Relatório Final. Título do projeto: Uso de hidrotermoterapia no tratamento de bulbos de lírio visando ao controle de nematóides

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1 Relatório Final Título do projeto: Uso de hidrotermoterapia no tratamento de bulbos de lírio visando ao controle de nematóides Interessado/financiador: Associação Brasileira do Comércio de Sementes e Mudas (ABCSEM) CNPJ: / Avenida Papa Pio XII nº sala 22, Jardim Chapadão, CEP , Campinas, SP abcsem@abcsem.com.br A/C Engª Agrª Mariana Ceratti Fone: (19) Responsável: Claudio Marcelo Gonçalves de Oliveira Pesquisador Científico V, Nematologista Laboratório de Nematologia, Centro Experimental do Instituto Biológico Campinas, SP Maio de

2 INTRODUÇÃO GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO No Brasil, o mercado de flores e plantas ornamentais encontra-se em expansão, movimentando em torno de 800 milhões de dólares/ano e estimulando produtores a investir nessa área (JUNQUEIRA & PEETZ, 2005). São Paulo é o principal estado produtor, respondendo por aproximadamente 70% da produção nacional, seguido de Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Minas Gerais (IBRAFLOR, 2001; JUNQUEIRA & PEETZ, 2002). No entanto, há fatores relacionados aos aspectos sanitários que limitam o seu cultivo, com destaque ao ataque, por vezes severo, de nematóides. Os nematóides associados às plantas ornamentais parasitam principalmente os órgãos subterrâneos (raízes, rizomas, tubérculos e bulbos), mas também a parte aérea (caules e folhas). As perdas causadas são de dois tipos: redução de produção e depreciação da qualidade do produto a ser comercializado. No Brasil, mais de 20 gêneros de fitonematóides foram detectados em associação a plantas ornamentais (OLIVEIRA, 2001; OLIVEIRA, 2006; OLIVEIRA & KUBO, 2006; OLIVEIRA et al., 2007). De forma geral, as espécies pertencentes aos gêneros Meloidogyne, Pratylenchus, Radopholus e Aphelenchoides são consideradas as principais no Brasil devido à freqüência com que ocorrem e à intensidade das perdas causadas (OLIVEIRA et al., 2007). Porém, o conhecimento disponível na literatura sobre a ocorrência e medidas de controle de nematóides em plantas ornamentais é ainda limitado. Com relação à cultura do lírio, Adekunle et al (2006) relataram que os seguintes nematóides fitoparasitas e vetores de viroses estavam associados a híbridos Lírios Asiáticos e Orientais na Índia: Aphelenchoides avenae, Criconemoides spp., Hoplolaimus spp., Longidorus spp., Paratylenchus spp., Pratylenchus spp., Trichodorus spp., Tylenchoryhnchus spp., Tylenchulus spp. e Xiphinema diversicaudatum. Recentemente, Oliveira et al. (2007), durante 2

3 levantamento de nematóides em plantas ornamentais, reportaram a nova ocorrência dos nematóides Pratylenchus brachyurus e Helicotylenchus dihystera em diversas cultivares de lírios no Brasil, mas, segundo os autores, futuros experimentos deverão ser realizados para comprovar a patogenicidade e os danos causados por esses nematóides. Por outro lado, as perdas causadas por nematóides de parte aérea (Aphelenchoides fragariae) e das lesões radiculares (Pratylenchus penetrans) em lírio são bem conhecidas (Siddiqi, 1975; Mass, 1978; Westerdahl et al., 1993; 1998). Ademais, cabe ressaltar que bulbos de lírios podem disseminar nematóides, constituindo em fator limitante para sua comercialização devido às restrições nas legislações fitossanitárias. OBJETIVOS: Os objetivos do presente projeto foram: a) realizar a diagnose precisa dos nematóides presentes nas raízes e bulbos de lírio, através da extração de DNA genômico, amplificação e sequenciamento do terço final da região 18S rdna e região D2/D3 rdna e comparação com informações disponíveis no GenBank. b) estudar a eficiência do uso de hidrotermoterapia (banho de água aquecida) comparada ao tratamento com nematicidas no controle de nematóides presentes em raízes e bulbos de lírio, com ênfase aos gêneros Aphelenchoides e Pratylenchus, em condições controladas.. 3

4 MATERIAL E MÉTODOS Identificação das espécies de nematóides através do uso de biologia molecular Extração do DNA Para a extração do DNA genômico foi utilizado o método da Proteinase-K (WLB: Worm Lysis Buffer), segundo Williams et al. (1994). Separadamente, um único indivíduo do gênero Pratylenchus e 10 indivíduos do gênero Aphelenchoides, extraídos das raízes e bulbos de lírio, respectivamente, foram selecionados, seccionados em 3 partes (com auxílio de uma agulha) em uma gota de 15 µl de lysis buffer e colocados em um tubo de microcentrífuga, sendo incubado a -20 ºC por 15 min. Posteriormente, o tubo foi incubado a 60 ºC por 1 hora, 95 ºC por 15 min e resfriado a 4 ºC. Amplificação da região D2/D3 rdna de Pratylenchus sp. Reação de PCR. Foi utilizado um kit de PCR tipo "puretaq" Read-To-Go Bead (Amersham Pharmacia Biotech). Em um tubo tipo Eppendorff de 0,5 ml foi adicionada uma esfera do kit de PCR, que contém os reagentes necessários para a reação (2,5 U puretaq, 200 µm de cada dntp, 10 µm Tris-HCl, 50 µm KCl e 1,5 mm MgCl 2 ), dissolvida em 17,5 µl de água mili-q. Em seguida, foi adicionado 5 µl de DNA genômico, 1µl de cada par de primers (D2A e D2B ), num volume final de 25 µl de reação. Esta mistura foi levada ao termociclador, pré-aquecido a 94 o C. As condições de amplificação utilizadas encontram-se em Williams et al. (1994). Após a amplificação do DNA, 5 µl do produto da PCR foi utilizado para eletroforese em tampão 1X TAE em gel de agarose a 0,8% com 0,003% de brometo de etídio (0,02 µg/ml). O resultado da amplificação foi comparado 4

5 com o marcador molecular 100 Base-Pair Ladder (Amershan). O gel foi visualizado num transiluminador de luz UV e fotografado. Amplificação do terço final da região 18S rdna de Aphelenchoides sp. Para a reação de PCR foi utilizado o kit de PCR tipo "puretaq" Read-To-Go Bead (Amersham Pharmacia Biotech). Em um tubo tipo Eppendorff de 0,5 ml foi adicionada uma esfera do kit de PCR dissolvida em 22,5 µl de água mili-q. Em seguida, foi adicionado 0,5 µl de DNA genômico, 1µl de cada par de primers (F02 e R81), num volume final de 25 µl de reação. Esta mistura foi levada ao termociclador, pré-aquecido a 94 o C. As condições de amplificação utilizadas encontram-se em Oliveira (2004). Seqüenciamento do DNA. Os seqüenciamentos realizados no presente trabalho foram feitos no Laboratório de Bioquímica Fitopatológica do Instituto Biológico, SP, sob a supervisão do Dr. Ricardo Harakava. O seqüenciamento direto dos fragmentos amplificados das regiões D2/D3 e terço final da região 18S rdna foi feito por meio de PCR utilizando o kit Big Dye Terminator (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA). Os fragmentos foram purificados por meio do kit Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega). Para cada reação, foi preparada uma mistura contendo 2 µl de TRR mix (terminator ready reaction mix), 3,2 µmol do primer para o sentido anverso ou para o sentido reverso, 3,0 µl do produto previamente amplificado contendo aproximadamente 400 ng de DNA e 2,0 µl de água. A amplificação para seqüenciamento foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (PE Applied Biosystems, Norwalk, CT, EUA). Foi feita nova purificação do produto amplificado por precipitação com isopropanol em microtubos. Após a desnaturação das amostras a 95 ºC por 3 min., foi realizada eletroforese em aparelho ABI Prism 377 DNA SequencerÔ (PE Applied Biosystem, Norwalk, CT, EUA). 5

6 Eficiência do uso de hidrotermoterapia (banho de água aquecida) comparada ao tratamento com nematicidas no controle de nematóides presentes em raízes e bulbos de lírio Local: O experimento foi realizado no período de Novembro de 2007 a Fevereiro de 2008, em casa de vegetação, no município de Holambra, SP. Delineamento experimental: inteiramente ao acaso, com 7 tratamentos e 4 repetições. Parcelas constituídas de 200 bulbos de lírio oriental para cultivo em vaso, naturalmente infestados por nematóides (principalmente dos gêneros Aphelenchoides e Pratylenchus). Tabela 1 - Tratamentos Tratamentos Temperatura/tempo 1. Testemunha - 2. tratamento hidrotérmico 39ºC por 2 horas 3. tratamento hidrotérmico + formalina 0,3% 39ºC por 2 horas 4. tratamento com formalina 1% temperatura ambiente 5. tratamento hidrotérmico 42ºC por 2 horas 6. tratamento com nematicida Carbofuram 350 Dose 400 ml PC/100L de SC água (imersão dos bulbos, durante 15 minutos na calda do nematicida) 7. tratamento com nematicida Abamectina 10 ml de AVICTA / L de (Avicta 500 FS) água (AVICTA: 500 g de abamectina/l) imersão dos bulbos por 15 min em solução nematicida 6

7 Figura 1 - Equipamento piloto, semelhante a banho maria com controle de temperatura, utilizado no tratamento hidrotérmico dos bulbos de lírio. 7

8 Tratamento hidrotérmico Para o tratamento hidrotérmico dos bulbos de lírio, utilizou-se equipamento semelhante a banho maria com controle de temperatura (Figura 1), constituído por uma caixa de cimento amianto com capacidade de 1000 L, equipada com resistência trifásica. A temperatura foi controlada com termostato conectado a um sensor e interligado a computador para monitoramento das variações de temperatura. Assim, isoladamente, cada parcela composta de 200 bulbos de lírio oriental, foi imersa nesse sistema piloto de banho maria, de acordo com o delineamento experimental proposto (Tabela 1). Tratamento com nematicidas Para o tratamento com os nematicidas Carbofuran ou Abamectina, 800 bulbos foram imersos durante 15 minutos na calda do nematicida, acordo com o delineamento experimental proposto (Tabela 1) Variáveis Foram estimadas as densidades populacionais dos nematóides presentes nas raízes, nos bulbos e folhas de lírio (20 g/parcela) 60 dias após os tratamentos. 8

9 Os nematóides presentes nas raízes, bulbos e folhas foram extraídos pelo método de COOLEN & D HERDE (1972), sendo os espécimes obtidos mortos pelo calor, fixados e conservados em formalina 2%. A estimativa populacional de cada gênero foi obtida através da contagem em lâminas de Peters utilizando-se microscópio óptico. Foram feitas duas contagens, obtendo-se o número dos espécimes em 1 ml da amostra total. Para a obtenção da estimativa populacional total em cada gênero, os valores médios por ml foram multiplicados por 10. Além disso, foi verificada mensalmente a influência dos tratamentos na germinação e desenvolvimento das plantas cultivadas em vaso, em casade-vegetação, inclusive com a observação de possíveis sintomas causados por nematóides na parte aérea. 9

10 RESULTADOS GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO Identificação das espécies de nematóides através do uso de biologia molecular As seqüências obtidas foram alinhadas e comparadas com auxílio do software BioEdit Sequence Alignment Editor com a finalidade de identificar polimorfismo nas seqüências nucleotídicas. A seqüência consenso da população de Pratylenchus sp. (proveniente de um nematóide extraído das raízes de lírio) e de Aphelenchoides sp. (proveniente de 10 nematóides extraídos das folhas de lírio) foram comparadas às seqüências de outras espécies de nematóides depositadas no banco de dados (GenBank, para a identificação de homologia. Baseando-se nessa comparação (Anexo 1), concluiu-se que o nematóide da amostra de raiz trata-se de Pratylenchus crenatus (Tabela 2), uma vez que apresentou alto grau de homologia (96%) com uma população dessa espécie. Trata-se de nematóide quarentenário, considerado praga A1 no Brasil. Essa espécie encontra-se amplamente distribuída em diversos países europeus. Na Holanda, por exemplo, já foi detectada em cultivos de batata (Castillo & Vovlas, 2007). Nos Estados Unidos também ocorre parasitando batata nos estados de Maine, New York e Ohio (Castillo & Vovlas, 2007); além disso, há relato de que P. crenatus ocorre na Califórnia associado a lírio 10

11 (Lilium longiflorum var. eximium) (Norton et al. 1984, citado por Merrifield, 2000). Com relação à diagnose do nematóide foliar, através da comparação das seqüências (Anexo 2), concluiu-se que o nematóide da amostra de folha é Aphelenchoides fragariae (Tabela 2), uma vez que apresentou alto grau de homologia (99%) com uma população dessa espécie. Aphelenchoides fragariae já foi relatada associada à plantas ornamentais no Brasil parasitando Asplenium nidus e Dyzygotheca castor variegata (Oliveira, 2001). Siddiqi (1975) destaca que essa espécie está distribuída tanto em países de clima temperado como tropical, sendo que mais de 250 plantas em 47 famílias botânicas são relatadas como hospedeiras desse nematóide, inclusive plantas de lírio cultivadas na Holanda, Dinamarca e Estados Unidos. Tabela 2 - Identificação de nematóides através do uso de biologia molecular (PCR e sequenciamento da região D2 D3 do DNA ribossomal). Amostra Raízes de lírio Folhas de lírio Espécie identificada Pratylenchus crenatus Aphelenchoides fragariae 11

12 Eficiência do uso de hidrotermoterapia (banho de água aquecida) comparada ao tratamento com nematicidas no controle de nematóides presentes em raízes e bulbos de lírio Influência dos tratamentos na germinação e desenvolvimento das plantas de lírio Um mês após o plantio foi verificada a influência dos tratamentos na germinação e desenvolvimento das plantas de lírio. Observou-se que o tratamento hidrotérmico com temperatura a 39 o C por 2 horas, sem adição de formalina 0,3% (Tratamento 2), não afetou a germinação dos bulbos de lírio (Figura 2A). Percentualmente, esse tratamento foi igual à testemunha, com 85% de germinação das plantas. Quando foi adicionou-se formalina 0,3% (Tratamento 3), algumas plantas apresentaram sintomas de fitotoxidez (Figura 2B). Por outro lado, o tratamento hidrotérmico com temperatura mais elevada (42 o C por 2 horas Tratamento 5) afetou significativamente a germinação e desenvolvimento inicial das plantas (Tabela 3; Figura 2C), inviabilizando sobremaneira sua utilização. Cabe ressaltar que ambos os tratamentos (Tratamentos 6 e 7) com produtos nematicidas não provocaram fitotoxidez às plantas de lírio (Figura 2D) e tampouco afetaram a germinação. Respectivamente, a porcentagem de germinação para os tratamentos com Carbofuran e Abamectina foi igual a 94 e 91% (Tabela 3). 12

13 Figura 2 Efeito dos tratamentos hidrotérmicos na germinaçao dos bulbos de lírio. A - temperatura a 39 o C/2h sem formalina; B - temperatura a 39 o C/2h com formalina 3%; C - temperatura a 42 o C/2h; D - tratamento com nematicida Avicta (Abamectina). 13

14 Dois meses após o plantio foi avaliada a porcentagem de plantas que exibiam sintomas de lesão foliar, aparentemente causados por nematóides do gênero Aphelenchoides (Tabela 3). As maiores porcentagens de plantas com lesões foram observadas nos tratamentos 3 e 4, ambos os que receberam formalina, mais provavelmente em consequência do efeito fitotóxico da formalina do que dos danos causados pelos nematóides das folhas. Tabela 3 - Influência dos tratamentos na germinação e desenvolvimento das plantas de lírio, 30 dias após os tratamentos e sintomas de lesão foliar (60 dias após os tratamentos). Valores médios de 4 repetições. n o final de plantas plantas com plantas com lesão Tratamentos desenvolvimento insatisfatório foliar média % de germinação média % média % 1. Testemunha 2. hidrotérmico (39ºC/2h) 3. hidrotérmico + formalina 0,3% (39ºC/2h) 4. tratamento com formalina 1% (TºC amb.) 5. tratamento hidrotérmico (42ºC/2h) 6. Carbofuram 350 SC (Furadan) 7. Abamectina (Avicta 500 FS)

15 Densidade populacional de nematóides extraídos das raízes de lírio As médias dos níveis populacionais de Pratylenchus e Aphelenchoides nas raízes, bulbos e folhas de lírio aos 60 após aplicação dos tratamentos encontram-se nas Tabelas 4, 5 e 6, respectivamente. Com relação ao número de Pratylechus nas raízes (Tabela 4, Figura 3), diferença estatística foi observada entre a testemunha (37,5 nematóides por 10 g de raízes) e todos os demais tratamentos com hidrotermoterapia ou nematicidas (praticamente nenhum nematóide foi detectado nas raízes), evidenciado a eficiência no controle desse nematóide. De acordo com a Tabela 5, nenhum nematóide parasito de plantas foi extraído nos bulbos de lírio. Nas folhas (Tabela 6), somente foram detectados exemplares de Aphelenchoides na testemunha (7,5 espécimes) e nas plantas que receberam tratamento hidrotérmico (39ºC/2h) + formalina 0,3% (média de 2,5 espécimes de Aphelenchoides). Os demais tratamentos mostraram 100% de eficiência no controle desse nematóide. Cabe ressaltar que, ao final do período experimental, as parcelas foram destruídas (inclusive o substrato) através do tratamento por vapor, evitando-se, dessa forma, a disseminação dos nematóides. Figura 3 Número de Pratylenchus sp. presentes em 10g de raízes de lírio 60 dias após os tratamentos. Pratylenchus na raiz nemas/10g Testemunha 2. hidrotérmico 3. hidrotérmico + 4. tratamento com 5. tratamento 6. Carbofuram Abamectina (39ºC/2h) formalina 0,3% formalina 1% (TºC hidrotérmico SC (Furadan) (Avicta 500 FS) (39ºC/2h) amb.) (42ºC/2h) tratamentos 15

16 Tabela 4 - Densidade populacional de nematóides extraídos de 10g de raízes de lírio pelo método de Coolen & D Herde (1964), 60 dias após os tratamentos. Valores médios de 4 repetições. N o de nematóides em 10g de raízes Tratamentos Aphelenchoides fragariae Pratylenchus crenatus 1. Testemunha 0 37,5b* 2. hidrotérmico (39ºC/2h) 0 0,0a 3. hidrotérmico + formalina 0,3% (39ºC/2h) 0 0,0a 4. tratamento com formalina 1% (TºC amb.) 0 0,0a 5. tratamento hidrotérmico (42ºC/2h) 0 0,0a 6. Carbofuram 350 SC (Furadan) 0 0,0a 7. Abamectina (Avicta 500 FS) 0 2,5a *Médias seguidas da mesma letra não diferiram estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%. Tabela 5 - Densidade populacional de nematóides extraídos de 20g de bulbos de lírio pelo método de Coolen & D Herde (1964), 60 dias após os tratamentos. Valores médios de 4 repetições. N o de nematóides em 20g de bulbos Tratamentos Aphelenchoides fragariae Pratylenchus crenatus 1. Testemunha hidrotérmico (39ºC/2h) hidrotérmico + formalina 0,3% (39ºC/2h) tratamento com formalina 1% (TºC amb.) tratamento hidrotérmico (42ºC/2h) Carbofuram 350 SC (Furadan) Abamectina (Avicta 500 FS)

17 Tabela 6 - Densidade populacional de nematóides extraídos de 20g de folhas de lírio pelo método de Coolen & D Herde (1964), 60 dias após os tratamentos. Valores médios de 4 repetições. N o de nematóides em 20g de folhas Tratamentos Aphelenchoides fragariae Pratylenchus crenatus 1. Testemunha 7,5a* 0 2. hidrotérmico (39ºC/2h) 0,0a 0 3. hidrotérmico + formalina 0,3% (39ºC/2h) 2,5a 0 4. tratamento com formalina 1% (TºC amb.) 0,0a 0 5. tratamento hidrotérmico (42ºC/2h) 0,0a 0 6. Carbofuram 350 SC (Furadan) 0,0a 0 7. Abamectina (Avicta 500 FS) 0,0a 0 *Médias seguidas da mesma letra não diferiram estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%. 17

18 CONCLUSÕES GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO Conclui-se, nas condições do experimento, que: a) a aplicação de técnicas moleculares através da extração de DNA genômico de exemplares de Aphelenchoides e Pratylenchus presentes, respectivamente, nas folhas e raízes de lírio, seguida da amplificação e sequenciamento do terço final da região 18S rdna e região D2/D3 rdna e comparação com informações disponíveis no GenBank, possibilitou a diagnose precisa desses organimos. Com base nessas técnicas, foram identificados os nematóides Pratylenchus crenatus e Aphelenchoides fragariae; b) em condições controladas, o uso de hidrotermoterapia (banho de água aquecida a 39ºC/2h, sem adição de formalina) mostrou-se eficiente no controle de nematóides presentes em raízes e bulbos de lírio; c) o tratamento de bulbos de lírio com nematicidas Carborufam e Abamectina mostrou-se eficiente no controle de nematóides presentes em raízes e bulbos de lírio e não provocaram fitotoxidez às plantas de lírio; d) o tratamento hidrotérmico com temperatura mais elevada (42ºC por 2 horas) afetou a germinação e desenvolvimento inicial das plantas, inviabilizando sobremaneira sua utilização; e) os tratamentos com adição de formalina 0,3% a 39ºC ou formalina 1% na temperatura ambiente são eficientes no controle de nematóides, mas podem causar fitotoxidez às plantas de lírio, comprometendo seu desenvolvimento. 18

19 Literatura citada GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO ADEKUNLE O.K., KULSHRESTHA, S., PRASAD, R., HALLAN, V., RAIKHY, G., VERMA, N., RAM, R., KUMAR, J. & ZAIDI, A.A. Plant parasitic and vector nematodes associated with Asiatic and Oriental hybrid lilies. Bioresource Technology, v.97(3), p CASTILLO, P. & VOVLAS, N. Pratylenchus (Nematoda: Pratylenchidae): Diagnosis, biology, pathogenicity and management. Nematology monographs and perspectives, vol 6, 529p., COOLEN, W. A., J. D HERDE, C. J. A method for the quantitative extraction of nematodes from plant tissue. Ghent: State Nematology and Entomology Research Station, p.77, IBRAFLOR, Brasil: mostra tua flora. Informativo, v.7, n.23, p.4, Disponível em: < Acesso em: 22 nov JUNQUEIRA, A. H., PEETZ, M. S. Mercado brasileiro de flores e plantas ornamentais perspectivas e tendências. Informativo Ibraflor, Holambra, v.11, n.45, p.8, JUNQUEIRA, A. H., PEETZ, M. S. Os pólos de produção de flores e plantas ornamentais do Brasil: uma análise do potencial exportador. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v.8, n.1/2, p.25-47, MAAS, P.W.Th., MANTEL, P. & BOONTJES, J. Root lesion nematode, Pratylenchus penetrans, in Fire King lilies: attack and control with aldicarb. European Journal of Plant Pathology. 84 (6): , MERRIFIELD, K.. Oregon State University Extension Plant Pathology Nematode Testing Service Annual Report, OLIVEIRA, C. M. G. & KUBO, R. K. Novos assinalamentos de nematóides de parte aérea (Aphelenchoides spp.) em plantas de begônia no Brasil. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v.12, p , OLIVEIRA, C. M. G. Nematóides Parasitos de Plantas Ornamentais no Brasil. Fitopatologia Brasileira, Lavras, v.31:s117-s118, OLIVEIRA, C. M. G. Nematóides parasitos de plantas. In: Pragas e doenças em plantas ornamentais, IMENES, S. L.; ALEXANDRE, M. A. V. (Eds) CD-ROM (ISBN ). Instituto Biológico, São Paulo, p.38-47, OLIVEIRA, C.M.G. Genetic and morphological diversity of longidorid nematodes from Brazil. Tese de Doutorado, University of Dundee, Scotland, p. OLIVEIRA, C.M.G., KUBO, R.K., ANTEDOMENICO, S.R., MONTEIRO, A.R. & INOMOTO, M.M. Ocorrência de nematóides fitoparasitos em plantas 19

20 ornamentais nos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, v. 13, p , 2007 SIDDIQI, M.R Aphelenchoides fragariae. C.I.H. Descriptions of Plantparasitic Nematodes. Set 5, No. 74. Commonwealth Institute of Parasitology. C.A.B. International WESTERDAHL, B.B., GIRAUD, D., ETTER, S., RIDDLE, L.J. & ANDERSON, C.A. Problems associated with crop rotation for management of Pratylenchus penetrans on easter lily. Journal of Nematology. 30(4S): , WESTERDAHL, B.B., GIRAUD, D., RADEWALD, J.D., ANDERSON, C.A. & DARSO, J. Management of Pratylenchus penetrans on oriental lilies with drip and foliar nematicides. Journal of Nematology. 25(4S): , WILLIAMS, B.D.; SCHRANK, B.; HUYNH, C.; SHOWNKEEN, R. & WATERSTON, R.H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence tagged sites. Genetics 131: Campinas, SP, 05 de Maio de 2008 Cláudio Marcelo Gonçalves de Oliveira Pesquisador Científico V marcelo@biologico.sp.gov.br Laboratório de Nematologia Centro Experimental Central do Instituto Biológico Caixa Postal 70, CEP , Campinas, SP 20

21 Anexo 1 Comparação da amostra CM03 Pratylenchus Lírio Holambra com as seqüências de outras espécies de nematóides depositadas no banco de dados (GenBank, para a identificação de homologia Job Title: CM03 Pratylenchus Lírio Holambra BLASTN (Mar ) RID: 0W4JDGHG01R Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 6,720,901 sequences; 23,547,638,319 total letters If you have any problems or questions with the results of this search please refer to the BLAST FAQs Taxonomy reports Query= CM03-D3B Length=276 Sequences producing significant alignments: (Click headers to sort columns) Accession U U AJ DQ U EF DQ DQ AF AF AF EF Description Pratylenchus crenatus 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchus vulnus 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchus vulnus partial 26S rrna gene, from Italy Pratylenchus scribneri isolate PSP 10 28S ribosomal RNA Pratylenchus scribneri 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchidae sp. Trinh S ribosomal RNA Pratylenchus hippeastri isolate PSP 3 28S ribosomal RNA Pratylenchus hippeastri isolate PSP 2 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate K6 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate N2 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate C2 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate P9 28S ribosomal RNA Max score Total score % Query coverage E value 1e- 128 Max ident 96% % 3e-99 90% % 4e-98 90% % 4e-93 89% % 4e-93 89% % 2e-91 88% % 2e-91 88% % 2e-91 88% % 2e-91 88% % 2e-91 88% % 2e-91 88% % 6e-91 88% 21

22 Accession EF EF AF U DQ DQ EF EF EF AF AF AF AF AF AF AF AF U AF AF AF AF U U AM AM Description Pratylenchus loosi isolate P7 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate P4 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate T 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Pratylenchus hexincisus 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchus hexincisus isolate PSP 8 28S ribosomal RNA Pratylenchus hexincisus isolate PSP 7 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate P11 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate P10 28S ribosomal RNA Pratylenchus loosi isolate P6 28S ribosomal RNA Pratylenchus pseudocoffeae 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate M3 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate M1 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate B2 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate Y3 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate Y2 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate Y1 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae isolate C6 28S ribosomal RNA Pratylenchus musicola 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchus teres vandenbergae isolate RTB 28S ribosomal RNA Pratylenchus agilis 26S ribosomal RNA gene, partial sequence Pratylenchus loosi isolate N1 28S ribosomal RNA Pratylenchus gutierrezi isolate K1 28S ribosomal RNA Pratylenchus coffeae 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchus brachyurus 26S rrna gene, D3 expansion domain Pratylenchus pratensis 28S rrna gene from Comporta, Portugal, clone 1 Pratylenchus pratensis 28S rrna gene from Het Zwin, Belgium, clone 1 Max score Total score Query coverage E value Max ident % 6e-91 88% % 6e-91 88% % 6e-91 88% % 2e-90 88% % 1e-88 88% % 4e-88 88% % 4e-88 88% % 4e-88 88% % 1e-87 88% % 1e-87 88% 22

23 Tree view for rid: 0W54B4VD01R, query ID: lcl 3004, database: nr This tree was produced using BLAST pairwise alignments CM03 Pratylenchus Lírio Holambra, SP 23

24 Anexo 2 Comparação da amostra CM02 Aphelenchoides Lírio Holambra com as seqüências de outras espécies de nematóides depositadas no banco de dados (GenBank, para a identificação de homologia Job Title: (2) - CM02 BLASTN (Mar ) RID: 0VNW Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 6,720,901 sequences; 23,547,638,319 total letters If you have any problems or questions with the results of this search please refer to the BLAST FAQs Taxonomy reports Query= CM02 Length=580 Sequences producing significant alignments: (Click headers to sort columns) Accession AJ AB AY AY AY AY DQ AY AY AY AY Description Aphelenchoides fragariae partial 18S rrna gene, isolated in Belgium, Gent Aphelenchoides fragariae gene for 18S rrna, partial sequence Aphelenchoides fragariae isolate AChoFra1 18S small subunit ribosomal RNA Aphelenchoides sp. JH-2004 isolate AChoSp2 18S small subunit ribosomal RNA Aphelenchoides blastophtorus isolate AChoBla 18S small subunit ribosomal RNA Aphelenchoides sp. JH-2004 isolate AChoSp1 18S small subunit ribosomal RNA Aphelenchoides fragariae voucher AfBotSad 18S ribosomal RNA Aphelenchoides bicaudatus isolate AChoBic 18S small subunit ribosomal RNA Aphelenchoides cf. obtusus TSH-2005 isolate Konza IIIBB-37 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence Aphelenchoides clarus isolate Konza ICC-13 small subunit ribosomal RNA Aphelenchoides besseyi isolate 98 18S ribosomal RNA Max score Total score Query coverage E value Max ident % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % 2e % 24

25 Accession DQ DQ DQ DQ AY AY Description Aphelenchoides sp. JB011 18S ribosomal RNA gene, partial sequence Aphelenchoides sp. SAS S ribosomal RNA gene, partial sequence Aphelenchoides ritzemabosi voucher ArBotSad 18S ribosomal RNA Aphelenchoides sp. JB012 18S ribosomal RNA gene, partial sequence Aphelenchoides cf. besseyi TSH-2005 isolate 9 Mile 1-28 SW1-16 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence Aphelenchoides cf. besseyi TSH-2005 isolate 9 Mile 1-28 SW1-21 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence Alignments Max score Total score % % % % % % Query coverage E value 5e e e e e e- 145 Max ident 92% 90% 87% 91% 86% 86% > emb AJ Aphelenchoides fragariae partial 18S rrna gene, isolated in Belgium, Gent Length=1731 Score = 1050 bits (568), Expect = 0.0 Identities = 578/582 (99%), Gaps = 4/582 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 CCAGGAGTGGAGCTTGCGGGCTTAATTTGACTCAACCAC-GG-AACCTCACCCGGCCAGT 58 Sbjct 1102 CCAGGAGTGGAGCTTGC-GGCTTAATTTGACTCAA-CACGGGAAACCTCACCCGGCCAGT 1159 Query 59 ACATCATAAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCATGATTTGATGAATGGTGGTGCATGG 118 Sbjct 1160 ACATCATAAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCATGATTTGATGAATGGTGGTGCATGG 1219 Query 119 CCGTTCTTAGTTCGTGGTGTGAACTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAGCGAGACTCCGAC 178 Sbjct 1220 CCGTTCTTAGTTCGTGGTGTGAACTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAGCGAGACTCCGAC 1279 Query 179 TGTTAAATAGTGAATGGTTTATTACTGACCATTACACTTCTTAACGGGATTCGCAACTTC 238 Sbjct 1280 TGTTAAATAGTGAATGGTTTATTACTGACCATTACACTTCTTAACGGGATTCGCAACTTC 1339 Query 239 AAGTTGCAAGAAATGGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCGGGGCGGCAC 298 Sbjct 1340 AAGTTGCAAGAAATGGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCGGGGCGGCAC 1399 Query 299 GCGTGCTACAATGATGGTAACAGCGTGATTGTCCTCGCCCGACAGGGCTTGGCAAACAGT 358 Sbjct 1400 GCGTGCTACAATGATGGTAACAGCGTGATTGTCCTCGCCCGACAGGGCTTGGCAAACAGT 1459 Query 359 TGAGATATTATTATGGCTGGAATTGAGTGTTGAAATTTTCTCTCATGAACGAGGAATTCC 418 Sbjct 1460 TGAGATATTATTATGGCTGGAATTGAGTGTTGAAATTTTCTCTCATGAACGAGGAATTCC 1519 Query 419 AAGTAAATGCGAGTCATCAACTCGCATTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCC 478 Sbjct 1520 AAGTAAATGCGAGTCATCAACTCGCATTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCC 1579 Query 479 GTCGCTACCCGGGACTGAGTTATTTCGAGAAATCTACGGACTTTTTGTTGGGAAGCAATT 538 Sbjct 1580 GTCGCTACCCGGGACTGAGTTATTTCGAGAAATCTACGGACTTTTTGTTGGGAAGCAATT 1639 Query 539 CTCTGCTTAATGGAAAGTAAATTAATCGCAATAATTTGAACC 580 Sbjct 1640 CTCTGCTTAATGGAAAGTAAATTAATCGCAATAATTTGAACC

26 Tree view for rid: 0VNW , query ID: lcl 6569, database: nr This tree was produced using BLAST pairwise alignments. CM02 Aphelenchoides Lírio Holambra, SP &queryID=lcl 6569&distmode=on 26