Belo Horizonte, março de 2010.

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1 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA DOS VERTEBRADOS Análise comparativa da morfologia gonadal de seis espécies de peixes pertencentes aos gêneros Incertae Sedis em Characidae de ocorrência na bacia do rio São Francisco, Brasil. Yuri Simões Martins Orientador: Nilo Bazzoli Belo Horizonte, março de 2010.

2 Yuri Simões Martins Análise comparativa da morfologia gonadal de seis espécies de peixes pertencentes aos gêneros Incertae Sedis em Characidae de ocorrência na bacia do rio São Francisco, Brasil. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Zoologia de Vertebrados como pré-requisito para obtenção do título de mestre em Zoologia de Vertebrados. Belo Horizonte, março de 2010.

3 FICHA CATALOGRÁFICA Elaborada pela Biblioteca da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais M386a Martins, Yuri Simões Análise comparativa da morfologia gonadal de seis espécies de peixes pertencentes aos gêneros Incertae Sedis em Characidae de ocorrência na bacia do rio São Francisco, Brasil / Yuri Simões Martins. Belo Horizonte, f. : il. Orientador: Nilo Bazzoli Dissertação (Mestrado) Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. Programa de Pós-Graduação em Zoologia de Vertebrados. 1. Ovários. 2. Lambari (Peixe) - São Francisco, Rio. 3. Testículos. 4. Peixe de água doce - Morfologia. I. Bazzoli, Nilo. II. Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. Programa de Pós-Graduação em Zoologia de Vertebrados. III. Título. CDU: 597.5

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5 O presente estudo foi realizado durante o mestrado turma 2008/2010 no Programa de Pós- Graduação em Zoologia de Vertebrados da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, sob orientação do Professor Doutor Nilo Bazzoli, com apoio financeiro e logístico das seguintes instituições: Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias- CODEVASF. Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG). Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

6 Trabalho, loucura e amor: O sol é o limite

7 AGRADECIMENTOS A minha mãe, pelo amor incondicional, pelo carinho e pela paciência. Ao Nilo pela oportunidade, paciência e pelos anos de ensinamentos impagáveis e amizade. Ao Rogério pela grande amizade, pelos ensinamentos e pela maravilhosa confecção do material histológico. A Cledma pela amizade e por sempre ajudar a resolver as burocracias da pesquisa e da academia. Ao Yoshimi e a todo pessoal da CODEVASF pelos momentos de descontração, ensinamentos e apoio logístico durante as coletas. Ao Fábio e a todas outras pessoas que ajudaram na coleta do material. Aos Doutores Hélio Batista dos Santos e Laércio dos Anjos Benjamin. Aos amigos de profissão que deram oportunidades de trabalho. A EQUIPE pela amizade, ensinamentos, trabalho e união durante os melhores anos da minha vida. A todos os colegas, alunos, estagiários e professores do Mestrado em Zoologia que de alguma forma me ensinaram grande parte do meu conhecimento acadêmico e profissional. A Débora pela amizade, paciência e companheirismo. A vida por tudo.

8 RESUMO O presente estudo analisou comparativamente a morfologia gonadal de seis espécies de peixes dos gêneros Incertae Sedis na famíla Characidae. Ovários em maturação de Astyanax fasciatus apresentaram coloração acizentada e nas outras espécies coloração amarelada. Os alvéolos corticais das espécies analisadas são pequenos (5.20± ±2.02 µm) e formados por várias camadas de vesículas descontínuas exceto em Bryconops affinis onde eles são grandes (12.87±2.41 µm) e formando várias camadas de vesículas contínuas. A zona pelúcida é delgada variando de 2.44± 0.90 a 5.79±1.90 µm e espessa em B. affinis (10.57± 2.08 µm). Ondulações na zona pelúcida foram observadas em Astyanax bimaculatus, A. fasciatus, Hemmigramus marginatus e Moenkhausia costae. As células foliculares de B. affinis são prismáticas (28.19± µm) enquanto nas outras espécies elas são pavimentosas (1.52± ±0.78 µm). O presente estudo mostrou nos ovócitos vitelogênicos de B. affinis características morfológicas estatisticamente diferentes daquelas dos outros Incertae Sedis da família Characidae analisadas Nos testículos em maturação avançada de A. bimaculatus e A. fasciatus os espermatozóides encontravam-se embebidos em secreção acidófila que foi gradativamente reabsorvida no estádio parcialmente espermiado. Palavras-chave: ovários, testículos, secreção testicular, ovócito de peixe, morfologia comparativa

9 ABSTRACT This study presents a comparative analysis of gonad morphology for six fish species from the genera Incertae Sedis in the Characidae family. Maturing ovaries of Astyanax fasciatus presented grayish color whilst the other species were yellowish in color. The cortical alveoli of the analyzed species are small (5.20± ±2.02 µm) and are formed by various discontinuous layers of vesicles except in the Bryconops affinis, where they are large (12.87±2.41 µm) and form various continuous layers of vesicles. The pellucid zone is thin and varies from 2.44±0.90 to 5.79±1.90 µm and is thickest in B. affinis (10.57±2.08 µm). Folds in the pellucid zone were observed in Astyanax bimaculatus, A. fasciatus, Hemigrammus marginatus and Moenkhausia costae. The follicular cells of B. affinis are columnar (28.19±13.71 µm) while they are squamous in other species (1.52± ±0.78 µm). This study showed that the morphologic characteristics of the B. affinis vitellogenic oocytes are statistically different than the analyzed other ones Incertae Sedis of the Characidae family. In advanced maturing testicles of A. bimaculatus and A. fasciatus, the spermatozoa were embedded in acidophilic secretion which was gradually reabsorbed in the partially spent males. Keywords: ovaries, testes, testicular secretion, fish oocyte, comparative morphology

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Biometria de seis espécies dos gêneros Incertae Sedis em Characidae da bacia do rio São Francisco, Brasil...37 Tabela 2: Morfologia de ovócitos vitelogênicos de seis espécies dos gêneros Incertae Sedis em Characidae da bacia do rio São Francisco, Brasil...38 Tabela 3: Histometria de ovócitos vitelogênicos de seis espécies de peixes dos gêneros Incertae Sedis na família Characidae da bacia do rio São Francisco, Brasil...39 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Morfologia de ovários...40 Figura 2: Morfologia de testículos...41

11 SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÃO GERAL Rio São Francisco Morfologia gonadal Gêneros Incertae Sedis na família Characidae Biologia das espécies JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos ARTIGO SUBMETIDO Abstract Introduction Material and Methods Results Discussion Acknownledgements References CONCLUSÕES REFERÊNCIAS (Introdução Geral)... 43

12 1. INTRODUÇÃO GERAL 1.1 Rio São Francisco A bacia do rio São Francisco, conhecido como rio da integração nacional, drena as áreas dos estados de Minas Gerais, Bahia, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e o Distrito Federal, além de abranger os biomas Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica. Esta bacia é tradicionalmente dividida em quatro segmentos: alto, médio, submédio e baixo (Godinho & Godinho, 2003). O alto compreende da nascente até Pirapora, com uma extensão de 630 Km. O trecho alto da bacia é aquele que se encontra em estado mais avançado de degradação devido ao grande desenvolvimento antrópico, sendo a poluição e assoreamento os maiores causadores de impacto (Alves & Pompeu, 2001). No alto São Francisco encontra-se o reservatório de Três Marias, formado em 1961, sendo o mais antigo dos grandes reservatórios brasileiros. Quando na sua cota máxima apresenta área de inundação de km 2 e volume da ordem de 21 bilhões de m 3. Foi formado para atender os seguintes objetivos principais: regularização do rio São Francisco, facilitar a navegação entre Pirapora e Juazeiro, controle das cheias, viabilizar a implantação de projetos de irrigação, melhorar o funcionamento das usinas hidrelétricas no Sub-Médio São Francisco e produção de energia (Britski et al., 1988). Com o enchimento do reservatório houve a formação da cidade de Três Marias, que é conhecida pela grande quantidade de pessoas que vivem da pesca e turismo de pesca. Em 1986 encontrava-se em atividade no reservatório de Três Marias um total de 158 pescadores efetivos que capturavam cerca de 400 toneladas de pescado por ano, principalmente corvina, piau-branco, curimatã-pioa, curimatã-pacu, mandi-amarelo, traíra, trairão e piranha (Sato & Osório, 1988). Atualmente a pesca no reservatório de Três Marias é praticada por cerca de 300 pescadores artesanais, que capturam cerca de 500 toneladas de pescado por ano, sendo as espécies mais abundantes curimatã-pacu, Curimatã-pioa, tucunaré, corvina, mandi amarelo, trairão e pirambeba (Sato & Sampaio, 2005). A pesca esportiva (amadora), que anteriormente era inexpressiva, teve um grande incremento com o crescimento econômico da região e atualmente representa geração de emprego e renda para moradores da região (FUNDEP, 2006). São listadas, para a bacia do rio São Francisco, 244 espécies de peixes, das quais 214 são nativas (Barbosa & Soares, 2009). Esta ictiofauna vem sendo estudada desde as primeiras expedições científicas no Brasil a exemplo de Lutken (1875). E embora haja um longo período de estudos da ictiofauna do rio São Francisco, estudos básicos sobre a 12

13 biologia de peixes são ainda incipientes nesta bacia à velocidade que a bacia é severamente impactada e as espécies são extintas. 1.2 Morfologia Gonadal A morfologia gonadal tem sido amplamente estudada em nível anatômico e microscópico para identificar ciclo reprodutivo, freqüência de desova, fecundidade e outros parâmetros da biologia reprodutiva que podem ser utilizados como ferramentas nos estudos sobre biologia de peixes (Parenti & Grier, 2004). Entretanto, estes parâmetros têm sido analisados independentemente e geralmente para uma espécie, havendo ausência de estudos holísticos, que envolvam várias espécies e com caráter comparativo (DeFalco & Capel, 2009). Variações na morfologia gonadal de peixes refletem importantes adaptações ecológicas e comportamentais durante a reprodução (Fishelson & Gon, 2008). Além disso, esta plasticidade fenotípica da morfologia gonadal demonstra a adaptabilidade às mudanças ambientais (DeFalco & Capel, 2009). Apesar da morfologia gonadal ter grande importância evolutiva e filogenética, pesquisas comparativas dessa natureza são ainda pouco elucidadas entre os vertebrados (Parenti & Grier, 2004; DeFalco & Capel, 2009). Alguns estudos têm analisado comparativamente aspectos reprodutivos em um amplo espectro de espécies pertencentes a vários grupos (Pudney, 1993; Bazzoli & Godinho, 1994; Bazzoli & Godinho, 1995; Rizzo et al., 2002; Sato et al., 2003; Parenti & Grier, 2004); entretanto, poucos estudos comparam a morfologia gonadal de espécies intimamente relacionadas (Fishelson & Gon, 2008; Belova, 2008). Além disso, estudos sobre a morfologia gonadal são realizados principalmente com espécies de grande porte ou que tenham interesse na pesca comercial (Parenti & Grier, 2004). Desta forma, a morfologia gonadal de grupos taxonômicos de espécies de pequeno porte tem sido pouco estudada na região neotropical fazendo com que a biologia e a sistemática destas espécies sejam pouco conhecidas. 1.3 Gêneros Incertae Sedis na família Characidae A família Characidae possui mais de 1000 espécies descritas, distribuídas desde o sudeste dos Estados Unidos até a região da Patagônia na Argentina (Mirande, 2009). Uma série de controvérsias sobre a biologia e agrupamento de gêneros e subfamílias de Characidae ocorre devido à ampla distribuição e ausência de estudos básicos e de espécies em bacias ainda não amostradas na região neotropical (Géry, 1977; Weitzman & Malabarba, 13

14 1998; Lima et al., 2003; Mirande, 2009). A subfamília Tetragonopterinae e seus gêneros aliados foram anteriormente agrupados em um grande grupo dentro da família Characidae (Géry, 1977). Recentemente, foi visto que Tetragonopterinae e seus grupos aliados, além de outros gêneros em Characidae, não formam grupos monofiléticos (Weitzman & Malabarba, 1998), e devido a este fato foram incluídos em gêneros Incertae Sedis em Characidae, cuja biologia é pouco estudada (Lima et al., 2003). Desta forma, apenas o gênero Tetragonopterus compõe a subfamília Tetragonopterinae atualmente (Lima et al., 2003; Reis et al., 2003). No presente estudo foram utilizadas seis espécies dentro do grupo Incertae Sedis em Characidae encontradas no reservatório de Três Marias no trecho alto-médio do rio São Francisco: Astyanax bimaculatus (Linnaeus, 1758), Astyanax fasciatus (Cuvier, 1819), Bryconops affinis (Günther, 1864), Hemmigrammus marginatus Ellis, 1911, Moenkhausia costae (Steindachner, 1907) e Triportheus guentheri (Garman, 1890); espécies sedentárias, forrageiras e de pequeno porte que ocorrem na bacia do rio São Francisco. 1.4 Biologia das espécies Astyanax bimaculatus (Linnaeus, 1758) lambari-do-rabo-amarelo O lambari-do-rabo-amarelo, como é conhecido na região de Três Marias-MG (Bristski et al. 1986), possui ampla ocorrência geográfica, distribuindo-se em bacias hidrográficas localizadas do Panamá até a Patagônia (Lima et al., 2003). Em reservatórios, A. bimaculatus habita a região litorânea, preferencialmente na presença de macrófitas (Arcifa et al., 1991). Em lagoas marginais do rio São Francisco, a espécie foi considerada herbívora, alimentando-se principalmente de macrófitas e, eventualmente, peixes, escamas, algas filamentosas, sementes e insetos aquáticos (Pompeu & Godinho, 2003). Em zonas riverinas, A. bimaculatus é espécie onívora apresentando oportunismo trófico sazonal, sendo vegetais e insetos os principais componentes de sua dieta, variando a importância do item 14

15 alimentar conforme disponibilidade temporal (Villella et al., 2002). Esta espécie possui o pico reprodutivo durante a época chuvosa e apresenta desova parcelada (Miranda, 1996). Seus ovos são levemente adesivos, de coloração amarelada, e medindo cerca de 1 mm (Sato et al., 2003). Além disso, a espécie apresenta fecundidade absoluta de aproximadamente ovócitos extruídos (Sato et al., 2003). Outros aspectos reprodutivos de A. bimaculatus foram estudados na bacia do rio São Francisco, como: morfologia do núcleo vitelínico (Cangussu-Mariani et al., 1990; Bazzoli & Godinho, 1995), morfologia e conteúdo histoquímico dos alvéolos corticais (Bazzoli & Godinho, 1994), atresia folicular (Miranda et al., 1999); superfície de ovos (Rizzo et al., 2002) e parâmetros reprodutivos em cativeiro (Miranda, 1996; Sato et al., 2003). Astyanax fasciatus (Cuvier, 1819) lambari-do-rabo-vermelho Astyanax fasciatus possui ampla distribuição na região neotropical, ocorrendo do México até a Argentina (Lima et al., 2003). Na região de Três Marias a espécie é conhecida como lambari-do-rabo-vermelho (Britski et al., 1986). A. fasciatus habita a região litorânea em rios e lagos em associação com macrófitas aquáticas (Vilella et al., 2002). Por outro lado, quando a espécie ocorre em simpatria com A. bimaculatus, como no reservatório de Três Marias, adultos de A. fasciatus habitam a região limnética a fim de evitar-se a competição interespecífica com o congenérico (Arcifa et al., 1991). Em lagoas marginais do rio São Francisco A. fasciatus foi considerada insetívora, mas alimentando-se também de algas filamentosas, frutos e sementes (Pompeu & Godinho, 2003). Estudos da dieta desta espécie em reservatórios e riachos demonstraram que ela é zooplanctófaga, alimentando-se principalmente de microcrustáceos (Barbosa & Matsumura-Tundisi, 1984; Graciolli et al., 2003). A. fasciatus possui desova parcelada com o pico reprodutivo no final da estação chuvosa (Carvalho et al., 2009), podendo ser bioindicador de qualidade de habitat, pois os 15

16 parâmetros reprodutivos sofrem mudanças significativas conforme o grau de degradação do ambiente (Schulz & Martins-Júnior, 2001). Além do ciclo reprodutivo, são conhecidos outros parâmetros da reprodução da espécie, como morfologia do núcleo vitelínico (Bazzoli & Godinho, 1995), morfologia e conteúdo histoquímico dos alvéolos corticais (Bazzoli & Godinho, 1994) e dinâmica da ovogênese (Garcia et al., 2001). Bryconops affinis (Günther, 1864) piaba-verde Bryconops affinis é popularmente conhecida como piaba-verde na região de Três Marias (Britski et al., 1986). A espécie distribui-se pelas bacias costais das Guianas e Suriname (Lima et al., 2003) e também é encontrada na bacia do rio São Francisco (Britski et al., 1986). A piaba-verdre habita todos os tipos de ambientes nas bacias em que se encontra, mas é mais comum em riachos e em ambientes onde o nível da água está em constante flutuação, tais como lagoas marginais e desembocadura de rios e de riachos (Planquette et al., 1996). No reservatório de Três Marias a espécie foi considerada insetívora, alimentando-se principalmente de insetos terrestres encontrados na superfície (Gomes & Verani, 2003). B. affinis apresenta desova parcelada com o pico reprodutivo no início da estação chuvosa (Nogueira at al., 1997). Além do ciclo reprodutivo, outros parâmetros da reprodução, como morfologia do núcleo vitelínico (Bazzoli & Godinho, 1995), morfologia e conteúdo histoquímico dos alvéolos corticais (Bazzoli & Godinho, 1994), dinâmica da gametogênese (Andrade et al., 2001) e a superfície de ovos (Rizzo et al., 2002) já foram estudados. 16

17 Hemigrammus marginatus Ellis, 1911 piaba A piaba como é conhecida na região de Três Marias (Britski et al., 1986) encontra-se distribuída nas bacias dos rios São Francisco, Itapicuru, Paraná, Guaporé, Amazonas e Orinoco (Lima et al., 2003). Estudos que analisaram sua alimentação em lagoas marginais do rio São Francisco, bem como em outras bacias, constataram o hábito alimentar insetívoro, mas alimentando-se também de algas filamentosas e zooplankton (Pompeu & Godinho, 2003; Crippa et al., 2009). H. marginatus habita ambientes de margem em associação a macrófitas aquáticas (Crippa et al., 2009). Esta espécie possui desova parcelada com o pico reprodutivo acontecendo juntamente com o pico de chuvas (Bazzoli et al., 1997). Excetuando a dinâmica da ovogênese (Bazzoli et al., 1996), outros parâmetros da reprodução de H. marginatus ainda são pouco estudados. Moenkhausia costae (Steindachner, 1907) piaba A piaba-mantega como é conhecida na região de Três Marias (Britski et al., 1986), distribui-se nas bacias dos rios São Francisco e Itapicuru (Lima et al., 2003). A espécie é pouco conhecida quanto a sua história de vida, havendo na literatura apenas relatos de sua ocorrência em estudos de estrutura de comunidade (Silva et al., 2006) e ciclo reprodutivo (Bazzoli et al., 1997), mostrando que a espécie apresenta desova parcelada com o pico reprodutivo ocorrendo juntamente com o pico de chuvas (Bazzoli et al., 1997). 17

18 Triportheus guentheri (Garman, 1890) piaba-facão A piaba-facão como é conhecida na região de Três Marias (Bristki et al., 1986), é endêmica da bacia do rio São Francisco (Lima et al., 2003). Esta espécie habita rios e lagos em porções onde ocorrem macrófitas, possui atividade de forrageio intensa na superfície, alimentando-se principalmente de insetos. Eventualmente, outros itens compõem sua dieta, como peixes e algas filamentosas (Gomes & Verani, 2003; Pompeu & Godinho, 2003). T. guenteri possui desova parcelada com o pico reprodutivo ocorrendo entre os meses de novembro e fevereiro (Godinho, 1994). Além do ciclo reprodutivo, outros parâmetros ligados à reprodução já foram estudados, como: morfologia do núcleo vitelínico (Bazzoli & Godinho, 1995), morfologia e conteúdo histoquímico dos alvéolos corticais (Bazzoli & Godinho, 1994) e superfície de ovos (Rizzo et al., 2002). 18

19 2. JUSTIFICATIVA Ao contrário dos Siluriformes, importante ordem de peixes sul-americanos, não existem estudos comparativos sobre a morfologia gonadal dos Characiformes, apesar da importância dessa ordem. As espécies dos gêneros Incertae Sedis em Characidae (Characiformes) analisadas no presente trabalho carecem de informação sobre sua biologia básica. E desta forma, estudos comparativos sobre morfologia gonadal são necessários para esclarecer e levantar novas informações sobre a biologia reprodutiva de peixes ósseos (Parenti & Grier, 2004; Fishelson & Gon, 2008). Considerando que a origem e agrupamento dos gêneros Incertae Sedis em Characidae são incertas, denota-se a necessidade de elaborar estudos que forneçam características morfológicas que elucidem as diferenças entre os gêneros desta família, uma vez que os parâmetros utilizados para separação de subfamílias deste grupo ainda não formam agrupamentos claramente distintos (Mirande, 2009). 3. OBJETIVO 3.1 Objetivo geral Analisar comparativamente as principais diferenças morfológicas de ovários e de testículos em seis espécies de peixes dos gêneros Incertae Sedis em Characidae de ocorrência na represa de Três Marias, rio São Francisco, Minas Gerais. 3.2 Objetivos específicos Verificar diferenças quanto à organização anatômica, forma, volume, coloração e estruturas acessórias de ovários e de testículos; Descrever a morfologia e organização de alvéolos corticais, zona pelúcida e células foliculares; Determinar, em ovócitos vitelogênicos, diâmetro ovocitário, diâmetro dos alvéolos corticais, espessura da zona pelúcida e altura das células foliculares; Avaliar prováveis diferenças estatísticas entre diâmetro dos ovócitos vitelogênicos e alvéolos corticais, espessura da zona pelúcida e altura das células foliculares; Determinar o conteúdo histoquímico de alvéolos corticais, glóbulos de vitelo, zona pelúcida, células foliculares e secreção testicular; Descrever a morfologia dos testículos quanto à distribuição das espermatogônias, organização dos túbulos seminíferos e presença de secreção testicular; Comparar entre as espécies os parâmetros analisados. 19

20 4. ARTIGO SUBMETIDO 20

21 Comparative analysis of gonadal morphology in six fish species of the Incertae Sedis genera in Characidae of occurrence in the São Francisco River Basin, Brazil. Yuri Simões Martins¹, Fábio Pereira Arantes², Yoshimi Sato³, José Enemir dos Santos¹, Elizete Rizzo² and Nilo Bazzoli¹. ¹Graduate Program on Zoology of Vertebrates, Pontifical Catholic University of Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. ²Institute of Biological Sciences, Morphology Department, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. ³Hydrobiology and Fish Hatchery Station of Três Marias, Três Marias, Minas Gerais, Brazil. correspondence: Condensed title: Gonad morphology in Incertae Sedis Characidae Abstract Martins, Y. S. Arantes, F.P., Sato, Y., Santos, J. E., Rizzo, E. and Bazzoli, N Comparative analysis of gonadal morphology in six fish species of the Incertae Sedis genera in Characidae of occurrence in the São Francisco River Basin, Brazil. Acta Zoologica (Stockholm) xx: This study presents a comparative analysis of gonad morphology for six fish species from the genera Incertae Sedis in the Characidae family. Maturing ovaries of Astyanax fasciatus presented grayish color whilst the other species were yellowish in color. The cortical alveoli of the analyzed species are small (5.20± ±2.02 µm) and are formed by various discontinuous layers of vesicles except in the Bryconops affinis, where they are large (12.87±2.41 µm) and form various continuous layers of vesicles. The pellucid zone is thin 21

22 and varies from 2.44±0.90 to 5.79±1.90 µm and is thickest in B. affinis (10.57±2.08 µm). Folds in the pellucid zone were observed in Astyanax bimaculatus, A. fasciatus, Hemigrammus marginatus and Moenkhausia costae. The follicular cells of B. affinis are columnar (28.19±13.71 µm) while they are squamous in other species (1.52± ±0.78 µm). This study showed that the morphologic characteristics of the B. affinis vitellogenic oocytes are statistically different than the analyzed other ones Incertae Sedis of the Characidae family. In advanced maturing testicles of A. bimaculatus and A. fasciatus, the spermatozoa were embedded in acidophilic secretion which was gradually reabsorbed in the partially spent males. Keywords: ovaries, testes, testicular secretion, fish oocyte, comparative morphology Introduction The Characiformes order comprises many families and subfamilies, and the Characidae family is the largest and most complex of this order with about 250 south- American genera (Nelson, 2006). The old subfamily Tetragonopterinae, which is nowadays included in the Incertae sedis genera of Characidae is, undoubtedly, the fish group with the highest success rate in terms of colonization and diversification in neo-tropical waters, having occupied practically every freshwater niches in the America (Géry, 1977; Lima et al., 2003). Most species of the Incertae Sedis group are small in size, and is important in aquariofily, as well as being important in the food chain as forragers fishes for various ecosystems. Due to the lack of studies and to the complexity of the Characidae family, clustering of these genera still presents taxonomic and phylogenetic issues (Lima et al., 2003). Many small-sized species of this group used to be included in the Tetragonopterinae, Triportheinae, Bryconinae and other alied groups (Géry, 1977) however today they are included, until the last check-list of neotropical species, in the Incertae Sedis group of the Characidae family (Reis et al., 2003). This is due to the lack of monophyly in amongst the 22

23 subfamilies, which were evidenced in phylogenetic studies, using osteological, biometric and meristic parameters and others, showing that the origin, diversification, and clustering of these taxa are still uncertain (Weitzman & Malabarba, 1998). The last check-list (Reis et al, 2003) listed 88 genera as being Incertae Sedis in the Characidae family, and their biology and sistematics remain still largely unknown (Lima et al., 2003). On the other hand, a recent paper on Characidae phylogeny pointed plus 4 new Incertae sedis genera within this family (Mirande, 2009). Analyses of gonad morphology are important for understanding the species biology and have been extensively applied to the Teleostei. These analyses are useful tools, encompassing various basic parameters and have been utilized in recent studies such as: spermatogenesis (Nóbrega et al., 2008; Schulz et al., 2009), folliculogenesis (Lubzens et al., 2010; Martins et al., 2010), reproductive cycle (Carvalho et al., 2009; Honorato-Sampaio et al., 2009; Nuñes & Duponchelle, 2009; Vieira et al., 2009; Casali et al., 2010), fecundity (Normando et al., 2009), reproductive strategies (Godinho et al., 2010), amongst others. Despite the fact that gonad morphology is extensively used for the understanding of reproduction and life story of the species, few studies compare reproductive parameters between related species, since these characteristics may be phenotypically similar in some groups (Godinho et al., 2010). Ultrastructure studies showed that the egg surface and micropile patterns of Siluriformes and Characiformes follow a pattern in species of the same family and subfamily (Rizzo et al., 2002). In a review, Parenti & Grier (2004) observed, through the organization of semniferous lobules/tubules and the distribution of spermatogonia throughout the germinal epithelium, an evolutionary net of the testis morphology amongst groups of bonefish. Fishelson & Gon (2008) compare the ovarian morphology related to reproductive strategies in Apogongidae species and observed that such characteristics are common amongst closely related genera and species, contributing to 23

24 the understanding of the evolutionary reproductive history of this group. Through a comparative analysis of the Myctophidae oogenesis, Belova (2008) observed similarities during oocyte maturation which suggests that the Myctophidae should be divided in two subfamilies. Although the small-sized species of Characidae are the most successful and diversified in the neotropical region (Géry, 1977), studies aimed at the understanding of this group are still scarce, especially comparative ones. Furthermore, the classical parameters for understanding one evolution of this group still do not form distinct clades that can clearly separate the small-sized species of Characidae, and allocate them to genera Incertae Sedis in this family (Weitzman & Malabarba, 1998; Lima et al., 2003; Mirande 2009). Considering that the gonad morphology presents important data for reproductivce biology, phylogeny and systematic studies, these kinds of analyses are important for understanding the Characidae evolution. Therefore, this study comparatively assess the gonad morphology of the species Astyanax bimaculatus (Linnaeus, 1758), Astyanax fasciatus (Cuvier, 1819), Bryconops affinis (Günther, 1864), Hemigrammus marginatus Ellis, 1911, Moenkhausia costae (Steindachner, 1907) and Triportheus guenteri (Garman, 1890), being sedentary species exhibiting fractioned spawning preferentially in lentic environments (Godinho et al., 2010), included in Incertae Sedis genera of Characidae, and found in the São Francisco River Basin, Brazil. Material and Methods A total of 362 specimens of forrager fish were captured in Três Marias reservoir in the state of Minas Gerais (18-20º S, 44-46º W), in the southeastern Brazil, between March 2006 and February The fish were captured using gillnets and trawl. The captured individuals belonged to six species and the sex, total length and body weight of each fish were determined (Table 1). The captured specimens were taken to the CODEVASF/CEMIG 24

25 Hydrobiology and Fish Hatchery Station of Três Marias to be analyzed. The fish, which were still alive in the nets, were handled in accordance with the Animal Experimentation Guidelines established by the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA) and were sacrificed with a cross section of the cervical medulla (Andersen et al., 2008). After dissection, form and color of the testes and ovaries were analyzed and photographies were taken. For microscopic analysis, gonad fragments were fixed in Bouin s liquid for 8-12 hours and were submitted to the routine histological techniques: embedded in paraffin, sectioned with of 3-5 µm thickness and stained with hematoxylin-eosin. In histological slides, the oocyte diameter, the cortical alveoli diameter, the pellucid zone thickness and the follicular cell height were determined for 50 vitelogenic oocytes from each species, with support of morphometric ocular coupled to a light microscope. In order to compare the measurements obtained in the morphometric analysis, the Kruskal-Wallis test was done, followed by Dunn test when required for the p 0.05 significance. In order to determine the content of the proteins and carbohydrates from testicular secretion and the vitelogenic oocytes structures, the following histochemical techniques were used (Pearse, 1985): - Periodic acid Schiff (PAS) for neutral glycoproteins and sialomucins; - Alcian Blue ph 2.5 for glyco-conjugated carboxylic and sulfated acids, including sialomucins; - Alcian Blue ph 0.5 for glyco-conjugated sulfated acids; - Acidic hydrolysis with HCl 0.1 N (8 H at 60 o C) to extract sialic acid, followed by PAS and Alcian Blue ph

26 Results Ovaries The ovaries of the analyzed species are sac-shaped placed dorsally in the coelomic cavity, caudal ventrally joining in the urogenital papilla. No accessory structures to the ovary were observed in the analyzed species (Figures 1 A and B). Maturing ovaries showing vitellogenic oocytes visible to the naked eye and are grayish in A. fasciatus and yellowish in the other species ( Fig. 1 A and B Table 2). Vitellogenic oocytes, with diameters varying between ± and ± µm, present yolk globules, cortical alveoli, a pellucid zone and follicular cells evident (Table 3). The cortical alveoli of A. bimaculatus, A. fasciatus, H. marginatus, M. costae and T. guenteri are small and are formed by various discontinuous layers of vesicles with diameters ranging from 5.20±1.44 to 8.28±2.02 µm, whilst the cortical alveoli in B. affinis are large and form various continuous layers of vesicles with a 12.87±2.41 µm diameter (Table 2 and 3). In the studied species, the cortical alveoli reacted positively to PAS and AB 2.5, and neutral glycoprotein, and glyco-conjugated carboxylic were detected but no sialic acid rich glycoprotein was formed, due to the fact that the PAS and AB 2.5 reactions remained unaltered after acidic hydrolyses. The pellucid zone in the vitellogenic oocytes of A. bimaculatus, A. fasciatus, H. marginatus, M. costae is thin and folded (Fig. 1 C). In B. affinis and T. guenteri, the pellucid zone has a continuous aspect with no folds (Fig. 1 D), and presents a single layer to PAS in B. affinis and two layers in another analysed species (Table 2). The thickness of the pellucid zone varied between 2.44± ±1.9 µm, except in B. affinis in which it was 10.57± 2.08 µm (Table 3). In the pellucid zone, follicular cells and yolk globules of the analyzed specimens, neutral glycoproteins were detected due to the positive reaction to PAS. The follicular cells of the vitellogenic oocytes of A. bimaculatus, A. fasciatus, H. marginatus, M. costae and T. guenteri are squamous (Fig. 1 C and Table 2), 26

27 whereas in B. affinis they are columnar (Fig. 1 D and Table 2). The follicular cells height in B. affinis was 28.19±13.71 µm, and, in the other species it varied between 1.52± ±0.78 µm (Table 3). Testes The testes of the analyzed specimens were placed dorsally in the coelomic cavity, caudal ventrally joining in the urogenital papilla. There were no testicular accessory structures in the analyzed species (Fig. 2A). Histologically, the testes are constituted by seminiferous tubules, tubular compartment, and are organized in groups of germinative cells surrounded by cytoplasmic extensions of the Sertoli cells forming cysts (Figures 2 B-F). In the analyzed species, the seminiferous tubules branch out forming anastomosis (Fig. 2 B). Between the seminiferous tubules a connective tissue matrix was observed, which contained Leydig cells, the interstitial compartment. In each cyst, the germ cells were in the same developmental stage, but during gonadal maturation the cysts were in different stages, and presented spermatogonia throughout the testis. During the stage of advanced maturation, the species A. bimaculatus and A. faciatus presented, in the lumen of the seminiferous tubules, spermatozoa embedded in an acidophilic secretion (Figures 2 C and D) which was gradually resorpted during the partially spent stage (Figs. 2 E and F). In this testicular secretion, neutral glycoproteins were detected from the positive reaction to PAS. Discussion The ovarian color of the analyzed species varied between tones of gray in A. fasciatus and tones of yellow in the other species. Pigments such as astaxanthin, lutein, taraxanthin and other carotenoids on the yellow/orange yolk coloration have been largely studied in species feed on Krill and temperate water copepods (Goodwin, 1986; Svensson et al., 2010). On the other hand, there are no conclusive studies on neotropical fish species about the origin, composition and function of the carotenoids on the yolk. The oocytes 27

28 coloration depends on diet and its important for offspring identification, selection of healthy females and offspring selection for parental care (Blount & Houston, 2000). The carotenoid derived coloration indicates health status, due to the fact that these substances are antioxidant and immunostimulant (Olsen & Owens, 1998). Little is known about the phylogenetic importance of the carotenoids, since it has been analyzed mainly between wide vertebrate groups (Lubzens et al., 2003). Hence, the yolk color can has a role in sexual selection, parental care and feeding (Blount & Houston, 2000). The diet and spatial interaction analysis between A. bimaculatus and A. fasciatus in sympatry showed that the species present habitat segregation and have feeding selectivity when adult (Arcifa et al., 1991). Consequently, the color tone variation of the yolk observed in the present study may be due to the feeding selectivity or to the differences in the carotenoids metabolic pathways. In this study, larger diameters of cortical alveoli in vitellogenic oocytes were observed in B. affinis when compared to the cortical alveoli of the other analyzed species. Furthermore, no difference was found in the histochemical content of the cortical alveoli. These resemblances in form and histochemical content of the cortical alveoli suggest that the analyzed species may have a similar polyspermy block mechanism. This hypothesis is reinforced by means of Bazzoli & Godinho (1994) who analyzed the morphology and histochemical content of cortical alveoli in 102 species of neotropical fish and found that species of the same family and subfamily have similar morphology and histochemical content of cortical alveoli. The authors further suggest that these cortical alveoli resemblances do not indicate phylogenetic relationships, although no similarity or parsimony tests were done. Studies using phylogenetic analysis show that the cortical alveoli morphology is an important parameter amongst the Myctophidae, Melamphaidae, Bathylagidae and Platytroctidae families of Myctophiformes fish (Belova, 2008). 28

29 The pellucid zone of the analyzed species reacted positively to the PAS technique, detecting neutral glycoprotein, a commonly content found in pellucid zone of the vertebrates (Bazzoli & Rizzo, 1990; Lubzens et al., 2010). These glycoproteins are responsible for the hardening of external layer of the pellucid zone after the release out of the egg on environment and bactericidal properties (Hart, 1990; Lubzens et al., 2010). Histometric analysis showed that the pellucid zone thickness of vitellogenic oocytes in B. affinis was significantly larger than that of the other species. In teleostean fishes, the thickness of the pellucid zone is directly related to the place of spawning (Riehl, 1996). Sedentary species which cover eggs, as well as those which lay eggs in hostile habitats, have a thick pellucid zone in order to better protect eggs against shocks and to endure the weight of materials deposited over them (Groot & Alderdice, 1985; Riehl, 1996). On the other hand, sedentary species which lay eggs in macrophytes, and close to the surface present a thinner pellucid zone in order to facilitate gas exchange and excretion (Davenport, 1983; Riehl, 1996). Furthermore, Rizzo et al. (2002) observed that sedentary species of Characidae which have free or weakly adhesive eggs have a thin pellucid zone, with no specializations, having only pore-canals on their surface, whilst sedentary species with strongly adhesive eggs possesses specializations in the pellucid zone such as globular projections that contribute to attach eggs to the substrate. The follicular cells of the vitellogenic oocytes of B. affinis are columnar, and statistically largest than the squamous follicular cells of the other species. The columnar shape of the follicular cells in B. affinis may be related to egg adhesiveness when the this cells produce mucosubstances and electron-dense globules which are transferred to the pellucid zone to attach egg on substrate (Andrade et al., 2001; Rizzo et al 2002), similar to results observed in Silurus glanis Linnaeus 1758, where the mucosubstances are stored in electron-dense vesicles, called mucosomes (Abraham et al, 1993). However vitellogenic 29

30 oocytes of A. bimaculatus have squamous follicular cells and their eggs are slightly adhesive (Sato et al., 2003). In this study, the morphologic characteristics of the testes showed a pattern similar to that of the majority of Charciformes whose realize external fertilization, not possessing accessory structures to their gonads ones (Isaac-Jr., 1999; Bazzoli, 2003; Gonçalves et al., 2006). Histologically, spermatogonia were found throughout the testis length, which places them in the unrestricted spermatogonial type (Grier, 1981). This testicular organization allows for potential germinative cell production throughout the testis (Schulz & Miura, 2002). On analyzed species, seminiferous tubules forming anastomosis were observed, which characterize the testes as being of the anastomosing tubular type, plesiomorphic morphology amongst the bonefish (Parenti & Grier, 2004). This morphology has been reported for other Characidae, (Grier et al., 1980; Martins et al., 2010), reinforcing the fact that the testicular morphology is an important parameter in phylogenetic studies (Parenti & Grier, 2004). Despite the fact that the testicular morphology of the analyzed species does not present remarkable differences, acidophilic secretion in the seminiferous tubules lumen of A. bimaculatus and A. fasciatus was found, similar to others Astyanax spp (Carvalho et al., 2009; Costa et al., 2009). The acidophilic secretion in the testes maturing stages of and its resorption in the partially spent males of Astyanax spp may be done by the Sertoli cells, since they present, besides phagocytic activity, a large quantity of synthesis organelles in the cytoplasm (Pudney, 1993). Testicular secretion on fishes has been widely reported in temperate water species (Lahnsteiner, 2003; Chowdhury & Joy, 2007). On the other hand, in tropical fish, secretion in the seminiferous tubules is common in Siluriformes (Singh & Joy, 1998; Santos et al., 2001; Guimarães-Cruz & Santos, 2004; Franceschini-Vicentini et al., 2007) and rare in Characiformes (Isaac-Jr., 1999; Gonçalves et al., 2006). In temperate 30

31 water species, as well as Siluriformes, the testicular secretion is produced by the seminal vesicles or tubules in the caudal region of the testes (Lahnsteiner et al., 1992; Lahnsteiner et al., 1994; Sigh & Joy, 1998; Santos et al., 2001; Lahnsteiner, 2003; Guimarães-Cruz & Santos, 2004; Franceschini-Vicentini et al., 2007). In A. bimaculatus and A. fasciatus, however, the secretion observed in the seminiferous tubules seems to be secreted andr esorpted throughout the testes, due to the fact that it is found in the seminiferous tubules of the cranial, medium and caudal regions. In the testicular secretion of fishes, the presence of monosaccharides, polysaccharides, mucopolysaccharides, enzymes, proteins, lipids and hormones has been reported, doing the following functions across the storage and spermatozoa maturation: maintaining ph of the seminiferous tubules, pheromonal function, lytic activity and a probable role in the egg attach to the substrate (Lahnsteiner et al., 1992; Lahnsteiner et al., 1994; Lahnsteiner, 2003; Chowdhury & Joy, 2007). The glycoproteic acidophilic secretion observed in the seminiferous tubules of Astyanax spp may be related to the energy supply to the spermatozoa, similar to Gonçalves et al. (2006) wich reported it on the Characidae Brycon orthotaenia Günther, The present comparative analysis shows phenotypic resemblances of the gonadal morphology between the assessed species, which probably occurs by a phylogenetic closeness. This study showed that the genera Astyanax, Hemigrammus, Moenkhausia and Triporhteus have similar oocytes characteristics, but differ from Bryconops in relation to the cortical alveoli organization and diameter, follicular cell height and pellucid zone thickness and its number of layers. Rizzo et al. (2002) also observed differences in Bryconops eggs in comparison to Asyanax and Triportheus through an ultrastructural analysis of the egg suface. The phylogenetic analysis of Mirande (2009) also included Astyanax, Bryconops and Triportheus in separated clades of Characidae family. The acidophilic secretion observed in the seminiferous tubules of A. bimaculatus and A. fasciatus was also reported in other 31

32 Characidae genera, such as Salminus (Isaac-Jr, 1999) and Brycon (Gonçalves et al., 2006), which presented different reproductive strategies those ones of Astyanax spp (Godinho et al., 2010). Acknowledgements The authors thank the partnership of CEMIG-GT/CODEVASF and the Brazilian research foundations CNPq, CAPES and FAPEMIG for financial support. References Abraham, M., Hilge, V., Riehl, R. and Iger, Y Muco-follicle cells of the jelly coat in the oocyte of the sheatfish (Silurus glanis L.).- Journal of Morphology 217 (1): Andersen, M. L., D Almeida, V., Ko, G. M., Martins, P. J. F., Magalhães L. E. and Tufik, S Princípios Éticos e Práticos do Uso de Animais de Experimentação, pp. 167, São Paulo, Unifesp. Andrade, R. F., Bazzoli, N., Rizzo, E., & Sato, Y Continuous gametogenesis in the neotropical freshwater teleost, Bryconops affinis (Pisces: Characidae).- Tissue and Cell 35 (5): Arcifa, M. S., Northcote, T. G. and Froelich, O Interactive ecology of two cohabiting characin fishes (Astyanax fasciatus and Astyanax bimaculatus) in eutrophicc brazilian reservoir.- Journal of Tropical Ecology 7 (2): Bazzoli, N. & Rizzo, E A comparative cytological and cytochemical study of the oogenesis in ten Brazilian teleost fish species.- European Archives of Biology 101: Bazzoli, N. & Godinho, H. P Cortical alveoli in oocytes of freshwater neotropical teleost fish.- Bolletino di Zoology 61 (4): Bazzoli, N Parâmetros reprodutivos de peixes de interesse comercial na região de Pirapora In.: Godinho, H. P & Godinho, A. L. Águas, peixes e pescadores do São Francisco das Minas Gerais. pp , Belo Horizonte, Editora PUC Minas. Belova, G. V Oocyte morphology of several mesopelagic fishes in connection with their taxonomic status and habitat conditions.- Russian Journal of Marine Biology 34 (2): Blount, J. D. & Houston, D. C Why egg yolk is yellow.- Tree 15: Carvalho, P. A., Paschoalini, A. L., Santos, G. B., Rizzo, E. and Bazzoli, N Reproductive Biology of Astyanax fasciatus (Pisces: Characiformes) in a reservoir in southeastern Brazil.- Journal of Applied Ichthyology 25: Casali, R. C. V., Vono, V., Godinho, H. P., Luz, R. K. and Bazzoli, N Passage and reproductive activity of fishes in the Igarapava fish ladder, Grande River, southeastern Brazil.- River Research and Applications 26:

33 Chowdhury, I. & Joy, K. P Seminal vesicle and its role in the reproduction of teleosts.- Fish Physiology and Biochemistry 33 (4): Costa, F. G., Adolfi, M. C., Andrade, C. G. T. J. and Borella, M. I Changes of the testis of Astyanax altiparanae during the reproductive cycle. A structural and ultrastructural study.- Proceedings of XXII Congress of Brazilian Society of Microscopy and Microanalysis: B Davenport, J Oxygen and the developing eggs and larvae of the lumpfish, Cyclopterus lumpus L. Journal of Marine Biology 63: Fishelson, L. & Gon, O Comparative oogenesis in cardinal fishes (Apogonidae, Perciformes), with special focus on the adaptative structures of the egg envelopes.- Environmental Biology of Fishes 81 (4): Franceschini-Vicentini, I. B., Papa, L. P., Bombonato, M. T. S., Vicentini, C. A., Ribeiro, K. and Orsi, A. M A histological study of the seminal vesicle of the armoures catfish Corydoras aeneus.- Anatomia, Histologia, Embryologia 36: Géry, J Characoids of the world. pp. 672, Neptune City, T.F.H Publications Inc. Ltda. Gonçalves, T. L., Bazzoli, N. and Brito, M. F. G Gametogenesis and reproduction of the matrinxã Brycon orthotaenia (Günther, 1864) (Pisces: Characidae) in the São Francisco River, Minas Gerais, Brazil.- Brazilian Journal of Biology 66 (2A): Grier, H. J., Linton, J. R., Leatherland, J. F. & devlaming, V. L Structural evidence for two difference testicular types in teleost fishes.- American Journal of Anatomy 159: Grier, H. J Cellular organization of the testis and spermatogenesis in fishes. - American Zoologist 21 (2): Groot, E. P. & Alderice, D. F Fine structure of the external egg membrane of five species of pacific salmon and steelhead trout.- Canadian Journal of Zoology 63: Godinho, A. L., Lamas, I. R., and Godinho, H. P Reproductive ecology of Brazilian freshwater fishes.- Environmental Biology of Fishes 87: Goodwin, T. W Metabolism, nutrition and function of carotenoids.- Annual Review of Nutrition 6: Guimarães-Cruz, R. J. & Santos, J. E Testicular structure of three species of neotropical freshwater pimelodids (Pisces: Pimelodidae).- Revista Brasileira de Zoologia 21 (2): Hart, N. H Fertilization in teleost fishes: mechanism of sperm egg interactions. - International Review of Cytology 121: Honorato-Sampaio, K., Santos, G. B., Bazzoli, N. and Rizzo, E Observations on the seasonal breeding biology and the fine structure of the egg surface in the white piranha 33

34 Serrasalmus Brandtii from the São Francisco River basin, Brazil.- Journal of Fish Biology 75: Isaac-Jr., J. B Gametogênese e ciclo reprodutivo do dourado, Salminus brasiliensis (Cuvier, 1817), do rio São Francisco, Minas Gerais. Msc., Dissertation pp. 89, Graduate Program in Vertebrate Zoology from PUC Minas, Brazil. Lahnsteiner, F., Seiwal, M., Patzner, R. A. and Ferrero, E. A The seminal vesicles of the male grass goby, Zosterisessor ophiocephalus (Teleostei, Gobidae).- Zoomorphology 111: Lahnsteiner, F., Patzner, R. A. and Weissman, T The testicular main duct and spermatic ducts in cyprinid fishes. I. Morphology, fine structure and histochemistry.- Journal of Fish Biology 44: Lahnsteiner, F Morphology, fine structure, biochemistry, and function of spermatic ducts in marine fishes.- Tissue and Cell 35 (5): Lima, F. C. T., Malabarba, L. R., Buckup, P. A., Pezzi da Silva, J. F., Vari, R., Harold, P. A., Benine, R., Oyakawa, O. T., Pavanelli, C. S., Menezes, N. A., Lucena, C. A. S., Malabarba, M. C. S. L., Lucena, Z. M. S., Reis, R. E., Langeani, F. L. Cassati, L., and Bertaco, V. A Genera Incertae Sedis in Characidae. In: R.E. Reis, S.O. Kullander and C.J. Ferraris, Jr. (eds.). Checklist of the Freshwater Fishes of South and Central America p , Porto Alegre, EDIPUCRS. Lubzens, E., Lissauer, L., Leavavi-Sivan, B., Avarre, J. C. and Sammar, M Carotenoid and retinoid transport to fish oocytes and eggs: What is the role of retinol binding protein?- Molecular Aspects of Medicine 24 (6): Lubzens, E., Young, G., Bobe, J. & Cerdà, J Oogenesis in teleosts: how fish eggs are formed.- General Comparative Endocrinology 165: Martins, Y. S., Moura, D. F., Santos, G. B., Rizzo, E. & Bazzoli, N Comparative folliculogenesis and spermatogenesis of four teleost fish from a reservoir in south-eastern Brazil.- Acta Zoologica in press. Mirande, J. M Weighted parsimony phylogeny of the family Characidae (Teleostei: Characidormes).- Cladistics 25: Nelson, J. S Fishes of the World. pp. 624, New York, John Wiley & Sons. Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R. and França, L. R An overview of functional and stereological evaluation of spermatogenesis and germ cell transplantation in fish. - Fish Physiology and Biochemestry 35: Normando, F. T., Arantes, F. P., Luz, R. K., Thomé, R. G., Rizzo, E., Sato, Y and Bazzoli, N Reproduction and fecundity of tucunaré, Cichla kelberi (Perciformes: Cichlidae), an exotic species in Três Marias reservoir, south eastern Brazil.- Journal of Applied Ichthyology 25:

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37 Table 1: Biometrics of six species from Incertae Sedis genera in Characidae of the São Francisco River Basin, Brazil. Species n TL (cm) BW (g) male female male female male female A. bimaculatus ± ± ± ±5.6 A. fasciatus ± ± ± ±6.3 B. affinis ± ± ± ±4.1 H. marginatus ± ± ± ±0.3 M. costae ± ± ± ±0.6 T. guenteri ± ± ± ±6.3 TL= total lenght; BW= body weight; n=number of collected individuals. 37

38 Table 2: Vitellogenic oocyte morphology of six species from Incertae Sedis genera in Characidae of the São Francisco River, Brazil. Cortical alveloli Pellucid zone Yolk Follicular Number Species colour shape organization shape cells height of layers A. bimaculatus yellowish small discontinuous folded 2 squamous A. fasciatus grayish small discontinuous folded 2 squamous B. affinis yellowish large continuous continuous 1 columnar H. marginatus yellowish small discontinuous folded 2 squamous M. costae yellowish small discontinuous folded 2 squamous T. guenteri yellowish small discontinuous continuous 2 squamous 38

39 Table 3: Vitellogenic oocyte histometry (µm) of six species from Incertae Sedis genera in Characidae of the São Francisco River Basin, Brazil. Structure Cortical alveoli Zona pellucida Follicular cells Diameter Species diameter thickness height A. bimaculatus ± ª 7.66±2.86 a, b 4.63± 1.06 a 1.95± 0.65 a A. fasciatus ± a, c 8.28±2.02 b 5.79±1.90 a 2.12±0.78 a B. affinis ± b 12.87±2.41 c 10.57± 2.08 b 28.19± b H. marginatus ± c 6.50± 1.98 a, d 2.44± 0.90 c 1.52± 0.64 a M. costae ± 64.40ª 6.57±2.08 a, d 2.54± 0.75 c 1.65± 0.70 a T. guenteri ± b 5.20± 1.44 d 5.43±0.94 a 1.57± 0.65 a Different superscript letters indicate statistically significant differences (P < 0.05). 39

40 Figure 1: Ovaries of genera Incertae Sedis in Characidae: Mature ovaries of T. guenteri (A) and A. fasciatus (B) with yellowish and grayish coloured vitellogenic oocytes. Detail of the vitellogenic oocytes of A. bimaculatus (C) and B. affinis (D). Hematoxylin-eosin. F= pellucid zone folds; FC= follicular cells, YG= yolk globules, ZP= pellucid zone. 40

41 Figure 2: Testes of genera Incertae Sedis in Characidae: Mature testes of M. costae (A). Anastomosing tubular testicle of H. marginatus (B). Acidophilic secretion in the testis of A. bimaculatus (C and D). Resorption of acidophilic secretion in the testis of A. fasciatus (E and F). *= anastomosis between seminiferous tubules, arrows = glycoproteic acidophilic secretion in the seminiferous tubules lumen, arrowheads= resorption vesicles, S= Sertoli cell. 41