Antonio Glaydson Lima Moreira *, Erivânia Gomes Teixeira, Carlos Riedel Porto Carreiro e Ricardo Lafaiete Moreira. Introdução

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1 DOI: /actascianimsci.v32i Eficácia do eugenol extraído da planta Eugenia aromatica como anestésico para realização de biometrias em adultos de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) Antonio Glaydson Lima Moreira *, Erivânia Gomes Teixeira, Carlos Riedel Porto Carreiro e Ricardo Lafaiete Moreira Departamento de Engenharia de Pesca, Universidade Federal do Ceará, Av. Mister Hull, s/n, , Fortaleza, Ceará, Brasil. *Autor para correspondência. glaydson_ufc@hotmail.com Introdução RESUMO. Os anestésicos figuram como poderosa ferramenta na aquicultura, atuando na redução do estresse e mortalidade usualmente causados pelo manejo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de eugenol em adultos de tilápia e determinar a concentração ideal para realização de uma biometria. Foram avaliadas seis concentrações (30, 60, 120, 180, 240 e 300 mg L -1 ). Para cada tratamento, 12 peixes (comprimento médio: 32,7 ± 3,0; peso médio: 557,0 ± 160 g), foram imersos individualmente na solução anestésica durante 10 min. Durante a indução anestésica, foram monitorados todos os estágios de anestesia e ao atingir o estágio de anestesia profunda, foi monitorado o número de batimentos operculares durante o minuto seguinte. Após a indução anestésica, os peixes foram transferidos para aquário contendo água sem anestésico e aferido o tempo de recuperação. A concentração de 60 mg L -1 necessitou de maior tempo para atingir o estágio desejado de anestesia profunda (206,3 segundos), enquanto a concentração de 300 g L -1 atingiu este estágio mais rapidamente (77,8 segundos). Os resultados obtidos sugerem que a concentração ideal de eugenol para realização de uma biometria é de 120 mg L -1, e, que o aumento da dosagem do anestésico, implica na diminuição dos batimentos operculares. Palavras-chave: aquicultura, piscicultura, anestesia, estresse. ABSTRACT. Efficacy of eugenol extracted from the plant Eugenia aromatica as an anesthetic for the biometry procedures in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) adults. Anesthetics represent a powerful tool in aquaculture, working to reduce stress and mortality commonly caused by handling. The objective this work was evaluate the effect of various concentrations of eugenol in adults of Nile tilapia and determine its optimal concentration for biometry procedures. Six concentrations (30, 60, 120, 180, 240 e 300 mg L -1 ) were tested. For each treatment, 12 fishes (average length: 32.7 ± 3.0; average weight: ± 160 g) were individually immersed in anesthetic solution for 10 min. All stages of anesthesia were monitored during anesthetic induction, and upon profound anesthesia the opercular beat rate was monitored for the next minute. After anesthetic induction, the fishes were transferred to an aquarium containing water without anesthetic solution, and recovery time was measured. The 60 mg L -1 concentration required more time to reach the desired stage of profound anesthesia (206.3 seconds), while the 300 g L -1 concentration reached this stage more rapidly (77.8 seconds). Results suggest that the optimal concentration of eugenol for biometry procedures is 120 mg L -1, and that increase anesthetic dosage results in reduced opercular beat rate. Key words: aquaculture, pisciculture, anaesthesia, stress. Práticas intensas de manejo, como o transporte, adensamento, mudanças na qualidade da água, temperatura e salinidade favorecem uma série de fatores estressantes aos peixes (VIDAL et al., 2008). Os anestésicos surgiram como uma ferramenta importante na aquicultura, pois tanto reduzem a mortalidade (FAÇANHA; GOMES, 2005), como o estresse causado pelo manejo (PALIC et al., 2006). Anestésicos sintéticos já são bastante conhecidos e utilizados nas pisciculturas, entretanto estas substâncias químicas são tóxicas e onerosas (ROUBACH et al., 2001). Desta forma, justifica-se a necessidade de se buscar alternativas seguras para procedimentos de anestesia em peixes, o que servirá como subsídio para as autoridades responsáveis, pois no Brasil, ainda não há este tipo de regulamentação. Pesquisas que utilizam anestésicos naturais vêm aumentando consideravelmente nos últimos anos.

2 420 Moreira et al. Gonçalves et al. (2008) utilizaram o mentol para anestesiar pacu (Piaractus mesopotamicus), este mesmo anestésico foi utilizado em tambaqui (Colossoma macropomum) por Façanha e Gomes (2005). O óleo de cravo já é bem mais difundido, contendo diversos trabalhos na literatura (COOKE et al., 2004; FRISCH et al., 2007; GUÉNETTE et al., 2007; WEBER et al., 2009). O uso do óleo de cravo como anestésico é fato recente no setor aquícola, sendo considerado um método eficaz para eutanásia em peixes (RIBAS et al., 2007). Pode ser obtido pela destilação do extrato de partes de planta (folhas, caules e raízes) da árvore Eugenia caryophyllata e Eugenia aromatica (CUNHA; ROSA, 2006), sendo o eugenol seu principal produto. Este óleo possui características que o classifica como um anestésico seguro, a exemplo, baixo custo, boa margem de segurança para os peixes (PARK et al., 2008) e falta de toxicidade para seres humanos (IVERSEN et al., 2003; KEENE et al., 1998). Além dessas vantagens, o óleo de cravo é rapidamente metabolizado e excretado (WAGNER et al., 2002). Diferentes anestésicos exigem concentrações distintas para atingir o estágio de anestesia desejado (ROUBACH; GOMES, 2001). Além disso, animais da mesma espécie, porém de tamanho diferente, também exigirão tempos distintos para alcançarem determinado estágio de anestesia. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de eugenol em adultos de tilápia e determinar a concentração ideal para a realização de uma biometria. Material e métodos Foram utilizados 72 espécimes com comprimento médio total de 32,7 ± 3,0 cm, pesando em média 557,0 ± 160 g, de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), variedade Chitralada, pertencentes ao plantel do Centro de Pesquisas em Aquicultura Rodolpho von Ihering CPA/DNOCS, localizado em Pentecoste, Estado do Ceará. Os peixes foram aclimatados em tanques de alvenaria e alimentados ad libitum duas vezes ao dia com ração comercial (28% PB). A alimentação foi cessada 24h antes procedimento experimental. O eugenol (Sigma ) foi diluído em álcool PA, resultando em uma solução estoque 1000 mg ml -1. Para a indução anestésica, foi utilizado um aquário com volume útil de 250 L, sendo utilizado 100 L de água. Foram realizados seis tratamentos com concentrações de 30, 60, 120, 180, 240 e 300 mg L -1, visando determinar a influência das diferentes concentrações de eugenol, na indução anestésica e na posterior recuperação. Para cada concentração testada, foram imersos individualmente, 12 peixes. Durante a exposição de 10 min., foram observados os diferentes estágios de anestesia conforme os critérios propostos por Ross e Ross (2008). A descrição de cada estágio encontra-se na Tabela 1. O tempo necessário para atingir cada estágio foi aferido com auxílio de um cronômetro digital. Depois de anestesiados, os peixes foram removidos da solução anestésica e transferidos para as caixas circulares de fibra (310 L), com renovação constante de água (150 L h -1 ), para monitoramento da recuperação. O peixe foi considerado recuperado ao retorno de seu equilíbrio normal e com sua natação ativa, sendo o tempo necessário para a recuperação novamente aferido. Após o experimento, todos os indivíduos foram monitorados por 24h para observar a taxa de sobrevivência. Para avaliar o efeito das concentrações de anestésico sobre o batimento opercular dos peixes, ao atingir estágio IV (anestesia profunda), foi registrada a frequência de batimento opercular durante o minuto seguinte. Os dados foram analisados por meio da Análise de Variância (Fator Único - ANOVA) e quando encontradas diferenças significativas entre as médias foi aplicado o teste de Tukey. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa BIOESTAT versão 5.0 em nível de significância de 5%. Resultados e discussão Não foi registrada mortalidade durante todo o procedimento experimental. Os dados referentes ao tempo de indução anestésica e de recuperação dos adultos de tilápia expostos a diferentes concentrações de eugenol encontram-se na Tabela 2. Tabela 1. Estágios de anestesia em peixes. * Estágio Descrição Resposta comportamental em peixes 0 Normal Reativos a estímulos externos; batimentos operculares normais; reação muscular normal. I Sedação leve Reativos a estímulos externos; movimentos reduzidos, batimentos operculares mais lentos; equilíbrio normal. II Sedação profunda Perda total da reatividade aos estímulos externos, exceto forte pressão; leve queda do movimento opercular; equilíbrio normal. III Narcose Perda parcial do tônus muscular; natação errática, aumento dos movimentos operculares; reativos apenas a forte estímulo tátil ou vibração. IV Anestesia profunda Perda total de tônus muscular; perda total de equilíbrio; batimento opercular lento, porém regular. V Anestesia cirúrgica Ausência total de reação, mesmo a forte estímulo; movimentos operculares lentos e irregulares; batimentos cardíacos lentos; perda total de todos os reflexo. VI Colapso medular Parada da ventilação; parada cardíaca; morte eventual. *Modificado de Ross e Ross (2008).

3 Anestésico natural para a tilápia 421 Tabela 2. Eventos comportamentais (em segundos) de adultos de tilápia do Nilo expostos a diferentes concentrações de eugenol. Médias seguidas pela mesma letra em coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p > 0,05). Dose (mg L -1 ) Evento comportamental (segundos) Estágio I Estágio II Estágio III Estágio IV Estágio V Recuperação 30 60,8 ± 5,9 a 174,2 ± 16,7 a 339,7 ± 25,7 a * * * 60 37,4 ± 2,0 b 75,9 ± 3,6 b 115,6 ± 5,2 b 206,3 ± 15,5 a 421,2 ± 26,4 a 360,8 ± 24,5 b,c ,8 ± 2,3 b,c 60,6 ± 4,7 b,c 102,6 ± 5,6 b,c 186,2 ± 20,9 a,b 356,2 ± 33,4 a,b 393,2 ± 31,0 b,c ,9 ± 1,7 b,c 57,1 ± 1,8 b,c 86,8 ± 2,4 b, c,d 147,2 ± 11,2 b,c 302,5 ± 28,1 b 519,8 ± 48,3 a,b ,4 ± 0,7 c 45,8 ± 1,7 b,c 74,6 ± 2,7 c,d 97,3 ± 5,2 c,d 163,0 ± 9,5 c 357,1 ± 23,6 c ,6 ± 2,0 c 38,1 ± 2,6 c 53,8 ± 2,5 d 77,8 ± 4,2 d 129,9 ± 8,4 c 652,5 ± 61,0 a *Estágio não alcançado. Segundo Park et al. (2009a), a concentração ótima de anestésico deve minimizar os impactos negativos do manejo, reduzir o estresse nos peixes, produzir anestesia em período menor ou igual a 3 min. e permitir uma recuperação num prazo máximo de 10 min. Para um procedimento de manejo, o estágio mais adequado é o de anestesia profunda, pois neste estágio o peixe fica completamente imóvel pela à perda do tônus muscular e do equilíbrio. Seguindo as recomendações dos autores citados, a concentração ideal de eugenol, encontrada no presente trabalho, para procedimentos de biometria para adultos de tilápia do Nilo foi de 120 mg L -1. Peixes expostos durante 10 min. à concentração de 30 mg L -1, atingiram somente o estágio de narcose. Para os demais tratamentos, todos os estágios de anestesia foram alcançados. Foi observado que os peixes somente necessitavam de recuperação após atingirem o estágio de anestesia profunda. Indivíduos anestesiados até o estágio de narcose voltavam a nadar ativamente e mantinham seu equilíbrio imediatamente após a imersão no aquário de recuperação que continha água sem solução anestésica. A concentração de 60 mg L -1 foi o tratamento que necessitou de maior tempo para atingir o estágio desejado de anestesia profunda (206,3 segundos), contudo não houve diferença significativa (p > 0,05) em relação à concentração de 120 mg L -1. Usando esta mesma dosagem de eugenol, Hisano et al. (2008) anestesiaram juvenis de dourado, Salminus brasiliensis, em 88 segundos. Enquanto que a concentração de 300 mg L -1 foi o tratamento que atingiu este estágio mais rapidamente (77,8 segundos), não havendo diferença significativa (p > 0,05) com a concentração de 240 mg L -1. Resultado semelhante (67,5 segundos) foi encontrado por Park et al (2008), quando anestesiaram garoupas (105,3 ± 11,43 g; 16,1 ± 1,48 cm), Epinephelus bruneus, com 300 mg L -1 de eugenol. Os peixes submetidos às menores concentrações levaram mais tempo para atingir os estágios anestésicos. Este comportamento também foi avaliado por Cunha e Rosa (2006) anestesiando sete diferentes espécies de peixes marinhos utilizando eugenol. Walsh e Pease (2002) corroboram esta afirmativa em seus estudos quando anestesiaram enguias, Anguilla reinhardtii, utilizando o mesmo anestésico. Quanto ao tempo de recuperação, apenas a concentração de 300 mg L -1 (652,5 segundos) ultrapassou o tempo recomendado de 10 min., entretanto esta concentração não diferiu estatisticamente (p > 0,05) da concentração de 180 mg L -1. O menor tempo de recuperação foi verificado para 240 mg L -1 (357,1 segundos), no entanto, este tratamento não teve diferença estatística (p > 0,05) com as concentrações de 60 e 120 mg L -1. Park et al. (2009a), avaliando o efeito do óleo de cravo em rock bream (139,5 ± 39,24 g; 14,8 ± 1,66 cm), Oplegnathus fasciatus, observaram diferença estatística para o tempo de recuperação nas concentrações de 50, 75, 100, 125 e 150 mg L -1, ocorrendo diferença entre todas as concentrações testadas. Em relação aos batimentos operculares, não foi possível realizar a contagem no tratamento de 30 mg L -1, pois os indivíduos não atingiram o estágio alvo para a realização da contagem (anestesia profunda). Os dados referentes à frequência dos batimentos operculares dos adultos de tilápia do Nilo expostos a diferentes concentrações de eugenol encontram-se na Figura 1. Batimentos operculares min a a,b a,b b,c Concentrações de eugenol (mg L -1 ) Figura 1. Valores médios da taxa de ventilação opercular (batimentos min. -1 ) em adultos de tilápia do Nilo expostos as diferentes concentrações de eugenol após atingirem o estágio IV (anestesia profunda). c

4 422 Moreira et al. O maior número de batimentos operculares (53,4 batimentos min. -1 ) foi verificado para 60 mg L -1, não diferindo estatisticamente (p > 0,05) com 120 mg L -1 (49,8 batimentos min. -1 ) e 180 mg L -1 (50,3 batimentos min. -1 ). O tratamento de 300 mg L -1 obteve o menor número de batimentos operculares (44,9 batimentos min. -1 ), não diferindo com 240 mg L -1 (49 batimentos minuto -1 ) e diferindo das demais concentrações (p < 0,05). Neste sentido, Park et al. (2009b) avaliaram a taxa de ventilação da solha do inverno (Pleuronectes americanus) com peso médio de 16,3 ± 0,2 g. Os autores também observaram os movimentos operculares ao simular o transporte dos animais durante 5h expostos ao anestésico lindocaína hidroclorídrico. Os resultados indicaram que a partir de 4h de transporte não houve diferença significativa (p > 0,05) na frequência de batimentos operculares entre as concentrações testadas: 5, 10 e 15 mg L -1. Mylonas et al. (2005) avaliaram os batimentos operculares de juvenis de European sea bass (Dicentrarchus labrax) e gilthead sea bream (Sparus aurata), submetidos à exposição de óleo de cravo (25 e 40 mg L -1 ) e de 2-fenoxietanol (350 e 400 mg L -1 ) em duas temperaturas diferentes (15 e 25 C), e concluíram que a frequência de batimentos operculares foi semelhante em ambas as espécies antes da exposição aos anestésicos, e que a frequência de batimentos operculares diminuíam com o aumento da concentração. Estes relatos corroboram os resultados registrados neste trabalho. Conclusão O eugenol é um eficiente anestésico para adultos de tilápia do Nilo, sendo a concentração de 120 mg L -1 considerada ideal para realização de uma biometria, de acordo com os critérios adotados. Elevadas dosagens de anestésico produzem efeito no batimento opercular dos peixes, sendo este inversamente proporcional à concentração de eugenol. Agradecimentos Os autores, sinceramente, agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Capes e à Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico Funcap, pelo apoio financeiro concedido durante a pesquisa e ao Centro de Pesquisa em Aquicultura do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), Pentecoste, Estado do Ceará, pelo apoio logístico. Referências COOKE, S. J.; SUSKI, C. D.; OSTRAND, K. G.; TUFTS, B. L.; WAHL, D. H. Behavioral and physiological assessement of low concentrations of clove oil anaesthetic for handling and transporting largemouth bass (Micropterus salmoides). Aquaculture, v. 239, n. 1-4, p , CUNHA, F. E. A.; ROSA, I. L. Anaesthetic effects of clove oil on seven species of tropical reef teleosts. Journal of Fish Biology, v. 69, n. 5, p , FAÇANHA, M. F; GOMES, L. C. A eficácia do mentol como anestésico para tambaqui (Colossoma macropomum, Characiformes: Characidae). Acta Amazonica, v. 35, n. 1, p , FRISCH, A. J.; ULSTRUP, K. E.; HOBBS, J. P. A. The effects of clove oil on coral: An experimental evaluation using Pocillopora damicornis (Linnaeus). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, v. 345, n. 2, p , GONÇALVES, A. F. N.; SANTOS, E. C. C.; FERNANDES, J. B. K.; TAKAHASHI, L. S. Mentol e eugenol como substitutos da benzocaína na indução anestésica de juvenis de pacu. Acta Scientiarum. Animal Science, v. 30, n. 3, p , GUÉNETTE, S. A.; UHLAND, F. C.; HÉLIE, P.; BEAUDRY, F.; VACHON, P. Pharmacokinetics of eugenol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, v. 266, n. 1-4, p , HISANO, H.; ISHIKAWA, M. M.; FERREIRA, R. A.; BULGARELLI, A. L. A.; COSTA, T. R.; PÁDUA, S. B. Tempo de indução e de recuperação de dourados Salminus brasiliensis (Cuvier, 1816), submetidos a diferentes concentrações de óleo de cravo Eugenia sp. Acta Scientiarum. Biological Sciences, v. 30, n. 3, p , IVERSEN, M.; FINSTAD, B.; McKINELY, R. S.; ELIASSEN, R. A. The efficacy of metomidate, clove oil, Aqui-S TM and Benzoak as anaesthetics in Atlantic salmon (Salmo salar L.) smolts, and their potential stress-reducing capacity. Aquaculture, v. 221, n. 1-4, p , KEENE, J. L.; NOAKES, D. L. G.; MOCCIA, R. D.; SOTO, C. G. The efficacy of clove oil as an anaesthetic for rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Aquaculture Research, v. 29, n. 2, p , MYLONAS, C. C.; CARDINALETTI, G.; SIGELAKI, I.; POLZONETTI-MAGNI, A. Comparative efficacy of clove oil and 2-phenoxyethanol as anesthetics in the aquaculture of European sea bass (Dicentrarchus labrax) and gilthead sea bream (Sparus aurata) at different temperatures. Aquaculture, v. 246, n. 1-4, p , PALIC, D.; HEROLT, D. M.; ANDREASEN, C. B.; MENZEL, B. W.; ROTH, J. A. Anesthetic efficacy of tricaine methanesulfonate, metomidate and eugenol: Effects on plasma cortisol concentration and neutrophil function in fathead minnows (Pimephales promelas Rafinesque, 1820). Aquaculture, v. 254, n. 1-4, p , PARK, M. O.; HUR, J. W.; IM, S. Y.; SEOL, D. W.; LEE, J.; PARK, I. S. Anaesthetic efficacy and physiological

5 Anestésico natural para a tilápia 423 responses to clove oil-anaesthetized kelp grouper Epinephelus bruneus, Aquaculture Research, v. 39, n. 8, p , PARK, M. O.; IM, S. Y.; SEOL, D. W.; PARK, I. S. Efficacy and physiological responses of rock bream, Oplegnatus fasciatus to anesthetization with clove oil. Aquaculture, v. 287, n. 3-4, p , 2009a. PARK, I. S.; PARK, M. O.; HUR, J. W.; KIM, D. S.; CHANG, Y. J.; KIM, Y. J.; PARK, J. Y.; JOHNSON, S. C. Anesthetic effects of lidocaine-hydrochloride on water parameters in simulated transport experiment of juvenile winter flounder, Pleuronectes americanus. Aquaculture, v. 294, n. 1-2, p , 2009b. RIBAS, L.; FLOS, R.; REIG, L.; MACKENZIE, S.; BARTON, B. A.; TORT, L. Comparison of methods for anaesthetizing Senegal sole (Solea senegalensis) before slaughter: Stress responses and final product quality, Aquaculture, v. 269, n. 1-4, p , ROSS, L. G.; ROSS, B. Anaesthetic and sedative techniques for aquatic animals. 3rd ed. Oxford: Blackwell Science, ROUBACH, R.; GOMES, L. C. O uso de anestésicos durante o manejo de peixes. Panorama da Aquicultura, v. 11, n. 66, p , ROUBACH, R.; GOMES, L. C.; VAL, A. L. Safest level of tricaine methanesulfonate (MS222) to induce anesthesia in juveniles matrinxã, Brycon cephalus. Acta Amazônica, v. 31, n. 1, p , VIDAL, L. V. O.; ALBINATI, R. C. B.; ALBINATI, A. C. L.; LIRA, A. L.; ALMEIDA, T. R.; SANTOS, G. B. Eugenol como anestésico de tilápia-do-nilo. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 43, n. 8, p , WAGNER, E.; ARNDT, R.; HILTON, B. Physiological stress responses, egg survival and sperm motility of rainbow trout broodstock anesthetized with clove oil, tricaine methanesulfonate or carbon dioxide. Aquaulture, v. 211, n. 1-4, p , WALSH, C. T.; PEASE, B. C. The use of clove oil as an anaesthetic for the longfinned eel, Anguilla reinhardtii (Steindachner). Aquaculture Research, v. 33, n. 8, p , WEBER, R. A.; PELETEIRO, J. B.; GARCIA MARTIN, L. O.; ALDEGUNDE, M. The efficacy of 2-phenoxyethanol, metomidate, clove oil and MS-222 as anaesthetic agents in the Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup 1858). Aquaculture, v. 288, n. 1-2, p , Received on April 14, Accepted on September 1, License information: This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.