais, que pode anteceder os episódios da periodontite e provoca danos à estrutura de sustentação dos dentes. Essas enfermidades periodontais estão associadas à presença e ao acúmulo de biofilme bacteriano sub e supragengival. Dentre os microrganismos potencialmente patogênicos, o Fusobacterium nucleatum está associado à progressão de doenças periodontais. Neste contexto, o microgranismo está presente tanto no sulco gengival de bovinos sadios quanto nas lesões de animais com periodontite. O presente trabalho avaliou pela reação em cadeia da polimerase a presença de Fusobacterium nucleatum na microbiota subgengival de sítios sadios e em sítios de bezerros com gengivite e gengivite necrosante. Concluímos que o Fusobacterium nucleatum está presente em bezerros com lesões periodontais e sadios. Palavras-chave: Bovinos. Gengivite. Gengivite Necrosante. Microrganismo. Periodontites. Abstract Gingivitis is a periodontal disease common to both humans and animals that can predate the episodes of periodontitis and causes damage to the supporting structure of the teeth. These periodontal diseases are associated with the presence and accumulation of sub- and supragingival bacterial biofilms. Among potentially pathogenic microorganisms, Fusobacterium nucleatum is associated with the progression of periodontal diseases. In this context, the microorganism is present in the gingival sulcus of healthy cattle and in the lesions of animals with periodontitis. The present work evaluated by the polymerase chain 1 Mestranda em Medicina Veterinária pela UNESP/FCAV thami.naiasha@gmail.com; 2 Pós- Doutoranda em Medicina Veterinária pela UNESP/FMVA. 3 Mestranda em Medicina Veterinária pela UNESP/FCAV; 4 Mestranda em Medicina Veterinária pela UNESP/FCAV; 5 Doutoranda em Medicina Veterinária pela UNESP/FCAV; 6 Departamento Patologia e Propedêutica Clínica, 7 UNESP/FOA; Professor Titular em Microbiologia, Departamento Patologia e Propedêutica Clínica, UNESP/FOA; 8 Professor Titular em Enfermidades Infecciosas dos Animais Domésticos, Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, UNESP/FMVA

2 2 reaction the presence of Fusobacterium nucleatum in the subgingival microbiota of healthy sites and in sites of calves with gingivitis and necrotizing gingivitis. We concluded that Fusobacterium nucleatum is present in calves with periodontal lesions and healthy. Keywords: Cattle. Gingivitis. Necrotizing Gingivitis. Microorganism. Periodontitis. 1. Introdução As doenças periodontais são inflamações crônicas ou progressivas do tecido gengival (gengivite) que podem progredir para o ligamento periodontal e o osso alveolar (periodontite) (WAYNE et al., 2001). Esse processo inflamatório provoca a destruição dos tecidos de proteção e sustentação do dente culminando para a perda do mesmo (SILVA et al., 2015). As doenças gengivais ocorrem principalmente pelo acúmulo de biofilme subgengival e supragengival constituído por bactérias comensais Gram-positivas e Gram-negativas (KONRADSSON et al., 2007). A saúde do periodonto depende da estabilidade da composição bacteriana da placa dental e a interação dessa com o sistema imune do hospedeiro (HAJISHENGALLIS, 2015). No Brasil, bactérias produtoras de pigmento preto, importantes periodontopatógenos, foram isoladas de lesões periodontais de bezerros (DUTRA, 2000). A vida produtiva de animais de produção é determinada principalmente pela condição dos dentes permanentes, pois assim poderão se alimentar e produzir adequadamente (RIDLER e WEST, 2010). O Fusobacterium nucleatum é um Gram-negativo comensal encontrado em diversos locais do corpo, inclusive na microbiota oral, é um dos primeiros microrganismos a se estabelecer no biofilme dental e está relacionado ao início do desenvolvimento de lesões periodontais (KRISANAPRAKORNKIT et al., 2000; SIGNAT et al., 2011). Apesar de alguns aspectos da etiopatogênese da periodontite bovina já serem conhecidos, pouco que se sabe sobre a progressão das diferentes lesões periodontais em bovinos e a sua microbiota nos diferentes estágios. Assim, o presente estudo teve como objetivo detectar a presença de Fusobacterium nucleatum no sulco subgengival de bezerros com ou sem doença periodontal. 2. Materiais e Métodos Animais, exame clínico, colheita e armazenamento das amostras Avaliou-se cinco bezerros com idade entre quatro e seis meses da raça Jersey, clinicamente saudáveis da região de Araçatuba- SP, que foram mantidos na Faculdade de

3 3 Medicina Veterinária UNESP, câmpus Araçatuba, por quatro meses em pastos cultivados com Panicum maximum em sistema rotacionado, com fornecimento de água e sal ad libitum. A avaliação era semanal e as coletas dos materiais eram realizadas quinzenalmente. As coletas foram realizadas no sulco gengival de cinco dentes (401, 402, 403, 404 e 401 na face lingual) para a realização das análises microbiológicas, obtidos por meio de curetagem ou cone de papel e mantidos em criotubos e conservados a -80ºC até a extração de DNA e os exames periodontais foram realizados por meio da sondagem (sonda Universal - OMS) do sulco gengival de três sítios das faces labial ou lingual de cada um dos dentes coletados. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética de uso nos Animais (CEUA), da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP Câmpus de Jaboticabal-SP, nº /16. Extração do DNA microbiano A extração e a reação em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba UNESP. A extração foi realizada pela técnica de fervura e as amostras foram armazenadas a -80ºC até a realização da PCR. Detecção do Fusobacterium nucleatum por meio da PCR convencional A presença de F. nucleatum foi avaliada por meio da PCR utilizando-se iniciadores e condições específicas para o microrganismo, como descrito na literatura (ASHIMOTO et al. 1996). Os produtos da amplificação pela PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio (0,5 mg/ml). Como controle dos procedimentos de detecção foram empregadas amostras de DNA de cepa de Fusobacterium nucleatum. Como controle negativo foi utilizada água ultrapura. 3 Resultados e Discussão Um total de 117 amostras obtidas no sulco subgengival de cinco bezerros foi avaliado. Essas amostras foram positivas pelo universal, no entanto somente em 24 (20,51%) amostras foram detectadas Fusobacterium nucleatum. A bactéria foi identificada em 17 (14,53%) sítios saudáveis, quatro (3,42%) sítios com gengivite necrosante e três (2,56%) com gengivite. O gênero Fusobacterium spp. é encontrado em diversas partes do corpo, principalmente no trato gastrointestinal de humanos e animais (NAGARAJA et al., 2005). Responsáveis por diversas enfermidades, Fusobacterium nucleatum é o principal

4 4 representante associado às lesões periodontais e à sítios sadios em seres humanos (NAGARAJA et al., 2005; ROBERTS et al., 2000). Em humanos, F. nucleatum foi isolado de pacientes sadios e com periodontite crônica (SHIN et al., 2013). Em animais, já foi identificado em sítios sadios, sítios com gengivite e com periodontite leve em gatos (HARRIS et al., 2015), semelhante aos resultados obtidos na pesquisa, e em ovinos, cabras e bovinos com periodontite (BORSANELLI, 2017; CAMPELLO, 2017; DUNCAN et al., 2003). Este microrganismo também está associado a gengivite necrosante co-ocorrendo com Prevotella intermedia, Treponema spp. e Selenomonas spp. (JOHNSON e ENGEL, 1985). Fusobacterium nucleatum é associado a condições de reduções necessários para a proliferação de anaeróbios Gram-negativos intolerantes ao oxigênio (KOLENBRANDER et al., 2002). Contribui para o aumento de sítios com periodontite inicial por ter capacidade de induzir mudanças significativas na expressão de genes associados à resposta imune, induzir a secreção de enzimas proteolíticas por parte das células epiteliais ativadas e possui influência na apoptose de polimorfonucleares, as primeiras células de defesa do tecido gengival, contribuindo para o recrutamento de outros periodontopatógenos (SIGNAT et al., 2011). 4 Conclusão Fusobacterium nucleatum foi detectado em sítios sadios, com gengivite e gengivite necrosante nos bezerros monitorados. 5 Referências ASHIMOTO, A.; CHEN, C.; BAKKER, I.; SLOTS, J. Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions. Oral Microbiology and Immunology, v.11, p , BORSANELLI, A. C. Genotipagem de Bactérias Anaeróbicas Associadas às Lesões da Periodontite Bovina f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Jaboticabal/SP, CAMPELLO, P. L. Periodontite e Desgaste Dentário em Cabras Leiteiras f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP, Jaboticabal/SP, 2017.

5 5 DUTRA, I. S.; BOTTEON, R. C. M.; DÖBEREINER, J. Modificação da microbiota associada às lesões peridentárias da cara inchada em bezerros transferidos para área indene. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 20, n. 2, p , DUNCAN, W. J.; PERSSON, G. R.; SIMS, T. J.; BRAHAM, P.; PACK, A. R. C.; PAGE, R. C. Ovine periodontitis as a potential model for periodontal studies. Journal of Clinical Periodontology, v. 30, p , HAJISHENGALLIS, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature reviews Immunology, v. 15, p , HARRIS, S.; CROFT, J.; O FLYNN, C.; DEUSCH, O.; COLYER, A.; ALLSOPP, J.; MILELLA, L.; DAVIS, I. J. A pyrosequencing investigation of diferences in the feline subgingival microbiota in health, gingivitis and mild periodontitis. PLoS ONE, v. 10, n. 11, p. 1-22, JOHSON, B. D.; ENGEL, D. Acute Necrotizing Ulcerative Gingivitis A review of diagnosis, etiology and treatment. Journal of Periodontology, v. 57, n. 3, p , KRISANAPRAKORNKIT, S.; KIMBALL, J. R.; WEINBERG, A.; DARVEAU, R. P.; BAINBRIDGE, B. W.; DALE, B. A. Inducible expression of human β-defensin 2 by Fusobacterium nucleatum in oral epithelial cells: multiple signaling pathways and role of commensal bacteria in innate immunity and the epithelial barrier. Infection and Immunity, v. 68, p , KOLENBRANDER, P.E.; ANDERSEN, R. N.; BLEHERT, D.S.; EGLAND, P. G.; FOSTER, J, S.; PALMER, R. J. Jr. Communication among oral bacteria. Microbiology Molecular Biology Review, v. 66, n. 6, p , 2002 KONRADSSON, K.; CLAESSON, R.; VAN DIJKEN, J. W. V. Dental biofilm, gingivitis and interleukin-1 adjacent to approximal sites of a bonded ceramic. Journal Clinical Periodontology, v. 34, p , NAGARAJA, T. G.; NARAYANAN, S. K.; STEWART, G. C.; CHENGAPPA, M. M. Fusobacterium necrophorum infections in animals: Pathogenesis and pathogenic mechanisms. Anaerobe, v. 11, p , RIDLER, A. L.; WEST, D. M. Examination of teethe in sheep health management. Small Ruminant Research, v. 92, p , ROBERTS, G. L. Fusobacterial infections: an underestimated threat. Britanic Journal Biomedical Science, v. 57, p , SHIN, J.; KHO, Y. S.; CHOI, Y. S.; KIM, Y. C.; RHYU, I. C.; CHOI, Y. Antibody and T cell responses to Fusobacterium nucleatum and Treponema denticola in health and chronic periodontitis. Plos one, v. 8, n. 1, p. 1-10, SIGNAT, B.; ROQUES, C.; POULET, P.; DUFFAUT, D. Role of Fusobacterium nucleatum periodontal health and disease. Current Issues Molecular Biology, v. 13, p , SILVA, N.; ABUSLEME, L.; BRAVO, D.; DUTZAN, N.; GARCIA-SESNICH, J.; VERNAL, R.; HERNÁNDEZ, M.; GAMONAL, J. Host response mechanisms in periodontal diseases. Journal Applied Oral Science, v. 23, issue 3, p , 2015.

6 6 WAYNE, D. B.; TRAJTENBERG, C. P.; HYMAN, D. J. Tooth and periodontal disease: a review for the primary-care physician. South Medical Journal, v.94, p , 2001.