II ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS LIPOLÍTICAS EM SISTEMA DE PRÉ-TRATAMENTO DE ESGOTO DOMÉSTICO

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1 II ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS LIPOLÍTICAS EM SISTEMA DE PRÉ-TRATAMENTO DE ESGOTO DOMÉSTICO Simone Semionato Bióloga graduada pela Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) em 2002 Mestranda do Programa de Pós-graduação em Engenharia Ambiental da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) Pesquisadora LABSAN-DEA-CT-UFES. Aline Carvalho da Cunha Estudante de Graduação de Engenharia Ambiental pela Universidade Federal do Espírito Santo. Pesquisadora de Iniciação Cientifica bolsista (IC-CNPq) do LABSAN-DEA-CT-UFES do Programa de Engenharia Ambiental da UFES. Márcia Cristina Martins Campos Cardoso Química graduada pela Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE) em 2004 Pesquisadora voluntária do LABSAN-DEA-CT-UFES - Programa de Engenharia Ambiental da UFES. Ricardo Franci Gonçalves Engenheiro Civil e Sanitarista UERJ (1984), Pós-graduado em Eng. de Saúde Pública - ENSP/RJ (1985), DEA - Ciências do Meio Ambiente - Univ. Paris XII, ENGREF, ENPC, Paris (1990), Doutor em Engenharia do Tratamento e Depuração de Água INSA de Toulouse, França (1993), Prof. Adjunto do DHS e do PMEA - UFES. Sérvio Túlio Alves Cassini (1) Biólogo pela Universidade Federal de Minas Gerais (1975). PhD Microbiologia pela Universidade Estadual da Carolina do Norte (NCSU) EUA Pós-Doutorado em Microbiologia Ambiental na Universidade do Tennessee EUA Prof. Adjunto do DHS e do PMEA - UFES. Endereço (1) : Departamento de Engenharia Ambiental Universidade Federal do Espírito Santo Av. Fernando Ferrari, s/n Goiabeiras Vitória ES Brasil - CEP.: Telefax.: (027) / Tel: (027) scassini@npd.ufes.br RESUMO A presença de óleos e graxas em grandes quantidades no esgoto sanitário provoca vários problemas tanto na rede coletora, quanto no tratamento. Estes compostos promovem uma intensa agregação de sólidos ou partículas em suspensão, gerando o entupimento de redes, dutos e reservatórios do sistema de tratamento de esgotos, mau cheiro, transbordamento de fossas e caixas de gordura. Para evitar esse problema, microrganismos lipolíticos (potencialmente degradadora de óleos e graxas) têm sido utilizados em sistemas de pré-tratamento de esgoto sanitário para degradar a gordura existente nestes sistemas, tornando-os mais eficientes, e conseqüentemente, reduzindo os custos de manutenção. A degradação acelerada dos microorganismos lipolíticos traz a máxima relação custo / benefício em sistemas de tratamento de esgoto, principalmente, em caixas de gordura residenciais e comerciais. Sendo assim, o presente trabalho vem relatar o estudo de bactérias lipolíticas existente no dispositivo de remoção de materiais gordurosos da ETE-UFES, isolando, caracterizando e avaliando o potencial lipolítico visando a sua utilização em sistemas de pré-tratamento de esgotos domésticos, afim de, reduzir a carga orgânica e a quantidade de óleos e graxas, facilitando dessa maneira, a tratabilidade dos efluentes e diminuindo seus impactos negativos. Os estudos realizados resultaram o isolamento de 11 cepas de bactérias lipolíticas sendo duas com considerável potencial de degradação de óleos e graxas de escuma de esgoto doméstico. PALAVRAS-CHAVE: Esgoto doméstico, bactérias lipolíticas, caixa de gordura, óleos e graxas. INTRODUÇÃO A presença de óleos e graxas em grandes quantidades no esgoto sanitário provoca vários problemas tanto na rede coletora, quanto no tratamento. Estes compostos promovem uma intensa agregação de sólidos ou partículas em suspensão, gerando o entupimento de redes, dutos e reservatórios do sistema de tratamento de esgoto, mau cheiro, transbordamento de fossas e caixas de gordura. ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 1

2 Nos sistemas de pré-tratamento de esgotos (ETE s) utilizam-se, principalmente, caixas de gordura que atuam como dispositivos de retenção de partículas de materiais gordurosos para posterior remoção destas com intuito de evitar a sua entrada na rede coletora. Essas caixas são instaladas na parte externa de residências, restaurantes, e etc, interligando a tubulação do esgoto da cozinha à rede pública ou a um sistema de tratamento. Para reduzir a quantidade de gordura nos sistemas de pré-tratamento, microrganismos lipolíticos, ou seja, degradadores de óleo e gordura estão sendo utilizados. Podem ser fungos e ou bactérias produtoras e secretoras de enzimas extracelulares de lipases - triacilglicerol acilhidrolase, ou seja, enzimas proteícas que hidrolisam triglicéridos, que são os principais compostos de óleo e graxa (gordura) (Wakelin & Forster, 1997). A degradação acelerada desses microorganismos lipolíticos traz a máxima relação custo/benefício em sistemas da rede de esgoto, em estações de tratamento de esgoto, e principalmente, em caixas de gordura residenciais e comerciais, tornando-os mais eficientes, e conseqüentemente, reduzindo os custos de manutenção e o impacto negativo ao meio ambiente. OBJETIVO A pesquisa proposta tem como objetivo o isolamento e a caracterização de bactérias produtoras de lipase com potencial de hidrólise (degradação) de óleos e graxas visando a sua utilização em sistemas de pré-tratamento de esgotos domésticos. MATERIAIS E MÉTODOS A pesquisa foi realizada com amostras proveniente da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) instalada na Universidade Federal do Espirito Santo (UFES) tratando esgoto de origem doméstica proveniente do bairro de Jardim da Penha, no município de Vitória/ES. Operando a uma vazão média de 1,0 L/s. Esta ETE-UFES é composta por uma elevatória, um reator anaeróbio de fluxo ascendente (UASB), três biofiltros aerados submersos (BF s) operando no tratamento secundário e um filtro terciário. O sistema de pré-tratamento, dispositivo de retenção de sólidos gordurosos, está instalado anteriormente a elevatória da ETE-UFES, consiste de uma câmara modelada de forma que o efluente permaneça por tempo o suficiente para que aja a flotação da matéria gordurosa (escuma). O princípio do funcionamento deste dispositivo é semelhante ao de caixas de gordura convencionais encontrados em residências e condomínios (figura 1). Figura 1: Figura ilustrativa do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos. As principais características do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos utilizado nesta pesquisa encontra-se descrita na tabela 1. Características Dispositivo de retenção de sólidos gordurosos Vazão 0,5 L/s Tempo de Detenção 18,7 min Comprimento 115 cm Largura 75 cm Altura 65 cm Tabela 1: Dimensão do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos instalado anterior a ETE-UFES. ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 2

3 ANÁLISE DE ESGOTO BRUTO, EFLUENTE E ESCUMA DA ETE-UFES As amostras simples do material gorduroso flotado (escuma), esgoto bruto e o efluente do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES foram coletadas semanalmente, por um período de sete meses, e avaliados os parâmetros físico-químicos (APHA, 1995): Demanda Química de Oxigênio total (DQOt), Sólidos Totais Fixos (STF), Sólidos Totais Voláteis (STV), ph, temperatura e Óleos e Graxas. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIA LIPOLÍTICA Amostras da escuma proveniente do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES foram coletadas e inoculadas em meio mínimo líquido com fungicida, adicionado de óleo de soja (5% v/v) como fonte de carbono a uma temperatura de 30 C sob rotação de 120 rpm por um período de 120 horas. Após esta fase de enriquecimento, alíquotas de 10 μl de bactérias crescidas neste meio mínimo líquido foram inoculadas em meio mínimo sólido contendo fungicida, emulsão de óleo de soja (5%) e Triton X-100 (1%). Após o período de 96 horas em estufa a 30 ºC, colônias que apresentaram crescimento visível foram novamente isoladas e submetidas a avaliação preliminar da atividade lipolítica utilizando o método de Rodamina B. Este método de Rodamina B (Haba et al., 2000) constata bactérias lipolíticas através da presença de uma enzima extracelular: lipase. A colônias de bactérias isoladas da fase anterior foram inoculadas em meio mínimo sólido contendo fungicida, emulsão e indicador Rodamina B (10mg/mL) a 30 C por 48 horas. Após este período, as colônias de bactérias foram submetidas à luz U.V. (350 nm) e as que apresentaram coloração laranja-fluorescente do halo formado ao redor das colônias foram certificadas de bactérias lipolíticas, ou seja, houve a produção de lipase extracelular que degrada lipídeo. As colônias de bactérias que apresentaram resultado positivo para o indicador Rodamina B foram caracterizadas quanto ao gram (Silva, 1999) e submetidas a avaliação lipolítica através do método espectrofotométrico (Winkler & Stuckmann, 1978). O princípio deste método, tem como base, a ação da enzima lipase que hidrolisa o p-nitrofenil palmitato (p- NPP) em ph 8.0, liberando o nitrofenil que gera uma coloração amarela e sendo quantificada a 410 nm de absorção pelo espectrofotômetro. Uma unidade de atividade lipolítica é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 µm de p-npp por minuto de reação em 1mL de enzima. A quantidade de proteína foi determinada de cada cepa de bactéria lipolítica e relacionada com o resultado de atividade lipolítica afim de quantificar a enzima proteíca lipase produzida por estas bactérias. Para a determinação da quantidade de proteína foi usado o método de Lowry (1951), tendo como padrão albumina de soro bovino. RESULTADOS Os resultados expressados em média por um período de sete meses de análise do monitoramento dos parâmetros fisico-químicos do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos estão reunidos na tabela 2. PARÂMETROS AMOSTRAS Esgoto Bruto Escuma Efluente ST (g/l) 485,87 118,00 452,93 STV (g/l) 302,92 100,35 286,09 DQO * 353,19 147,62 308,95 O&G ** 66,06 182,20 53,97 Temperatura ºC 29,70 28,01 29,71 ph 6,85 5,71 6,92 * unidades em mg/l para esgoto bruto e efluente e em g/l para escuma ** unidades em mg/l para esgoto bruto e efluente e em mg/g para escuma Tabela 2: Tabela do monitoramento dos parâmetros físico-químicos, expressados em média, do esgoto bruto, efluente e escuma do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES. ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 3

4 Os resultados de óleos e graxas do esgoto bruto e do efluente de esgoto doméstico da ETE-UFES foram de 66,06 e 53,97 mg/l, respectivamente, e estão em concordância com os resultados encontrados na literatura que situa-se na de faixa de 55 a 170 mg/l (Arceivala, 1981; Pessoa & Jordão, 1982; Qasim, 1985 e Von Sperling, 1996). O esgoto doméstico avaliado encontra-se dentro dos padrões médios de parâmetros físico-químicos de DQO, ph, Temperatura, ST, STV (Metcalf & Eddy, 1991). Cepas de bactérias foram isoladas a partir da escuma do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES e certificadas quanto à produção de lipase. Em seguida, caracterizadas e quantificadas a atividade lipolítica, ou seja, capacidade de degradação de lipídeo. Dentre as cepas de bactérias isoladas, onze são bactérias lipolíticas. Das quais, cepas de número 9,10 e 11 são gram positivo e as cepas 1,2,4,5,6,7,12 e 13 são negativos. Os resultados da atividade lipolítica das cepas de bactérias lipolíticas estão ilustrados no figura 2. 0,040 Atividade Lipolítica (U/mL) 0,030 0,020 0,010 0, CEPAS Figura 2: Avaliação lipolítica de 11 cepas de bactérias lipolíticas proveniente do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES. A faixa de variação dos valores de atividade lipolítica das cepas de bactérias lipolíticas foi de 0,20 a 0,38 U/mL. Os maiores valores de atividade lipolítica foram das cepas 1 e 10, com valores de 0,38 U/mL e 0,34 U/mL, respectivamente. A unidade de atividade lipolítica é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 µm de p-npp por minuto de reação em 1mL de enzima. Essas cepas possuem atividade lipolítica de valor aproximado ao de bactérias utilizadas para degradar óleo de soja, como Pseudomonas aeruginosa e Aeromonas sobria LP004, de 0,38 e 0,31 U/mL, respectivamente (Bogo, 2003 e Dharmsthiti & Lotrakul, 1997). CONCLUSÃO Os resultados dos parâmetros físico-químicos referentes ao esgoto bruto ao efluente do esgoto doméstico da ETE-UFES encontram-se dentro dos padrões médios da literatura pertinente. Através de amostras da escuma do dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES foram isoladas 11 bactérias lipolíticas. Os testes de avaliação da atividade lipolítica com o substrato n-npp realizados nas 11 cepas de bactérias lipolíticas encontram-se na faixa de 0,20 a 0,38 U/mL. E destas cepas avaliadas, duas (cepas 1 e 10) obtiveram resultado compatível com a literatura, isso demonstra que o dispositivo de retenção de sólidos gordurosos da ETE-UFES é uma potencial fonte de bactérias lipolíticas. A presente pesquisa relata a possibilidade de utilizar a eficiência de degradação de lipideos dessas bactérias lipolíticas inserindo-as em sistemas de pré-tratamento, como dispositivo de retenção de sólidos gordurosos e caixas de gordura visando reduzir a carga orgânica e quantidade de óleos e graxas das mesmas, facilitando dessa maneira, a tratabilidade dos efluentes e diminuindo seus impactos negativos. ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 4

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. APHA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th Edition. American Public Health Association, New York APHA. Standard methods for the examination of water and wastewater, 19th Edition, American Public Health Association, Washington, D. C., BOGO, E. Análise de atividade lipolítica de uma nova lipase de Xylella fastidiosa visando utilização industrial F. Dissertação (mestrado) Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, DHARMSTHITI, S. & LOTRAKUL, P., Lipase production by Aeromonas sobria LP 004 in a medium containing whey and soybean meal. World Jornal of Mocrobiology & Biotechnology. Vol 13, p, HABA, E., BRESCO, O., FERRER, C., MARQUES, A., BUSQUETS, M., MANRESA, A. Isolation of lipase-screening bacteria by deploying used frying oil as selective substrate. Enzyme and microbial technology, 26, 40 44p LOWRY O.H., ROSEBROUGH N.J., FARR A.L., RONDALL R.J., Protein measurement with the polyphenol reagent, J. Biol. Chem, 193, , METCALF & EDDY. Inc. Wastewater Engineering. Treatment, Disposal and Reuse. Metcalf & Eddy. 3. ed. Ed. McGraw-Hill, 1334p MONGOGKOLTHANARUK W.; DHARMSTHITI S. Biodegradation of Lipid-rich Waster by a Mixed bacterial Consortium. International Biodeterioration & Biodegradation. 50, p PESSOA, C. A. & JORDÃO, E. P. Tratamento de esgotos domésticos.2. ed. Rio de Janeiro, ABES QASIM, P. R.; NETO, J.A.;NETTO, M. J. Curvas de custo de estações de tratamento de esgotos para estimativas de investimento. In: Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental, 17, Natal p SILVA, C. H. P. M. Bacteriologia: um texto ilustrado. ED. Eventos. Teresópolis, RJ. 531 p SUGIMORI, D.; NAKAMURA, M.; MIHARA Y. Microbial Degradation by Acinetobacter sp. Straain SOD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66 (7), p, VON SPERLING, M. Introdução à qualidade das águas e ao tratamento de esgotos. 2. ed. Belo Horizonte: Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental, Universidade Federal de Minas Gerais, WAKELIN N. G.; FORSTER C. F. An Investigation Into Microbial Removal of Fats, Oils and Greases. Bioresource Technology. 59, 37-43p WINKLER, U. K. & STUCKMANN, M., Glicogen, Hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens. Journal of Bacteriology, vol.138, n 3, p , ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 5