EFEITO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA ARTRITE

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1 EFEITO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA NA CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DOS LEUCÓCITOS NO LEITE DE CABRAS Anhanguera Educacional S.A. Correspondência/Contato Alameda Maria Tereza, 2000 Valinhos, São Paulo rc.ipade@unianhanguera.edu.br pic.ipade@unianhanguera.edu.br Coordenação Instituto de Pesquisas Aplicadas e Desenvolvimento Educacional - IPADE Publicação: 09 de março de 2009 ANUÁRIO DA PRODUÇÃO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DISCENTE Vol. XI, Nº. 12, Ano 2008 Brenda Barcelos Cynthia Pereira da Costa e Silva Profa. Dra. Viviani Gomes (orientadora) Prof. Ms. Karina Medici Madureira (coorientadora) Curso: Medicina Veterinária CENTRO UNIVERSITÁRIO ANHANGUERA CAMPUS LEME ANHANGUERA EDUCACIONAL S.A. Trabalho apresentado em 16 SIICUSP Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP. Trabalho apresentado no 8º. Congresso Nacional de Iniciação Científica CONIC SEMESP em novembro de Trabalho premiado com 1 lugar na apresentação do Encontro de Iniciação Científica do Centro Universitário Anhanguera Campus Leme. RESUMO O leite de cabra possui alto valor comercial e alto valor nutritivo e pode ser consumido por crianças e idosos intolerantes ao leite bovino. Como fator limitante da produção e da qualidade do leite caprino tem-se a Artrite Encefalite dos Caprinos (CAE), enfermidade cosmopolita, que acomete animais de diferentes raças e idades, causando prejuízos aos produtores. Dentre os principais sintomas da CAE, cita-se a mastite, que pode promover alterações nos componentes lácteos de portadores. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da infecção pelo CAEV no exame citológico do leite de cabras. Foram utilizadas 57 fêmeas da raça Saanen em lactação, que foram selecionadas através do teste de imunodifusão em ágar gel (IDGA) e exame bacteriológico do leite, sendo categorizadas em dois grupos experimentais: G1 - sorologicamente negativos ao CAEV e G2 positivos ao CAEV. Foram realizadas as colheitas das amostras de leite para a realização do California Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas automáticas (CCS) e contagem diferencial de leucócitos do leite. Das amostras de leite dos Grupos 01 e 02, os resultados encontrados para o CMT foram de 74,75%, 8,73; 8,73; 6,8; 0,97% e 0; 33,33; 33,33; 33,33; 0% para as reações negativa, T, +, ++ e +++, respectivamente. O valor mediano de células somáticas obtido foi de células/ml e células/ml de leite para G1 e G2, respectivamente. Os valores médios de neutrófilos segmentados, linfócitos e monócitos foram 66,15 e 80,17%; 2,17 e 10,83%; 22,44 e 7,83%, respectivamente nos grupos G1 e G2. Palavras-Chave: CAEV, leite, cabras, mastite. Trabalho realizado com o incentivo e fomento da Anhanguera Educacional S.A.

2 70 Efeito da infecção pelo vírus da artrite encefalite caprina na contagem total e diferencial dos leucócitos no leite de cabras 1. INTRODUÇÃO O leite de cabras apresenta alta digestibilidade e valor nutricional. Além disso, possui indicação terapêutica para crianças com intolerância a lactose bovina. Os caprinos são animais adaptáveis ao clima semi-árido do Nordeste, onde concentra-se o maior rebanho brasileiro, fornecendo proteína animal para a população carente da região. Porém, o crescimento da caprinocultura pode limitar-se pela disseminação da artrite encefalite caprina (CAE). A CAE á causada por um vírus da família Retroviridae, da subfamília Lentivirinae e gênero Lentivirus. A doença pode causar artrite e pneumonia em animais adultos, além de leucoencefalomielite em animais com idade inferior a 04 meses (PUGH, 2004). Além destes quadros, sugeriu-se a possibilidade do CAEV provocar mastite em animais adultos (KENNEDY-STOSKOPF et al., 1985; POST et al, 1986; LERONDELLE et al., 1989). Nork (1997), afirmou que o CAEV não afeta o estado de higidez da glândula mamária e qualidade do leite, porém, Lerondelle et al. (1999) determinaram que quadros de mastite são mais prevalentes em animais infectados. Lerondelle et al. (1999) afirmaram a ocorrência da diminuição da produção láctea em cabras acometidas pela CAE em decorrência da mastite difusa, sendo caracterizada pelo endurecimento progressivo não edematoso, com a presença de vários nódulos de consistência dura, que confluem para determinar um endurecimento difuso do parênquima mamário. As alterações histológicas evidenciaram infiltrações perivasculares e do próprio parênquima glandular por células mononucleares (GONZALES et al., 1987; CHEEVERS e McGUIRE, 1988; PERK, 1988). Para avaliar a higidez da glândula mamária e a qualidade do leite, são utilizados testes que avaliam quantitativamente e qualitativamente a celularidade desta secreção (PAAPE et al., 2001). Os tipos celulares encontrados no leite de cabras são: células inflamatórias, células epiteliais e partículas citoplasmáticas. As principais células inflamatórias presentes no leite de cabras sadias são os polimorfonucleares, linfócitos e monócitos com 45-74%, 9-20% e 15-41% de proporção, respectivamente, em animais sadios; em animais infectados pelo vírus CAE, esta proporção é alterada para 71-86%, 8-18% e 5-11%. (PAAPE et al., 2001). As células epiteliais correspondem a 5,6% das células somáticas no leite de cabras sadias (ZENG, 1996; SIERRA et al., 1999), podendo aumentar nas infecções pelo vírus da artrite encefalite caprina (HINCKLEY, 1983).

3 Brenda Barcelos, Cynthia Pereira da Costa e Silva, Viviane Gomes, Karina Médici Madureira 71 Nord e Adnoy (1997); Birgel Junior et al. (2007) avaliaram a celularidade do leite de cabras CAE positivas através de contagem eletrônica de células somáticas e, verificaram aumento da celularidade nas cabras reagentes a imunodifusão em gel para o CAEV. 2. OBJETIVO Em função da importância do leite de cabras ao público consumidor, da viabilidade da produção de proteína animal, mesmo em condições ambientais inóspitas, destinadas a populações carentes, e escassez literária sobre o assunto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da infecção pelo CAEV no exame citológico do leite de cabras. 3. METODOLOGIA As fêmeas caprinas CAEV negativas (G1) e CAEV positivas (G2) foram selecionadas através das provas de imunodifusão em ágar gel IDGA (BIRGEL JUNIOR et. al., 2007) e exame bacteriológico do leite. As amostras de leite provenientes destes animais foram colhidas para a realização do California Mastitis Test CMT (SCHALM; CAROL; JAIN, 1971), contagem automática de células somáticas e exame diferencial de leucócitos (MADUREIRA, 2006). 4. DESENVOLVIMENTO Os animais utilizados no experimento foram 57 cabras lactantes da raça Saanen provenientes de propriedades leiteiras do Estado de São Paulo, sendo Capril União situado em Pindamonhangaba e cabras da Universidade do Estado de São Paulo Campus Pirassununga, distribuídas em 2 grupos, conforme foram negativas (Grupo 1) ou positivas ( Grupo 2) ao exame de imunodifusão em ágar gel para CAEV. O teste de imunodifusão radial dupla em ágar gel (IDGA) foi realizado segundo Crawford e Adams (1981), utilizando o antígeno Maedi/Visna GP 135 (Veterinary Diagnostic Tewchnology ) para a detecção de anticorpos séricos precipitantes contra o vírus da artrite encefalite dos caprinos. Após a seleção dos animais negativos e positivos para a CAE, realizou-se a colheita das amostras de leite para as análises celulares. Cada amostra de leite foi colhida em quatro alíquotas destinadas ao CMT, ao exame bacteriológico do leite, à contagem automática de células somáticas e à contagem diferencial de leucócitos do leite.

4 72 Efeito da infecção pelo vírus da artrite encefalite caprina na contagem total e diferencial dos leucócitos no leite de cabras A primeira alíquota foi destinada ao CMT. Para a realização do CMT (SCHALM; NOORLANDER, 1957; SCHALM; CAROL; JAIN, 1971) foram misturados 2mL de reagente¹ a 2mL de leite, verificando a intensidade da alteração da viscosidade da mistura. A segunda alíquota foi colhida assepticamente, e para tanto o úbere foi higienizado com papel toalha, retirando-se as sujidades da pele da glândula e dos tetos. Posteriormente, cada teto foi mergulhado em solução fraca de anti-séptico, sendo a seguir secos com folhas individuais descartáveis de papel toalha, para finalmente, ser feita a antisepsia do teto. Esta é feita friccionando algodão embebido em álcool 70%, principalmente no orifício do teto. A amostra de leite foi colhida em frasco estéril, que no momento da colheita foi inclinado a 90º graus em relação ao teto, para evitar a entrada de sujidades que contaminassem a amostra; o frasco no momento da colheita permaneceu aberto por no máximo 5 segundos, de acordo com as recomendações do National Mastitis Council (HARMON et. al., 1990). As amostras foram transportadas sob refrigeração ao laboratório e destinadas ao exame bacteriológico. As amostras de leite destinadas ao exame bacteriológico foram semeadas em placas de Petri contendo ágar-sangue de carneiro (5%) e incubadas (37ºC por 72 horas), para a exclusão das amostras positivas ao exame bacteriológico do leite, visto que, o objetivo da presente investigação é avaliar as alterações citológicas do leite, provocadas pelo CAEV. A terceira alíquota de leite foi colhida em um tubo Falcon contendo 45mL de solução salina tamponada, completando-se o volume de 50mL. Esta alíquota foi destinada ao exame diferencial dos leucócitos do leite. As alíquotas destinadas à contagem diferencial de leucócitos foram centrifugadas á 450 G (2000 rpm) por 20 minutos em refrigeração de 4 C. Após a centrifugação, desprezou-se o sobrenadante invertendo-se o frasco uma única vez. Mantendo-se o frasco invertido, os lados do frasco foram limpos com papel macio e absorvente. Apenas o botão de células formado no fundo do frasco foi preservado. Subseqüentemente, o botão de células foi desprendido do frasco pela aspersão, em fracos jatos de PBS, para, a seguir, homogeneizar o conteúdo, completando com PBS refrigerada (refazendo o volume de 50 ml). A suspensão foi novamente centrifugada e a mesma operação foi realizada mais uma vez e após a terceira e última ressuspensão em 1 (um) ml de PBS, uma alíquota de 100 l de cada suspensão celular de todas as amostras de leite foram submetidas a citocentrifugação em centrífuga da marca INCIBRÁS, modelo CITOSPYN a uma força centrífuga relativa (FCR) de 28 g (450 rpm) durante 6 minutos. As lâminas foram confeccionadas em duplicata e secas em temperatura ambiente por 24 horas, fixadas em

5 Brenda Barcelos, Cynthia Pereira da Costa e Silva, Viviane Gomes, Karina Médici Madureira 73 álcool metílico e coradas posteriormente pelo método de Rosenfeld (1947). As lâminas foram analisadas segundo a qualidade e tipos celulares predominantes, realizando-se assim a contagem diferencial dos neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos, sendo os resultados obtidos expressos em porcentagem dos diferentes tipos celulares. Uma quarta alíquota com volume mínimo de 10mL foi colocada em frasco contendo como conservante o bronopol, e enviado para a contagem automática de células somáticas. As alíquotas das amostras de leite, antes do início das análises para a obtenção da contagem automática das células somáticas, foram mantidas em banho-maria a 38C, durante 15 minutos e a seguir, homogeneizadas, manualmente, sendo a contagem de células somáticas realizadas por citometria de fluxo utilizando-se o equipamento Somacount 300 da empresa Bentley Instruments Inc. Nesse procedimento uma alíquota de 3cc de leite, depois de aspirada pelo equipamento, foi misturada com brometo de etídio, que cora o DNA do núcleo das células, que quando expostas a uma fonte luminosa de laser fluorescem, sendo convertidas no tubo multiplicador do equipamento em impulsos elétricos, sendo o resultado registrado em número de células somáticas/ml de leite. Os resultados dos diversos parâmetros foram analisados estatisticamente utilizando-se o programa MINITAB (2000) 5. RESULTADOS A seguir serão apresentados os resultados obtidos ao decorrer da pesquisa CMT Das amostras de leite do Grupo 01, 74,75% apresentaram reação negativa ao de CMT, e 8,73; 8,73; 6,8; 0,97% para as reações T, +, ++ e +++, respectivamente. No grupo 02, obtivemos 0% de reação negativa ao CMT e 33,33; 33,33; 33,33 e 0% para T, +, ++ e +++, respectivamente, conforme a Figura 01. As amostras de leite provenientes dos animais CAE positivos apresentaram maiores escores ao CMT, comparados ao leite dos animais CAE negativos (p<0,0001), concordando com Birgel Junior et al. (2007).

6 74 Efeito da infecção pelo vírus da artrite encefalite caprina na contagem total e diferencial dos leucócitos no leite de cabras Valores expressos em % G - 1 (CAE - ) G - 2 (CAE + ) 0 Negativo T Figura 01. Porcentagens (%) de reações nos diferentes escores do CMT nos grupos 01 e Contagem eletrônica de células somáticas do leite de cabras Valores expressos em células somáticas/ml G - 1 (CAE - ) G - 2 (CAE + ) Figura 02. Valores medianos de células somáticas no leite de cabras dos grupos 01 e 02. Os resultados apresentados na Figura 02 demonstram que o valor da mediana na contagem de células somáticas no leite de cabras não sofreu variação significativa entre os grupos G1 e G2 (p = 0, 0888). O valor mediano de células somáticas obtido foi de células somáticas/ml de leite nas amostras pertencentes às cabras do G1, e células somáticas/ml de leite para os animais do grupo CAE positivo. Apesar do número de

7 Brenda Barcelos, Cynthia Pereira da Costa e Silva, Viviane Gomes, Karina Médici Madureira 75 células encontrado no grupo de animais CAE positivo (G2) foi superior ao G1, os dados não apresentaram diferença estatística. Nord e Adnoy (1997) e Birgel Junior et al., 2007 encontraram valores de CCS maiores nos animais sorologicamente positivos ao CAEV Contagem diferencial de leucócitos do leite de cabras Os valores médios de neutrófilos segmentados presentes no leite de cabras foram de 66,15 e 80,17%, respectivamente, nos grupos G1 e G2 (p= 0,2702); os valores médios de linfócitos presentes no leite de cabras foram de 2,17 e 10,83% nos animais CAE negativos e CAE positivos, respectivamente (p= 0,0002) e os valores médios de monócitos encontrados nas amostras de leite foram de 22,44 e 7,83%, respectivamente nos grupos G1 e G2 (p= ), demonstrado na Figura 03. Ou seja, houve aumento de neutrófilos e linfócitos, e diminuição dos monócitos nos animais CAE positivos, concordando com a alteração de proporcionalidade celular citada por Paape et. al. (2001) para neutrófilos e linfócitos Valores espressos em % G - 1 (CAE - ) G - 2 (CAE + ) 0 Neutrófilos Linfócitos Monócitos Figura 03. Média dos tipos celulares presentes no leite de cabras dos grupos 01 e CONSIDERAÇÕES FINAIS Foi possível observar maior reatividade ao CMT nas amostras de leite provenientes de fêmeas caprinas CAE positivas: Os valores medianos da contagem automática de células somáticas do leite de cabras foram maiores para os animais positivos ao CAE, porém não foi possível obter diferença significativa entre os grupos 01 e 02.

8 76 Efeito da infecção pelo vírus da artrite encefalite caprina na contagem total e diferencial dos leucócitos no leite de cabras No exame diferencial dos leucócitos do leite de cabras, observou-se maior porcentagem de linfócitos e menor proporção de monócitos no grupo de animais CAE positivos, quando comparados ao grupo de animais CAE negativos. Esta maior proporção de linfócitos pode estar relacionada à etiopatogenia da doença, pois os agentes virais são microorganismos intracelulares obrigatórios e multiplicam-se dentro de células do sistema imune do hospedeiro, principalmente linfócitos. Os resultados apresentados nesta pesquisa indicam alterações citológicas no leite de cabras alterando sua qualidade e, segundo Birgel Junior et. al. (2007) e Lerondelle et al. (1999), ocorrem também alterações na produção leiteira. PARECER DE APROVAÇÃO DE COMITÊ A presente pesquisa foi autorizada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Anhanguera Educacional S/A CEUA/AESA - em 25/04/08 n o do parecer: 1-002/08. REFERÊNCIAS BIRGEL JUNIOR E.H., CESTARI V., SAMPAIO R.M., LARA M.C.C.S.H., BIRGEL D.B., RAIMONDO R.F.S., BRANDESPIN F.B., BIRGEL E.H. Influência da infecção pelo vírus da artrite encefalite caprina nas características físico-químicas e celulares do leite de caprinos. Arq. Inst. Biol, v. 74, n. 3, p , CHEEVERS, W.R.; McGUIRE, T. C. The lentiviruses: MAEDI/VISNA, caprine arthritis encephalitis and equine infectious anemia. Advances in Virus Reaserch, v. 34, n. 2, p , CRAWFORD, T.B.; ADAMS, D.S. Caprine arthitis-encephalitis: Clinical features and presence of antibody in selected goat populations. Veterinary Medical Association, v. 178, n. 7, p , GONZALES, L.; GELABERT, J. E.; MARLO, J. C.; SAEZ, C. O. Caprine arthritis encephalitis in the Basque country. Veterinary Record, v. 120, n. 5, p , HARMON, R. J.; EBERHART, R. J.; JASPER, D. E.; LANGLOIS, B. E.; WILSON, R. A. Microbiological procedures for the diagnosis of bovine udder infection, ed. 3, Arlington, VA, National Mastitis Council, HINCKLEY, L. S. Somatic cell count in relation to caprine mastitis. Veterinary Medicine: Small Animal Clinician, v.78, n.8, p , KENNEDY-STOSKOPF, S.; NARAYAN, O.; STRANDBERG, J. D. The mammary gland as a targed organ for infection with caprine arthritis encephalitis virus. Journal Comparative Pathology, v. 95, p , LERONDELLE, C.; FLEURY, C.; VIALARD, J. The mammary gland: a target organ for infection with caprine arthritis encephalits virus. Annales de Researches Vétérinaires, v. 20 p , LERONDELLE, C.; GODET, M.; MORNEX, J. F. Veterinary Research, v. 30, n. 5, p , MADUREIRA, K. M. Contagem celular total e diferencial no leite e sangue de cabras hígidas criadas no Estado de São Paulo f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.

9 Brenda Barcelos, Cynthia Pereira da Costa e Silva, Viviane Gomes, Karina Médici Madureira 77 MINITAB-The student Edition of MINITAB Statistical software adapted for edication-12,1 Release-User s Manual. New York: Adisson-Wesley, p. NORD, K.; ADNOY, T. Effects of infection by caprine arthritis encenphalitis virus on milk production of goats. Journal Dairy Science, v. 80, n. 10, p , NORK, N. CAEV infection does not affects prevalence of bacterial mastitis in goats. Acta Vet. Scandinavia, v. 38, p , PAAPE, M. J.; POUTREL, B.; CONTRERAS, A.; MARCO, J. C.; CAPUCO, A. V. Milk somatic cells and lactation in small ruminants. Journal Dairy Science, n. 84 (supplemet E), p , PERK, K. Ungulate lentiviruses: pathogenesis and relanshionship to AIDS. Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, v. 32, p , POST, J. E.; DUVAL, M. C.; HINCKLEY, L. S. Association of caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) with mastitis in goats. In: Production and utilization of ewe s and goat s milk. International Dairy Federation Bulletin Document, v. 202, p , PUGH, D.G. Clinica de ovinos e caprinos, 1.ed. São Paulo: Roca, p SCHALM, A. W.; NOORLANDER, D. O. Experiments and observations leading to developments and the California Mastitis Test. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.130, n. 5, p , SCHALM O. W.; CARROL, E. J.; JAIN, N. C. Bovine Mastitis. Physiological and chemical tests for detection of mastitis. Lea & Febiger, Philadelphia, p , SIERRA, D.; SÁNCHEZ, A.; CORRALES, J. C. Diferential cell counts in goat s milk. In: MILKING AND MILKING PRODUTION OF DAIRY SHEEP AND GOATS, 1998, Athens. Proceedings of the 6 th International Symposium on the Milking of Small Ruminants. Athens: Wageningen, 1999, p ZENG, S. S. Comparasion of goat milk standards with cow milk standads for analysis of somatic cell count, fat and protein in goat milk. Small Ruminant Research, v.21, n.3, p , 1996.

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