Avaliação in vitro do antagonismo de BPCPs ao Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici

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1 Avaliação in vitro do antagonismo de BPCPs ao Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici Fernanda Campos Alencar 1 ; Ana Karolina L. Pais 1 ; Mariana K. B. Nascimento 1 ; Helrijesus Alves Lima 1 ; Cristiane Domingos da Paz 1 ; Ana Rosa Peixoto 1. 1 UNEB Universidade do Estado da Bahia, Avenida Dr. Chastinet Guimarães S/N, Bairro São Geraldo, Juazeiro-BA, nandinhacampos02@hotmail.com, krolzinha_leite@hotmail.com, marianakbn@gmail.com, helrijesus@hotmail.com, dapazcd@yahoo.com, anarpeixoto@gmail.com RESUMO O controle biológico tem sido estudado como uma alternativa viável para o controle de doenças de plantas, sendo considerada uma alternativa vantajosa em relação ao controle químico, principalmente quanto ao impacto ambiental, ao custo e à especificidade e ao desenvolvimento de resistência. Diante disso, o presente trabalho teve por objetivo avaliar in vitro o antagonismo de BPCPs ao Fusarium oxysporum f. sp. lycopercisi. Os isolados bacterianos foram obtidos da coleção de bactérias do Laboratório de Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, já as raças (1, 2, 3 e Belém) de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici foi cedida pela Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), localizada em Belém de São Francisco PE. Avaliou-se o crescimento fúngico nas proximidades das colônias bacterianas, por meio de observações das características do crescimento dos microrganismos e comparação com as placas-controle. Quando as placas-controle encontravam-se totalmente colonizadas, as medições do diâmetro das colônias de F. oxysporum f. sp. lycopersici foram suspensas. Os valores médios de percentagens de inibição foram obtidos em relação ao crescimento da testemunha. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 5 tratamentos, representados pelos isolados mais testemunha para cada um dos 4 isolados (R1, R2, R3 e RB) e quatro repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5%). Os resultados demonstraram que em meio BDA o isolado C116 apresentou antagonismo às raças R1, R2 e RB do F. oxysporum f. sp. lycopersici. em relação à testemunha, demonstrando o seu potencial de inibição. Em meio NYDA o isolado C116 inibiu o crescimento da raça R2. Diante disso, pode-se observar que trabalhos com BPCPs podem ser uma alternativa para utilização do controle biológico em culturas, minimizando o dano ambiental comparado aos produtos químicos. PALAVRAS-CHAVE: controle biológico, BPCPs, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. ABSTRACT Antagonism in vitro of PGPR against Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici Biological control has been studied as a viable alternative for the control of plant diseases and is considered an advantageous alternative in relation to chemical control, especially regarding the environmental impact, cost, specificity and the development of resistance. Thus, the present study was to evaluate in vitro the antagonism of BPCPs to Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici (Fol). The bacterial isolates were obtained from the collection of bacteria in the laboratory at the Universidade Federal Rural de Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 185

2 Pernambuco - UFRPE, since the races (1, 2, 3 and Belém) of Fusarium was provided by Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), located in Belém do São Francisco.- PE. It was evaluated the fungal growth challenged with bacterial colonies by means of observations of growth characteristics of the microorganisms and compared with control. When the control plates were completely colonized, measurements of the diameter of colonies of Fol were suspended. The mean percentages of inhibition were obtained in relation to the growth control. The experimental design was completely randomized with five treatments represented by isolates and control, and four races of pathogens (R1, R2, R3 and RB) using four replicates. The data were submitted to ANOVA and means compared by Tukey test (5%). The results showed that in medium NYDA, isolate C116 showed antagonism to the races R1, R2 and RB of the pathogen compared with the control, demonstrating their potential for inhibition. In PDA medium the isolate C116 inhibited the growth of the race R2. Thus, it can be seen that the use of BPCPs can be an alternative to biological control in crops, and this technology may reduce the environmental damage compared to chemicals. Key words: biological control, PGPR, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. O tomateiro (Solanum lycopersicun L.) é originário da América do Sul, mais precisamente na faixa costeira andina onde estão Chile, Peru e Equador (FONTES E DA SILVA, 2002). É importante economicamente, pelo valor de produção e socialmente, pelos empregos diretos e indiretos que gera, e ainda pelo valor nutritivo, por ser rico em vitamina A, complexo B, glicose, frutose, lipídeo, proteína e sais minerais como: fósforo, cálcio, potássio e magnésio (MAKISHIMA, 2003). O cultivo do tomate sempre foi prejudicado pela ocorrência de doenças, pré e póscolheita, dentre as quais destacam-se aquelas causadas por vírus, fungos, bactérias e nematóides (MORGADO et al., 1994). De acordo com Bettiol (2008), a preocupação da sociedade com o impacto da agricultura no ambiente e a contaminação da cadeia alimentar com agrotóxicos está alterando o cenário agrícola, resultando em mercados de alimentos produzidos sem o uso de agrotóxicos ou aqueles com selos que garantem que os agrotóxicos foram utilizados adequadamente. Dentre as alternativas para a redução do uso de agrotóxicos o controle biológico tem sido uma das mais discutidas. O controle biológico tem se apresentado eficiente e viável para o manejo de várias culturas por minimizar o dano ambiental e ser mais vantajoso economicamente comparado aos métodos químicos convencionais (COIMBRA 2005). Neste contexto, a procura por microrganismos benéficos, agentes de controle biológico, como alternativa para aumentar a produtividade de plantas e melhorar seu estado fitossanitário, vem sendo um dos principais objetivos da pesquisa agrícola nas ultimas décadas. O controle biológico não contamina, não desequilibra o meio ambiente e nem deixa resíduos, além de ser Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 186

3 barato e de fácil aplicação (SOARES, 2006; BETTIOL, 2009). Dentre os microrganismos com potencial para agentes de controle biológico, destacam-se as bactérias promotoras de crescimento em plantas (BPCPs), que habitam a rizosfera. As BPCPs fazem parte da população residente das plantas como epifíticas ou endofíticas e não são fitopatogênicas (MARIANO et al., 2004). As BPCP podem exercer o controle biológico de doenças de plantas através de um ou mais mecanismos tais como antibiose, produção de ácido cianídrico, sideróforos, indução de resistência e enzimas que degradam a parede celular como pectinase, celulase e -1,3-glucanase (Kloepper et al., 1999), além de parasitismo (Luz, 1996), produção de ácido salicílico (Press et al., 1997) e competição por ácidos graxos (Van Dirk & Nelson, 2000). MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Fitopatologia, localizado no Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais DTCS, da Universidade do Estado da Bahia UNEB, Campus III, Município de Juazeiro BA, no período de abril a maio de Os isolados bacterianos foram obtidos da coleção de bactérias do Laboratório de Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE, sendo provenientes de diferentes órgãos vegetais (Tabela 1). As BPCPs estavam conservadas em tubos criogênicos contendo Água Destilada Esterilizada ADE. Os isolados bacterianos foram utilizados pelo método de riscas, em três placas de Petri em meio nutritivo Ágar-dextrose-extrato de levedura- NYDA (MARIANO, et al., 2005). A obtenção das raças (1, 2, 3 e Belém) de F. oxysporum f. sp. lycopersici foi cedida pela Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), localizada em Belém de São Francisco PE, cidade no Sertão do estado de Pernambuco. Os isolados fúngicos foram cultivados em meio BDA (Batata, Dextrose e Ágar), e em seguida, mantidos em incubação durante oito dias. Com auxílio da alça de platina foi retirado um pouco do crescimento bacteriano e feito uma risca no centro da placa, em seguida, foram retirados discos contendo estruturas das extremidades da colônia do fungo. Os discos foram pareados com o crescimento bacteriano em dois arranjos. A avaliação da ocorrência de antagonismo foi observado após 2 dias em quatro repetições por tratamento, através de Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 187

4 medições do diâmetro (cm), feitas por uma régua milimetrada, observando o crescimento vegetativo micelial das colônias de F. oxysporum f. sp. lycopersici nos meios NYDA e BDA, em placas com ambos os organismos e placas-controle (testemunhas), apenas com a colônia do fungo. Avaliou-se o crescimento fúngico nas proximidades das colônias bacterianas, por meio de observações das características do crescimento dos microrganismos e comparação com as placas-controle. Quando as placas-controle encontravam-se totalmente colonizadas, as medições do diâmetro das colônias de F. oxysporum f. sp. lycopersici foram suspensas. Os valores médios de percentagens de inibição foram obtidos em relação ao crescimento da testemunha. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 10 tratamentos, cada tratamento constituído por 4 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5%). RESULTADOS E DISCUSSÃO As leituras do potencial de inibição de BPCPs ao Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici podem ser observadas nas tabelas 2 e 3. Na leitura feita em meio NYDA, o isolado C116 mostrou diferença significativa em inibir a raça R2, em relação à testemunha, confirmando o seu potencial de inibição. Para Romeiro (2007), entre os modos de ação sugeridos para o controle biológico de fitopatógenos, a produção de substâncias antimicrobianas é um mecanismo universal de antagonismo que agentes de biocontrole exibem com frequência. De forma semelhante, Shishido et al. (1195), verificaram que isolados endofíticos de Bacillus sp. e Streptomyces sp. estimularam o crescimento de mudas de coníferas, controlando os patógenos responsáveis pela inibição do crescimento destas plantas. No trabalho de Barretti et al. (2009), quarenta isolados bacterianos endofíticos de plantas sadias de tomateiro foram avaliados quanto à sua potencialidade como agentes de biocontrole de enfermidades bacteriana e fúngica do tomateiro. Uma seleção massal foi realizada em casa de vegetação, utilizando-se Pseudomonas syringae e Alternaria solani, como patógenos desafiantes; com base na média do número de lesões por planta, quatro isolados foram selecionados como potenciais agentes de biocontrole, identificados como Acinetobacter johnsonii, Serratia marcescens, Sinorhizobium sp. e Bacillus megaterium. Em meio BDA, o isolado C116 inibiu o crescimento das raças R1, R2 e Raça Belém. Diante disso, pode-se observar, Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 188

5 que trabalhos com BPCPs, podem ser uma alternativa para utilização do controle biológico em culturas, minimizando o dano ambiental comparado aos produtos químicos. REFERÊNCIAS BARRETTI, P. B.; ROMEIRO, R. S.; MIZUBUTI, E. S. G.; SOUZA, J. T. Seleção de bactérias endofíticas de tomateiro como potenciais agentes de biocontrole e de promoção de crescimento. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 33, p , BETTIOL, W. Conversão de sistemas de produção, In: Poltronieri, L.S. & Ishida, A.K.N. (Eds). Métodos alternativos de controle de insetos-praga, doenças e plantas daninhas: Panorama atual e perspectivas. Belém. Embrapa Amazônia Oriental, p BETTIOL, W.; GHINI, R.; MARIANO, R.R.L.; MICHEREFF, S.J.; MATTOS, L.P.V.; ALVARADO, I.C.M.; PINTO, Z.V. Supressividade de fitopatógenos habitantes do solo. In: BETTIOL, W., MORANDI, M. A. B. (Eds.). Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, p , COIMBRA, J.L.; CAMPOS, V.P. Efeito de exsudatos de colônias e de filtrados de culturas de actinobactérias na eclosão, motilidade e mortalidade de juvenis do segundo estádio de M. javanica. Fitopatologia Brasileira, v.30, n.3, p , FONTES, P.C.R.; DA SILVA, D.J.H. Produção de Tomate de Mesa. Aprenda Fácil Editora, Viçosa-MG, 2002, 193 páginas. Hortifruti. Disponível em: Acesso em: 06. mar KLOEPPER, J.W.; RODRÍGUEZ-KÁBANA, R.; ZEHNDER, G.W.; MURPHY, J. F.; SIKORA, E.; FERNÁNDEZ, C. Plant root-bacterial interactions in biological control of soilborne diseases and potential extension to systemic and foliar diseases. Australasian Plant Pathology, Toowoomba, v.28, n.1, p.21, LUZ, W.C. Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas e de bioproteção. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 4, p. 1-49, MARIANO, R.L.R.; SILVEIRA, E.B. Mancha aquosa: importante bacteriose do meloeiro no Brasil. Anais da Academia Pernambucana de Ciência Agronômica, Recife, v. 1, p.79-88, MARIANO, R. L. R. et al. Identifição de bactérias fitopatogênicas. In: MARIANO, R. L. R.; SILVEIRA, E. B. (Coords.). Manual de práticas em fitobacteriologia. 2. ed. Recife: Universidade Federal Rural de Pernambuco, 2005.p MAKISHIMA, N. O popular tomate. In: PROGRAMA BRASILEIRO PARA MODERNIZACAO DA HORTICULTURA. Normas de classificação do tomate. São Paulo: Centro de Qualidade em Horticultura/CEAGESP, (CQH. Documentos, 26). MORGADO, H. S.; LOPES, C. A.; TAKATSU, A. Métodos para avaliação de resistência à murcha bacteriana em berinjela. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.29, n.2, p , PRESS, C.M.; WILSON, M.; TUZUN, S.; KLOEPPER, J. W. Salicylic acid produced by Serratia marcescens is not the primary determinant of induced systemic Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 189

6 resistance in cucumber or tobacco. Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Paul, v.10, n.6, p , ROMEIRO, R.S. Controle Biológico de Doenças de Plantas Fundamentos. Viçosa:Ed. UFV, p. SHISHIDO, M.; LOEB, B. M.; CHANWAY, C. P. External and internal root colonization of lodgepole pine seedlings by two growth-promoting Bacillus strains originated from different root microsites. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v. 41, p , SOARES, A.C.F.; SOUSA, C.S.; GARRIDO, M.S.; PEREZ, J.O.; ALMEIDA, N.S. Soil estreptomyces with in vitro activity against the yam pathogens Curvularia eragrostides and Colletotrichum gloeosporioides. Brazilian Journal of Microbiology, v.37, n.4, p , VAN DIJK, K.; NELSON, E.B. Fatty-acids competition as a mechanism by which Enterobacter cloacae suppresses Pythium ultimum sporangium germination and damping-off. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v.66, n.66, p Tabela 1. Identificação dos isolados bacterianos utilizados no controle biológico. ISOLADOS IDENTIFICAÇÃO HOSPEDEIRO HABITAT C116 Bacillus pumillus Couve (Brassica oleracea) (folha) Epifítica RAB7 Bacillus megaterium Rabanete (Raphanus sativus) (folha) Epifítica RAB9 Bacillus sp. Rabanete (Raphanus sativus) (folha) Epifítica HNF15 Bacillus cereus Helicônia (Heliconia humilis) (folha) Epifítica Tabela 2. Potencial de inibição de isolados bacterianos ao Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici em meio NYDA: MEIO NYDA LEITURA TRATAMENTOS R1 RB R2 R3 RAB a 3.57 a 3.57 a 3.50 a C b 3.10 a 3.12 c 3.12 a RAB b 3.37 a 3.35 abc 3.17 a HNF ab 3.27 a 3.22 bc 3.27 a TEST ab 3.50 a 3.50 ab 3.07 a CV (%) a Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5 % de probabilidade, sendo letras minúsculas na vertical para as análises das médias dos tratamentos (isolados). Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 190

7 Tabela 3. Potencial de inibição de isolados bacterianos ao Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici em meio NYDA: MEIO BDA Leitura TRATAMENTOS R1 RB R2 R3 RAB a 3.47 a 3.62 ab 3.72 a C b 2.60 b 2.82 b 2.67 a RAB a 3.22 ab 3.37 ab 2.85 a HNF ab 3.12 ab 3.52 ab 3.47 a TEST a 3.72 a 3.90 a 3.67 a CV (%) Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5 % de probabilidade, sendo letras minúsculas na vertical para as análises das médias dos tratamentos (isolados). Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 191