Reprodução Induzida de Rã-Touro (Rana catesbeiana, Shaw, 1802) com Uso de Extrato Bruto Hipofisário 1

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1 R. Bras. Zootec., v.27, n.4, p , 1998 Reprodução Induzida de Rã-Touro (Rana catesbeiana, Shaw, 1802) com Uso de Extrato Bruto Hipofisário 1 Oswaldo Pinto Ribeiro Filho 2, Dálcio Ricardo de Andrade 3, Samuel Lopes Lima 4, José Teixeira de Seixas Filho 5, Simone Gonçalves 6 RESUMO - Este experimento foi realizado, em um período de 15 dias, para avaliar o efeito da técnica de indução de rã-touro (Rana catesbeiana) para reprodução, por meio da aplicação de EBH no número de ovos por desova. Foram utilizados 60 casais, na fase de primeira maturação gonadal, acondicionados em baias-teste, com 1,54 m 2 de área, sob temperatura de 25 ± 2 C e fotoperíodo LD 12:12. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 4 x 3 (dose x tempo), com quatro repetições. Os tratamentos consistiram de quatro dosagens hormonais (1, 3, 5 e 7 mg/kg), com três intervalos de aplicação (6, 12 e 18 horas). Ocorreu desova em todos os tratamentos, contudo, houve diferenças na freqüência entre os diferentes tratamentos. Os animais usados como controle não desovaram espontaneamente, nem por compressão das paredes lateral e ventral do corpo (desova forçada). A desova forçada ocorreu quando apenas 3 mg/kg de EBH foram aplicados. Não houve efeito do intervalo de aplicação do hormônio. O efeito do extrato de pituitária foi significativo, com média de desova na faixa de 59 a 94%. Palavras-chave: extrato hipofisário bruto, desova induzida, Rana catesbeiana, rã-touro, reprodução Induced Reproduction of Bull Frog (Rana catesbeiana, Shaw, 1802), Using Crude Hypophyseal Extract ABSTRACT - This research was conducted, in a 15-day period, to evaluate the effect of bull frog, Rana catesbeiana, Shaw (1802), spawning technique for reproduction, by means of the application of a crude hypophyseal extract (CHE). Sixty couples were used in the first gonadal maturation phase, which were conditioned in 1.54 m 2 test cages, at a temperature of 25 ± 2 C and a LD photoperiod of 12:12. A complete randomized design in a 4 x 3 factorial (dose x time) arrangement, with four replicates was used. The treatments consisted in four hormonal doses (1, 3, 5 and 7 mg/kg) and three intervals of application (6, 12 and 18 hours). There was spawning in all treatments, however, there were differences on the frequency among different treatments. The animals used as control did not freely spawn even by compression of the body s lateral and ventral wall (forced spawning). Forced spawning occurred when only 3 mg/kg of CHE were used. There was no effect of hormone interval application. The crude pituitary effect was significant, with average spawning ranging from 59 to 94%. Key Words: crude hypophyseal extract, induced spawning, Rana catesbeiana, bull-frog, reproduction Introdução A falta de conhecimentos básicos sobre os parâmetros relacionados à reprodução de rãs, principalmente em nível de cativeiro, tem levado os ranicultores a supermensionarem as instalações do setor de reprodução e o número de matrizes. Além disso, a elaboração de um planejamento zootécnico do fluxo de criação, desde as desovas até o abate, torna-se difícil, em razão das flutuações na produção, uma vez que os animais não apresentam sincronismo no acasalamento. Assim, mesmo durante o período de reprodução, os ranicultores não conseguem interferir no processo, pois as desovas ocorrem aleatoriamente. O emprego de técnicas de controle de parâmetros abióticos, como fotoperíodo e temperatura, juntamente com a utilização do processo de reprodução induzida, por meio de hormônios hipofisários, são recursos que podem estimular e sincronizar a reprodução, mesmo no inverno. Desse modo, o ranicultor poderá diminuir os custos do ranário pela miminização do número de reprodutores e aumentar as possibilidades de sucesso nos acasalamentos, evitando, assim, os prejuízos causados pela flutuação na produção. 1 Parte do trabalho de Tese de Mestrado do primeiro Autor - CAPES 2 Prof. do Depto. de Biologia Animal da UFV Viçosa, MG. 3 Prof. do CCTA da Universidade do Norte Fluminense Campos, RJ. 4 Pesquisador do CNPq junto ao Depto. de Biol. Animal da UFV Viçosa, MG. 5 Pesquisador da Fund. Inst. Pesca do RJ - FIPERJ Rio de Janeiro, RJ. 6 Zootecnista, Estagiária do Ranário Experimental da UFV Viçosa, MG.

2 O processo fisiológico que controla todos os eventos reprodutivos, morfológicos ou comportamentais em rãs está na dependência de fatores abióticos e endócrinos. Assim, a influência dos fatores climáticos foram estudados por vários autores: FONTANELLO et al. (1984); CULLEY JR. (1973); CULLEY JR. et al. (1978); RYAN (1980); e WOLLBRIGHT (1983). Vários trabalhos também foram realizados para a determinação do tamanho em que ocorre a primeira maturação de Rana Catesbeiana (WILLIS et al., 1956; RANEY e INGRAM, 1941; HOWARD 1979 e 1981; CULLEY e GRAVOIS, 1971; e COSTA (1992). COSTA (1992) verificou também que o aumento da relação gonadossomática (RGS) em machos e fêmeas de rã-touro criados em cativeiros acompanhou o aumento do fotoperíodo. LOFTS (1974) e PANCHARATNA e SAIDAPUR (1985) afirmaram que o desenvolvimento e o ciclo sazonal do oviduto são dependentes de estrógenos produzidos pelo ovário. Este estudo procurou padronizar a técnica que permita induzir a desova de rã-touro por meio da aplicação de seu extrato hipofisário bruto, verificando-se, assim, a dosagem ideal do extrato bruto hipofisário para estimular a desova e o intervalo de tempo ideal entre as aplicações das doses, para maior eficiência do estímulo à desova. Material e Métodos Foram usados 60 casais de rã-touro (Rana catesbeiana), previamente aclimatados ao ambiente do laboratório, no Sistema Anfigranja de Criação Intensiva da Universidade Federal de Viçosa, durante 15 dias, na fase de primeira maturação gonadal. Os animais foram distribuídos em 30 baias-teste, totalizando dois casais por baia. Estas foram construídas em alvenaria e suspensas a um metro do piso, com 1,52 m 2 de área cada, equipadas com abrigo, comedouro e piscina. As baias possuíam um sistema de aquecimento, por meio de resistência acoplada ao piso e termostato, permitindo, assim, o controle da temperatura, que permaneceu em 25 ± 2 o C durante o período experimental. As piscinas do sistema foram supridas com água a 28 o C, controlada por aquecedor de watts instalado no reservatório central, sendo renovada uma vez ao dia, pela manhã. A metodologia do manejo dos animais durante os 11 dias de experimento foi executada segundo LIMA e AGOSTINHO (1988). O fotoperíodo foi mantido LD 12:12 por meio de luz incandescente (100 watts) acopladas a um marcador de tempo. RIBEIRO FILHO et al. 659 Seleção de animais doadores de hipófise Foram utilizados 2000 exemplares de fêmeas de Rana catesbeiana, como doadoras de hipófise. Consideraram-se como fêmeas doadoras as que apresentavam aumento da cavidade visceral, provocado pelo desenvolvimento dos ovários em estádio maduro ou em maturação avançada. Para se obter confirmação do amadurecimento do ovário, as fêmeas foram sacrificadas para observação visual das gônadas. Em razão da dificuldade na identificação macroscópica dos estádios de desenvolvimento gonadal nos machos, estes não foram utilizados como doadores de hipófises. Extração das hipófises Para extração da hipófise, foi feita uma incisão na mucosa bucal, na linha mediana entre o orifício das trompas auditivas, visando atingir o osso esfenetimóide, localizado sob o encéfalo (MENIN, 1994). Após a exposição do encéfalo, com auxílio de uma pinça ele foi rebatido e a hipófise, então, pode ser retirada. O tamanho das hipófises nos exemplares utilizados foi de 0,3 cm e o peso variou de 0,7 a 4,5 mg. Preservação das hipófises Imediatamente após a extração, as hipófises foram colocadas em frascos contendo acetona (meio desidratante). No término da coleta, efetuou-se a lavagem das hipófises. Em seguida, a acetona foi reposta numa proporção de 20 vezes o volume das hipófises, efetuando-se mais duas trocas em intervalos aproximados de oito horas, num período total de 24 horas. Ao final do período de desidratação, as hipófises foram colocadas sobre um papel de filtro e deixadas para secar à temperatura ambiente e em local seco, por um período de uma hora. A seguir, cada hipófise foi pesada individualmente em balança analítica com sensibilidade de 0,0001 g, embalada em papel alumínio e identificada com o peso. Após a pesagem, as hipófises foram guardadas em dessecador, para posterior utilização. Preparo e aplicação do extrato bruto de hipófise (EBH) No preparo do extrato, as hipófises foram colocadas em almofariz seco. Para obter maior dispersão, aplicaram-se algumas gotas de glicerina (não ultrapassando 0,1 ml), sendo as hipófises maceradas, com auxílio de um pistilo, até a obtenção de uma pasta fina. Depois disso, foi adicionada solução de Ringer (HOAR e HICKMAN,1967). Para obtenção da dosagem pré-determinada, tomou-se como base o peso total dos animais de cada tratamento. Desse total, por regra de três simples, achou-se a quantidade de solução de EBH a ser aplica-

3 660 R.Bras.Zootec. da em cada animal, o que foi realizado com auxílio de uma seringa de insulina. As dosagens de EBH testadas foram de 1, 3, 5 e 7 mg/kg. Para rã-touro, foram testados os intervalos de aplicação de 6, 12 e 18 horas entre a primeira e a segunda dose de extrato hipofisário, que refletem as amplitudes máximas e mínimas utilizadas para peixes (WOYNAROVICH e HORVATH, 1980; FERRAZ de LIMA et al., 1988). O local de aplicação do hormônio foi o músculo interno da coxa (Gracilis maior). O extrato hipofisário foi aplicado com duas doses para fêmeas, sendo na primeira dose (preparatória) utilizado 10% do total da segunda dose (definitiva) (Tabela 1). Os machos receberam somente uma injeção de EBH equivalente a 50% do total da segunda dose aplicada nas fêmeas (Tabela 2). Esta aplicação foi realizada no momento em que se aplicou a segunda dosagem nas fêmeas, de acordo com a metodologia utilizada para peixes (WOYNAROVICH e HORVATH, 1980). Os tratamentos consistiram, portanto, de quatro dosagens hormonais com três intervalos de aplicações. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 4 x 3 (dose x tempo), com quatro repetições, em 12 tratamentos, mantendo-se um casal de rã para cada unidade. Resultados e Discussão A eficiência do estímulo hormonal foi claramente comprovada quando se observou que nenhuma das testemunhas desovou, seja espontaneamente ou mediante a compressão das paredes lateral e ventral do corpo (desova forçada) (Tabelas 3 e 4 e Figuras 1 e 2), assim como pela viabilidade dos ovócitos maduros liberados pelas fêmeas que receberam as dosagens de EBH, uma vez que o índice de fecundação foi da ordem de 85%, sendo que não ocorreu mortalidade nos animais submetidos aos diferentes tratamentos. Os resultados mostraram que todas as dosagens de EBH utilizadas induziram a desova em todos os tratamentos. Entretanto, pode-se observar que houve diferenças na freqüência de desova entre os tratamentos. Os melhores resultados foram verificados nos tratamentos 7 e 12, que obtiveram 100% de desova espontânea e nos tratamentos 8, 9, 10 e 11, que também obtiveram 100% de desova, considerando-se as espontâneas e as forçadas. A obtenção de desovas mediante a compressão das paredes lateral e ventral do corpo (forçada) só ocorreu a partir do tratamento 4, coincidindo com o aumento da dosagem de EBH aplicada (3 mg/kg). A menor dosagem utilizada (1 mg/kg) resultou na menor freqüência de desovas, pois somente um animal desovou em cada tratamento (1, 2 e 3); nem mesmo a utilização do método de desova forçada para esses tratamentos melhorou o índice de desova. A quantidade de ovócitos observada por fêmea manteve-se de acordo com a literatura (FONTANELLO et al., 1984). As diferenças das respostas obtidas com os animais nos tratamentos 1 a 6 podem ter acontecido em virtude das variações dos graus de maturação gonadal em que esses animais se encontravam, no momento em que receberam o estímulo hormonal. Assim, possivelmente, alguns animais estavam mais sensíveis à ação hormonal do que outros. Tabela 1 - Tratamentos, dosagens de EBH, dosagem total e número de repetições para fêmeas de rã-touro Table 1 - Treatments, CHE dosages, total dosage and number of replications per bull frog females Tratamento Dosagem (mg/kg) Intervalo entre Dosagem total Repetição Treatment Dosage dosagens (h) (mg/kg) Replicate 1 a aplicacão 2 a aplicacão Interval among doses Total dosage 1 st application 2 nd application 1 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,7 4

4 Tabela 2 - Tratamentos, dosagens de EBH e número de repetições usadas para machos de rã-touro Table 2 - Treatments, CHE dosage and number of replications per bull frog males Tratamento Dosagem única (mg/kg) Repetição Treatment One dose Replicate 1 0, , , , , , , , , , , ,5 4 RIBEIRO FILHO et al. 661 A não-ocorrência de desova em alguns tratamentos, que pode ter acontecido em razão da dosagem de EBH, não foi o suficiente para estimular a reprodução dos animais. RUGH (1935), trabalhando com rã-touro, afirmou que a dose necessária para provocar a ovulação da rã decresce, à medida que se aproxima a época da desova natural e os ovários reagem diferentemente ao mesmo estímulo conforme a época do ano. Segundo MARTINS (1936), os resultados negativos, obtidos em muitas tentativas de indução da reprodução, não estão relacionados com a especificidade zoologica, mas sim com outros fatores, como menor concentração de hormônios gonadotróficos presentes nas hipófises e variação Tabela 3 - Percentual da resposta ao estímulo hormonal de Rã-touro submetida a diferentes tratamentos Table 3 - Percentage of bull frog response to the hormonal stimulus, subbmited to different treatments Tratamento Intervalo entre doses Desova espontânea (%) Desova forçada (%) Forçada + Espontânea (%) Treatment Interval among doses Free spawning Forced spawning Forced + Free Testemunho Todos Tabela 4 - Valores médios em percentual da resposta de rã-touro ao estímulo hormonal em diferentes dosagens Table 4 - Percentage average values of bull-frog response to the hormonal stimulus in different dosages Dosagem (mg/kg) Intervalo de doses Desova espontânea (%) Desova forçada (%) Desova forçada + espontânea (%) Dosage Interval of doses Free spawning Forced spawning Forced spawning + free spawning 1 6,12,18 25,00 0,00 25,00 3 6,12,18 41,66 25,00 66,66 5 6,12,18 83,33 16,67 100,00 7 6,12,18 50,00 50,00 100,00 T 6,12,18 0,00 0,00 0,00

5 662 R.Bras.Zootec. % de ovolução % of ovulation Figura 1 - Figure 1 - % de ovolução % of ovulation Forçada Espontânea T Tratamentos Treatment Freqüência de desova induzida de rã-touro submetida a diferentes tratamentos. Induced spawning frequency of bull frog for different treatments. Forçada Espontânea T Dosagens Dosagem (mg/kg) Dosage Figura 2 - Valores médios da freqüência de desovas induzidas de rã-touro submetida a diferentes doses de extrato bruto hipofisário. Figure 2 - Average values of induced spawning frequency of bull frog for different crude extract hypophyseal doses. quantitativa dos diferentes componentes do complexo hormonal da hipófise anterior, cuja influência é exercida reciprocamente sobre as gônadas e em outros locais de atuação. Conforme o exposto acima, pode-se inferir que as gônadas das fêmeas que não responderam às injeções de extrato bruto hipofisário não se encontravam no momento fisiológico ideal para que ocorresse resposta positiva à indução realizada. As análise estatísticas dos intervalos de tempo indicaram não haver efeito entre eles. A ovulação não foi influenciada pelo fator intervalo de tempo, e sim pela dosagem utilizada. Conclusões O método de desova induzida utilizado foi efetivo para provocar a ovulação de rã-touro. Todas as dosagens provocaram desovas em maior ou menor intensidade. Os resultados obtidos indicam que a menor dosagem que refletiu o maior índice de sucesso foi de 5 mg/kg. As dosagens mostraram-se independentes de intervalo de tempo de aplicação, podendo ser utilizado o intervalo de seis horas, pela facilidade no manejo. O método de indução à desova irá colaborar na redução no número de reprodutores do plantel, no controle da reprodução, no melhoramento genético dos animais, assim como no aumento da freqüência de desovas anuais. Referências Bibliográficas COSTA, C.L.S. Desenvolvimento do aparelho reprodutor e fatores associados ao ciclo reprodutivo da rã-touro Rana catesbeiana, no Sistema Anfigranja. Viçosa, MG: UFV, p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Universidade Federal de Viçosa, CULLEY, JR. Use of bull-frog in biological research. An. Zool., v.13, p.85-90, CULLEY JR., D.D., GRAVOIS JR., C. Recent development in frogculture. In: ANNUAL CONFERENCE SOUTHEASTERN ASSOCIATION OF GAME AND FISH COMISSIONERS, 25, Charleston. Proceedings... Charleston, s.ed., n.p. CULLEY JR., D.D., HORSEMAN, N.D., AMBOESKI, R.L., MEYERS, S.P. Current status of amphibian with emphasis on nutrition, diseases and reproduction of the bulfrog Rana catesbeiana. In: ANNUAL MEETING OF THE WORLD MARICULTURE SOCIETY, Atlanta. Proceedings... Atlanta, s.ed., n.p. FERRAZ de LIMA, J.A., CAROLSFELD, J., RAMOS, S.M., ALCÂNTARA, R.C., RAMOS, R.O. Uso de ovaprim (Combinação de um antagonista da Dopamina (Domperidona) mais um análogo do hormônio liberador de gonadotropina de salmão (sgnrh-a) na indução da desova do pacu (Piaractus mesopotamicus) criado em cativeiro. Bol. Téc. Cepta, v. 1, n.2, p.1-9, FONTANELLO, D., SOARES, H.A., MANDELLI JR., J. et al. Estação de reprodução da Rana catesbeiana Shaw, 1802, criadas em ranário comercial e a influência de fatores climáticos sobre o número de desovas. Bol. Inst. Pesca, v.11, p , HOAR, W.J., HICKMAN, C.P. A laboratory companion for general and comparative physiology. Englewood Cliffs,

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