RELAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO CROMOSSÔMICO (BANDA NOR) E A PROLIFICIDADE NA ESPÉCIE SUÍNA

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1 ARS VETERINARIA, 15(3): , RELAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO CROMOSSÔMICO (BANDA NOR) E A PROLIFICIDADE NA ESPÉCIE SUÍNA (RELATIONSHIP AMONG CHROMOSOMAL POLYMORFISM (NOR BAND) AND PROLIFICITY IN SWINE) M.I.M. MARTINS 1, P.H. FRANCESCHINI 2, I. WENTZ 3 RESUMO O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer uma relação entre polimorfismos cromossômicos (Banda NOR) e índices de produção (prolificidade). Foram utilizados dez reprodutores adultos, cinco da raça Landrace e cinco da raça Wessex, os índices de prolificidade, para cada reprodutor, foram mensurados através do número de leitões nascidos vivos por leitegada, de seis fêmeas com características reprodutivas semelhantes, cobertas duas vezes com intervalo de 12 horas, num total de 60 matrizes, todas de mesma raça (Landrace). A colheita do sêmen foi realizada através do método da mão-enluvada com uma fêmea em cio como manequim, o sêmen foi analisado quanto ao volume, motilidade espermática, vigor, grau de aglutinação, concentração e morfologia espermática. Para a análise citogenética dos animais foi colhido sangue da veia cava. A realização dos cariótipos seguiu a técnica descrita por PINHEIRO (1983), e a análise de Banda NOR foi baseada no método descrito por HOWELL & BLACK (1980). Foram analisadas pelo menos 11 metáfases de cada animal. Os resultados obtidos mostraram que os animais envolvidos no estudo apresentaram uma semelhança em relação aos aspectos reprodutivos. Detectou-se polimorfismo cromossômico (Banda NOR) em apenas um animal, mas não foi possível estabelecer uma relação com a prolificidade. PALAVRAS-CHAVE: suínos, polimorfismo cromossômico, Banda NOR, prolificidade. SUMMARY The present work was designed to evaluate chromosomal polymorphism (NOR Band) and prolificity index achieved on natural mating. The samples were obtained from ten sexually mature boars ( five Landrace and five Wessex breeds). The individual prolificity index was assessed by the number of live born farrowing/litter from six sows (with similar reprodutive traits) mated twice to each boar at 12h intervals. The semen collection was performed by the use of the gloved-hand tecnique and mount on an estrous female. The semen evaluation was based upon volume, morphology, motility, progressive motility, concentration and agglutination. For the cytogenetics studies, the blood samples were collected from cranial vena cava. The karyotypes were performed according to the method described by PINHEIRO (1983) and the NOR Band analysis according to HOWELL & BLACK (1980). At least 11 mataphases were analysed per boar. The results obtained showed that the animals employed in this study presented some homogeneity regarding to reproductive characteristics. Chromosomal polymorphism was detected only in one animal, but it wasn t possible to stablish a relationship with prolificity. KEY-WORDS: swine, prolificity, chromosomal polymorphism, NOR Band. 1 Prof. Assistente, Depto Clínicas Veterinárias, CCA-UEL, Caixa Postal 6001, CEP , Londrina- Pr. 2 Prof. Assistente Doutor, Depto. Reprod. Anim., UNESP-FCAVJ, Rodovia Carlos Tonanni, Km 5, CEP , Jaboticabal- SP. 3 Prof. Adjunto, Depto Clínica e Cirurgia de Grandes Animais, UFSM, Campus Camobi, CEP , Santa Maria-RS.

2 194 ARS VETERINARIA, 15(3): , INTRODUÇÃO A busca de metodologias de suporte para seleção de animais, geneticamente superiores, para serem utilizados como reprodutores, é uma preocupação constante. Considerando que o material genético de um reprodutor dissemina-se a uma grande porção da população e que a eliminação de indivíduos portadores de anomalias transmissíveis deve ser priorizada, a determinação de um método auxiliar para seleção de reprodutores e que possa ser utilizado antes da maturidade sexual, implica em ganho de tempo considerável no processo de seleção, com reflexos diretos em custos de criação e manutenção dos animais. A fertilidade pode ser reduzida devido a produção de gametas geneticamente desbalanceados, os quais são efetivos na fertilização, mas resultam na perda embrionária precoce da progênie. A rapidez na detecção de anomalias cromossômicas em reprodutores usados em I.A. tem um grande valor econômico para criadores de suínos, segundo MÄKINEN et al. (1987). McCONNEL et al. (1963) examinando o cariótipo da espécie Sus scrofa observaram que alguns animais mostravam constrições secundárias nos pares cromossômicos número 14 e no número 9, classificados como pares número 10 e 08, respectivamente, pelas normas da Conferência de Reading (READING CONFERENCE, 1980). HAAG & NIZZA (1969) procuraram verificar se esta característica era influenciada pela proporção sexual, e obtiveram resultados negativos. Resultados semelhantes foram encontrados por GIANNONI (1973). GIANNONI (1979) analisando a distribuição desta característica no par cromossômico número 08, em 29 suínos, concluiu que deveria existir polimorfismo em populações de suínos em termos desta característica. Estudos conduzidos por CHRISTENSEN (1980) em linhagens consangüíneas de suínos Yorkshire, evidenciando polimorfismo de Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) no par cromossômico número 08, verificaram que um dos 19 machos analisados, apresentou o polimorfismo também no cromossomo número 10. Foi constatado que a fêmea que gerou este animal era polimórfica em ambos cromossomos, 08 e 10. O autor sugeriu que a variação no tamanho e número de bandas RONs, por célula, segue um modelo de herança Mendeliana. Utilizando a técnica de coloração pela prata, LIN et al. (1980) observaram que os pares cromossômicos 08 e 10 são responsáveis pela organização nucleolar nas espécies do gênero Sus scrofa. Este fato levou-os a concluir que somente três cromossomos apresentam a RON no suíno doméstico, e pelo menos um dos componentes do par número 08 estava sempre presente entre eles. VAGNER-CAPODANO et al. (1984) trabalhando com suínos da raça Large White observaram que em linfócitos, o número de RONs coradas pela prata variava de célula a célula e entre indivíduos. Quando somente dois cromossomos apresentaram reação positiva à prata, isto ocorria nos constituintes do par número 10. Quando três cromossomos se marcavam, as RONs ocorriam em ambos do par número 10. A importância da Região Organizadora do Nucléolo (RON) como função celular e orgânica pode ser entendida por sua íntima relação com a síntese protéica (SCHWARCHER & WACHTLER, 1983). As RONs tem mostrado grande variabilidade nos aspectos de tamanho, mecanismo de herança e localização, o que permite diferenciar espécies, linhagens, e às vezes, indivíduos de mesma linhagem (ANDRÉA, 1990). Estudando a variabilidade individual do número e tamanho das RONs em 76 suínos da raça Landrace e Duroc, VISHENEVSKAYA & VSEVOLODOV (1986) verificaram que todos os descendentes de pais homozigotos para presença e ausência de RONs no par número 08 (8-8- e 8+ 8+) foram heterozigotos (8-8+). Esses dados sugeriram aos pesquisadores um caráter codominante da herança do número de RONs, em suínos. As técnicas de bandeamento permitem a identificação dos pares de cromossomos e tornam possível estudo detalhado da morfologia cromossômica. O Comitê para padronização do cariótipo suíno doméstico confirmou as observações de que as RONs, nessa espécie ocorrem na porção centromérica dos braços curtos dos cromossomos números 08 e 10 (COMMITTEE FOR THE STANDARDIZED KARYOTYPE OF THE DOMESTIC PIG, 1988). Avaliando a existência de polimorfismo cromossômico em cachaços doadores de sêmen, e estudando a facilidade para classificar os animais portadores de polimorfismos cromosssômicos através de Banda NOR e C, FRANCESCHINI et al. (1993) notaram que a técnica de Banda NOR parece ser mais efetiva e simples para diferenciar, na espécie suína, os animais quanto ao polimorfismo cromossômico, quando comparada com a técnica de Banda C. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer uma relação entre polimorfismos cromossômicos (Banda NOR) e os índices de produção (prolificidade). MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados dez reprodutores suínos adultos, com idade entre 1 ano e 5 meses a 2 anos, sendo cinco da raça Landrace e cinco da raça Wessex, os quais

3 ARS VETERINARIA, 15(3): , estavam em regime de coberturas semanais dentro do programa de melhoramento genético de uma granja produtora de matrizes e reprodutores. De cada animal obteve-se oito ejaculados, os quais foram analisados quanto aos aspectos físicos do sêmen e constituintes do plasma seminal, com a finalidade de se estabelecer o perfil reprodutivo de cada animal. Utilizou-se 60 (sessenta) matrizes de mesma raça (Landrace) com características reprodutivas semelhantes, eram fêmeas multíparas com três a seis partos. Durante o desenvolvimento do trabalho, cada reprodutor cobriu seis fêmeas, sendo que foram realizadas duas coberturas supervisionadas, por ciclo, com intervalo de 12 horas, visando obter o parâmetro reprodutivo, prolificidade. Após a cobertura, as fêmeas eram mantidas no galpão de gestação, para o acompanhamento da prenhez, as quais com sinais de proximidade do parto, eram transferidas para a maternidade, para que este fosse supervisionado. Os dados de prolificidade foram medidos através do número de leitões nascidos vivos por parto. Para a realização do cariótipo, os animais foram contidos através de um cachimbo, realizou-se a antissepsia com álcool iodado, na face medial do pescoço, e através da punção da veia cava, com seringa estéril heparinizada, o sangue foi colheitado e transportado ao laboratório, evitando-se agitação brusca. A cariotipagem foi realizada segundo técnica descrita por PINHEIRO (1983). Posteriormente, duas a três gotas do sedimento final foram depositadas sobre as lâminas, previamente umidecidas com etanol a 50%, para que se obtevesse um espalhamento uniforme do material. As lâminas secaram ao ar e foram examinadas sob contraste de fase. Uma vez verificado o tipo de material existente, foram feitas as lâminas restantes. Para análise de rotina, o material foi corado com Giemsa a 3%. O método de formação de Banda NOR, utilizado no presente experimento, foi o descrito por HOWELL & BLACK (1980).O material foi analisado em microscópio óptico, sob imersão, utilizando várias vezes o contraste de fase. As metáfases com impregnação pela prata, após serem contados os cromossomos, foram desenhadas em folha de papel sulfite, e também fotografadas. As fotomicrografias foram feitas numa câmara de 35mm, semi-automática, acoplada a um microscópio NIKON SKT. De maneira geral, foram analisadas 11 metáfases de cada animal, o que, segundo HOOK (1977), garante com 95% de certeza, a exclusão de mosaicismos iguais ou superiores a 24%. Posteriormente, realizou-se uma comparação entre os achados citogenéticos, quanto ao polimorfismo Figura 1 - Cariótipo de suíno, macho, 2n=38, apresentando três RONs, nos dois cromossomos do par 10 e em um cromossomo do par 08, evidenciadas pela técnica de coloração pela prata (Banda NOR). Figura 2 - Cariótipo de suíno, macho, 2n=38, apresentando duas RONs, nos cromossomos do par 10, evidenciadas pela técnica de coloração pela prata (Banda NOR).

4 196 ARS VETERINARIA, 15(3): , cromossômico para Banda NOR e a prolificidade, visando estabelecer uma relação entre essas características. As análises citogenéticas iniciais indicaram que os animais não apresentavam nenhuma alteração a nível cromossômico. Posteriormente, foram realizadas as análises de Banda NOR, após o estudo de todas as lâminas do material colhido de cada animal. Pôde-se identificar que somente o animal cinco da raça Wessex apresentou três (3) marcações; sendo que os cromossomos marcados foram, os dois do par 10 e um do par 08. Todos os outros animais envolvidos no estudo apresentaram duas (2) marcações, sendo que estas, sempre identificadas nos cromossomos do par 10. O cariótipo de Banda NOR com três marcações foi registrado na Figura 1, e os cariótipos com duas marcações foram mostrados através da Figura 2. As médias da prolificidade correspondente a cada reprodutor, nas duas raças, foram apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 - Médias de prolificidade ± desvio padrão dos reprodutores envolvidos no experimento, dentro de cada raça. ANIMAIS RESULTADOS LANDRACE DISCUSSÃO RAÇAS WESSEX 1 11,00±1,09 9,83±2, ,00±1,03 9,33±4, ,50±2,07 9,50±1,64 4 7,83±1,32 8,83±1,16 5 7,33±2,33 10,16±2,78 MÉDIAS DAS RAÇAS 9,53±1,80 9,53±0,50 Os cariótipos dos animais envolvidos no estudo apresentaram -se normais, sem nenhuma alteração cromossômica, como translocações ou outros rearranjos cromossômicos, as quais segundo MÄKINEN et al. (1987) podem reduzir a progênie devido a produção de gametas desbalanceados, que são efetivos na fertilização, mas resultam em morte embrionária precoce, promovendo grandes perdas econômicas nas criações. Após o exame das lâminas de todos os animais, foram realizadas as análises de Banda NOR, para que se pudesse indentificar a Região Organizadora do Nucléolo (RON), a qual posssui uma íntima relação com a síntese protéica, e apresenta polimorfismos, permitindo diferenciar linhagens e às vezes, indivíduos de mesma linhagem (SCHWARCHER & WACHTLER, 1983, GIANNONI, 1979, VISHENEVSKAYA & VSEVOLODOV, 1986, ANDRÉA, 1990). As técnicas de bandeamento permitem a identificação dos pares de cromossomos tornando possível o estudo detalhado da morfologia cromossômica. Segundo o COMMITTEE FOR THE STANDARDIZED KARYOTYPE OF THE DOMESTIC PIG (1988), as RONs na espécie suína doméstica ocorrem na porção centromérica dos braços curtos dos cromossomos números 08 e 10. A escolha da utilização da Banda NOR para a identificação de polimorfismo cromossômico foi baseada nos resultados de FRANCESCHINI et al. (1993), os quais compararam dois métodos e concluíram ser a técnica de Banda NOR mais efetiva e simples na diferenciação, em suínos, para o polimorfismo cromossômico. De todos os animais estudados, somente o animal cinco da raça Wessex apresentou três marcações, sendo que os marcados foram os dois cromossomos do par 10 e um cromossomo do par 08 (Figura 4), classificação realizada respeitando as normas da Conferência de Reading (READING CONFERENCE, 1980). Todos os outros animais estudados apresentaram duas marcações, sendo estas sempre identificadas nos cromossomos do par número 10 (Figura 5), como havia sido previamente descrito por LIN et al.(1980) e VAGNER CAPOTANO et al(1984).. A observação de constrições secundárias, evidenciando polimorfismo de Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) nos mesmos pares cromossômicos, havia sido descrita anteriormente, por vários autores, por McCONNEL et al. (1963) ao examinar o cariótipo da espécie Sus scrofa, por HAAG & NIZZA (1969) e por GIANNONI (1973) em machos e fêmeas suínas, por CHRISTENSEN (1980) em machos de linhagens consangüíneas da raça Yorkshire, entre outros. Ao se comparar os dados de prolificidade, não se obteve diferenças estatísticas significativas, mas o animal que apresentou três marcações, dentro da sua raça apresentou uma tendência em possuir uma maior prolificidade. Portanto, acredita-se que deve ser realizado um estudo mais amplo, na tentativa de confirmar essa tendência, ressaltando que os resultados de prolificidade podem ter sido influenciados pela qualidade da amostra, lembrando que se trabalhou somente com animais geneticamente selecionados, o que de certa forma, padronizou a amostra. Face aos resultados obtidos e de acordo com os objetivos previamente delineados para o trabalho em questão, é possível concluir que detectou -se o polimorfismo cromossômico (Banda NOR) em apenas um

5 ARS VETERINARIA, 15(3): , animal, mas não foi possível estabelecer uma relação com a prolificidade. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRÉA, M.V. Estudos das regiões organizadoras de nucléolo em suínos. Jaboticabal, p. Dissertação (Mestrado em Melhoramento Genético) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. Universidade Estadual Paulista. CHRISTENSEN, K. Evidence of polymorphism of the nuclear organizer region (N-Band) in pig chromosome. College of Cytogenetic Domestic Animal, v. 4, p , COMMITTEE FOR THE STANDARDIZED KARYOTYPE OF THE DOMESTIC PIG. Standard karyotype of the domestic pig. Hereditas, v. 109, p , FRANCESCHINI, P.H., MELLO MARTINS, M.I., ALMEIDA JÚNIOR, I.L. Polimorfismo cromossômico na espécie suína: avaliação através de Banda C e NOR. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁ- RIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, Goiânia, GO, Anais... Goiânia: Associação Brasileira de Veterinários Especialistas em Suínos, p GIANNONI, M.A. Estudo cariotípico de alguns representantes da família Suidae. Ribeirão Preto, p. Dissertação (Mestrado em Genética) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. GIANNONI, M.A. Citogenética, especiação e a deriva continental, In: REUNIÃO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE GENÉTICA, 13, 1979, Jaboticabal. Resumos..., p HAAG, J., NIZZA, P. Le caryotype du porc normal. Annales de Genetique, v. 12, n. 4, p , HOWELL, W.M., BLACK, D.A. Controlled silverstaining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, v. 36, p , HOOK, E.B. Exclusion of chromosomal mosaicism table of 95% and 99% confidence limits and coments on use. Annual Journal Human, v. 29, p. 94-7, LIN, C.C., BIEDERMAN, B.M., JAMRO, H.K., et al. Porcine (Sus scrofa domestica) chromosome identification and suggested nomenclature. Canadian Journal of Genetics and Cytology, v. 22, p , MÄKINEN,A., KUOKKANEN, M-T, NIINI, T., et al. A complex three breakpoint translocation in the domestic pig. Acta Veterinary Scandinavia, v. 28, p , McCONNEL, J., FECHHEIMER, N., GILMORE, L.O. Somatic chromosome of the pig. Journal of Animal Science, v. 22, p. 74-9, PINHEIRO, L.E.L. Avaliação dos efeitos da translocação Robertsoniana 1/29 sobre a reprodução de bovinos Pitangueiras. Jaboticabal, p. Tese (Livre- Docência) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista. READING CONFERENCE, Proceedings of the First International Conference for the Standardisation of Banded Karyotypes of the Domestic Animals. Hereditas, v. 92, p , SCHWARZACHER, H.G., WACHTLER, F. Nucleolus organizer regions and nucleoli. Human Genetics, v. 63, p , VAGNER-CAPODANO, A.M., HENDERSON, A.S., LISSITZKY, S., et al. The relationship between ribosomal genes and fibrilar centers in thyroid cells cultivated in vitro. Biologie Cellulaire, v. 51, p , VISHENEVSKAYA, S.S., VSEVOLODOV, E.B. Individual variability and inheritance of the number and size of the nucleolar organizer regions of the domestic pig chromosomes. Genetika, v. 22, n. 4, p