RELAÇÃO ENTRE DETERMINADOS CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL E PROLIFICIDADE NA ESPÉCIE SUÍNA

Transcrição

1 188 ARS VETERINARIA, 15(3): , RELAÇÃO ENTRE DETERMINADOS CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL E PROLIFICIDADE NA ESPÉCIE SUÍNA (RELATIONSHIP AMONG SOME SEMINAL PLASMA CONSTITUENTS AND PROLIFICITY IN SWINE) M.I.M. MARTINS 1, P.H. FRANCESCHINI 2, I.WENTZ 3, A.S. FERRAUDO 4 RESUMO O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os níveis de proteínas totais, albumina, globulinas e cloretos totais no plasma seminal de cachaços utilizados em programa de melhoramento genético e correlacioná-los aos índices de prolificidade, obtidos com a utilização desses reprodutores em programa de monta natural. Dez reprodutores adultos, cinco da raça Landrace e cinco da raça Wessex foram utilizados, sendo que oito ejaculados de cada animal, num total de oitenta ejaculados, foram colhidos no período de maio a setembro de Os índices de prolificidade, para cada reprodutor, foram mensurados através do número de leitões nascidos vivos por leitegada, de seis fêmeas com características reprodutivas semelhantes, cobertas duas vezes com intervalo de 12 horas, num total de 60 matrizes, todas de mesma raça (Landrace). A colheita do sêmen foi realizada através do método da mão-enluvada com uma fêmea em cio como manequim, sendo o ejaculado dividido em fração rica (espermática) e fração pobre (pós-espermática). As amostras foram centrifugadas a 1000g durante 10 minutos, separando o plasma seminal para dosagens de proteínas totais, albumina e cloretos totais através de kits diagnósticos, com leitura em espectrofotômetro de absorbância atômica. As quantidades de globulinas foram obtidas pela diferença entre as concentrações de proteínas totais e as de albumina. Os resultados obtidos mostraram que os animais envolvidos no estudo apresentaram uma semelhança em relação aos aspectos reprodutivos. A quantificação dos elementos bioquímicos constituintes do plasma seminal não foi suficiente para detectar diferenças entre os animais, e suas influências sobre a prolificidade. PALAVRAS-CHAVE: suíno, plasma seminal, prolificidade. SUMMARY The present work was designed to evaluate total protein, albumin, globulin and total chloride concentrations of boar seminal plasma from genetic improvement program and correlate those results with prolificity index achieved on natural mating. The samples were obtained from ten sexually mature boars ( five Landrace and five Wessex breeds). A total of 80 ejaculates (eight from each male) were analysed from May till September, The individual prolificity index was assessed by the number of live born farrowing/litter from six sows (with similar reprodutive traits) mated twice to each boar at 12h intervals. The semen collection was performed by the use of the gloved-hand tecnique and mount on an estrous female. The ejaculate was fractioned as rich (sperm) and poor (post-sperm) fractions. The samples were centrifuged at 1,000g for 10 minutes to separate spermatozoa from seminal plasma and then analysed chemically to assess total protein, albumin and total chloride concentrations by the use of dignosis kits. The samples were colorimetrically determined on a Beckman spectrophotometer.the globulin concentration was estimated by the difference between total protein and albumin 1 Prof. Assistente, Depto Clínicas Veterinárias, CCA-UEL, Caixa Postal 6001, CEP , Londrina- Pr. 2 Prof. Assistente Doutor, Depto. Reprod. Anim., UNESP-FCAVJ, Rodovia Carlos Tonanni, Km 5, CEP , Jaboticabal- SP. 3 Prof. Adjunto, Depto Clínica e Cirurgia de Grandes Animais, UFSM, Campus Camobi, CEP , Santa Maria-RS. 4 Prof. Assistente Doutor, Depto Ciências Exatas, UNESP-FCAVJ.

2 ARS VETERINARIA, 15(3): , concentrations. The results obtained showed that the animals employed in this study presented some homogeneity regarding to reproductive characteristics. The quantitative evaluation of seminal plasma biochemical constituents was not enough to detect differences among boars and its influences upon prolificity. KEY-WORDS: swine, seminal plasma, prolificity. INTRODUÇÃO As propriedades biológicas e biofísicas dos espermatozóides estão intimamente relacionadas com sua composição molecular. A organização da membrana do gameta masculino segue o modelo sugerido por SINGER & NICHOLSON (1972), o qual propõe a dispersão de proteínas dentro e entre a membrana plasmática do espermatozóide, que seria formada por uma dupla camada de lipídeos. Reveste-se ainda de grande importância o conhecimento dos fatores, ou substâncias, que parecem desestabilizar ou proteger a membrana dos espermatozóides, uma vez que a integridade da mesma é fundamental para o funcionamento adequado do gameta masculino (PARKS & GRAHAM, 1992). Segundo CLAUS (1990), os cachaços afetam a taxa de fertilização através da qualidade e quantidade de sêmen depositado no trato reprodutivo de fêmea, sendo que a composição bioquímica do sêmen de cachaços influencia a fertilidade através de efeitos na viabilidade espermática e ambiente do trato reprodutivo da fêmea. Apesar dos espermatozóides apresentarem vida relativamente longa no epidídimo e no trato reprodutivo da fêmea, onde estão em grande diluição, morrem rapidamente após diluição em meio salino. Dessa forma, supõe-se que estas células não são intrinsicamente estáveis, mas que o meio artificial simples exerce algum efeito prejudicial, ou tem carência de fatores essenciais para sua viabilidade (HARRISON et al., 1978). Através da dosagem de proteínas do plasma seminal de cachaços intactos e vesiculectomizados, DAVIES et al. (1975) demonstraram a presença de somente traços de proteínas básicas, as quais afetam a integridade de membrana espermática, tornando os espermatozóides susceptíveis a danos, durante o processo de congelação do sêmen, nos animais que tiveram as vesículas seminais cirurgicamente retiradas. Os autores não observaram diferenças significativas na fertilidade mensurada através da I.A. com o sêmen a fresco diluído, nos dois grupos envolvidos. GERFEN et al. (1994) compararam características do sêmen de duas raças chinesas e uma ocidental, com a finalidade de detectar diferenças que explicassem a maior prolificidade das raças chinesas. Os valores de proteínas totais, no plasma seminal, foram de 27.2 ± 7.2, 34.8 ± 3.1 e 30.6 ± 5.6 mg/ml, para as raças Fengjing, Meishan e Yorkshire, respectivamente. Não observaram nenhuma raça que tivesse valores mais altos, significativos ao nível de 5%, para os parâmetros mensurados. Foi detectado por MOORE & HIBBITT (1976) que certa quantidade de proteína do plasma seminal, ligada ao espermatozóide suíno, não foi removida após intensas lavagens, indicando uma ligação, provavelmente irreversível, de proteínas à membrana espermática. Sugeriram que os danos que ocorrem nos espermatozóides durante a congelação, poderiam ser devidos à quebra da integridade da membrana, causada pelo estresse de resfriamento e acentuado pelas proteínas básicas aderidas. METZ et al. (1990) detectaram que a adsorção de proteínas aumentou nas amostras contendo uma porcentagem maior de espermatozóides móveis, o que confirma observações prévias, onde os espermatozóides de ejaculados com qualidade menor adsorviam menos proteínas. Muitas atividades têm sido atribuídas à albumina no suporte da capacitação espermática, in vitro; esses efeitos podem ser devidos a alta capacidade e baixa afinidade de ligação de outras moléculas à albumina. Albuminas que, efetivamente, sustentam a capacitação espermática e reação de acrossomo tem maior atividade de transferência de lipídeos, do que aquelas com menor nível (RAVNIK et al., 1993). A avaliação definitiva da qualidade do sêmen é através da inseminação de um número significativo de fêmeas padrão e monitoramento do número de prenhez e leitões nascidos por leitegada (COLENBRANDER & KEMP, 1990). A maioria dos estudos conduzidos na espécie suína estão direcionados para o conhecimento do perfil bioquímico do plasma seminal, sem procurar correlacionar tais achados com características produtivas e/ou reprodutivas.portanto, com a comprovação de que estas correlações existam, será possível empregá-las para selecionar cachaços doadores de sêmen para serem utilizados em programas intensivos de melhoramento genético. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os níveis de proteínas totais, albumina, globulinas e cloretos totais no plasma seminal de cachaços utilizados em programa de melhoramento genético e correlacioná-los com os índices de prolificidade, obtidos

3 190 ARS VETERINARIA, 15(3): , com a utilização da monta natural dos cachaços envolvidos no estudo, como método de cobertura. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados dez reprodutores suínos adultos, com idade entre 1 ano e 5 meses a 2 anos, sendo cinco da raça Landrace (raça 1) e cinco da raça Wessex (raça 2), os quais estavam em regime de coberturas semanais dentro do programa de melhoramento genético de uma granja produtora de matrizes e reprodutores. De cada animal obteve-se oito ejaculados, colhidos no período de maio a setembro, com intervalos de 15 dias (sendo que, na semana que o macho cobria, não era colhido sêmen), num total de 80 (oitenta) ejaculados, os quais foram analisados quanto aos aspectos físicos do sêmen e constituintes do plasma seminal, com a finalidade de se estabelecer o perfil reprodutivo de cada animal. Utilizou-se 60 (sessenta) matrizes de mesma raça (Landrace) com características reprodutivas semelhantes, quais sejam: fêmeas multíparas, clinicamente normais quanto à reprodução, com três a seis partos, alojadas em baias próximas aos cachaços, para facilitar a detecção de cio. Ao se detectar sinais de cio, as matrizes eram identificadas para que fossem cobertas 12 horas após, isto é, fêmeas em cio pela manhã eram cobertas à tarde e vice-versa. Durante o desenvolvimento do trabalho, cada reprodutor cobriu seis fêmeas, sendo que foram realizadas duas coberturas supervisionadas, por ciclo, com intervalo de 12 horas, visando obter o parâmetro reprodutivo, prolificidade. Após a cobertura, as fêmeas eram mantidas no galpão de gestação, para o acompanhamento da prenhez e sinais de proximidade do parto. Posteriormente, eram transferidas para a maternidade, para que o parto fosse supervisionado. Os dados de prolificidade foram medidos através do número de leitões nascidos vivos por parto. A colheita de sêmen foi realizada em uma sala adaptada, no mesmo galpão onde os machos eram mantidos, no setor de reprodução da granja, com a utilização do método da mão-enluvada (HANCOCK & HOVELL, 1959), com uma fêmea em cio servindo como manequim. Os ejaculados foram colhidos em copos de Becker de vidro, graduados e previamente esterilizados com uma camada dupla de gase, fixada na abertura, para separar as secreções provenientes das glândulas bulbouretrais. Os copos de colheita eram previamente aquecidos a 37ºC, e acondicionados em um protetor de isopor, com água aquecida. A colheita do ejaculado foi dividida em fração rica (fração espermática), nos copos de Becker protegidos da luz, e fração pobre (fração pós espermática), em copos também aquecidos, mas não protegidos da luz. Imediatamente após a colheita das frações (rica e pobre) do ejaculado, realizou-se a centrifugação a 1000g durante 10 minutos, para a separação do plasma seminal, o qual foi armazenado a cerca de 5 a 8ºC, por um período não superior a 180 minutos, suficiente para o transporte da granja até ao Laboratório Clínico do Hospital Veterinário da FCAVJ-UNESP. No laboratório foram realizadas as dosagens de Proteínas totais, Albumina e Cloretos através de Kits de diagnóstico * e leitura em espectrofotômetro de absorbância atômica. As quantidades de globulinas foram obtidas através da diferença entre as quantidades de proteínas totais e as de albumina. Esse procedimento foi utilizado tanto para a fração rica, como para a fração pobre do plasma seminal. Os dados foram transformados pela divisão de cada valor, pelo maior valor da coluna. Portanto, utilizouse variáveis possuindo sempre o mesmo peso, entre 0 e 1. Tomou-se os valores relativos às características do plasma seminal (concentração de proteínas totais, cloretos, albumina), e prolificidade (média de leitões vivos por leitegadas) de cada reprodutor envolvido no experimento, na tentativa de encontrar um modelo linear que explicasse Y (prolificidade), em função das demais variáveis independentes X k ( k é o número de variáveis independentes). Para isso utilizou-se o procedimento estatístico denominado Regressão Linear Múltipla, incluindo todos os produtos de ordem 2. O coeficiente de semelhança utilizado foi a Distância Euclidiana Média e o algarítmo, o Average Linkage. Este algarítmo é seqüencial, aglomerativo, hierárquico e não superposto, de acordo com SNEATH & SOKAL (1973). Todos os procedimentos estatísticos foram efetuados pelo Software S.A.S. RESULTADOS Os resultados obtidos decorrentes das análises laboratoriais dos dados colheitados, relativas às características bioquímicas do plasma seminal (concentração de cloretos, de proteínas, de albumina e de globulinas, nas frações rica e pobre), do mesmo modo que as características reprodutivas, tiveram as médias apresentadas na Tabela 1. * KITS Labtest Sistema Diagnóstico Ltda. Av. Isabel Bueno, 948. Belo Horizonte. Brasil

4 ARS VETERINARIA, 15(3): , Tabela 1 - Características bioquímicas (média ± desvio padrão) do plasma seminal in natura e prolificidade dos suínos envolvidos no estudo. RAÇA 1 RAÇA 2 Amostras (N) FRAÇÃO RICA Cloretos (meq/l) 98,33 ± 12,08 91,53 ± 11,25 Proteínas totais (g/dl) 02,60 ± 00,77 03,57 ± 01,05 Albumina (g/dl) 00,31 ± 00,19 00,36 ± 00,22 Globulinas (g/dl) 02,29 ± 00,70 02,91 ± 00,89 FRAÇÃO POBRE Cloretos (meq/l) 109,39 ± 14,29 96,13 ± 12,55 Proteínas totais (g/dl) 02,76 ± 01,00 03,91 ± 01,42 Albumina (g/dl) 00,29 ± 00,18 00,41 ± 00,25 Globulinas (g/dl) 02,46 ± 00,93 03,51 ± 01,33 N leitões vivos/parto 9,53 ± 1,80 9,53 ± 0,50 O modelo de regressão linear, considerando como variáveis independentes a concentração de cloretos, de proteínas, de albumina e de globulinas (nas frações rica e pobre do plasma seminal), e como variável dependente a prolificidade, explica apenas 15% da variação total dos dados amostrais (R²=0,15). Os resultados também foram submetidos à análise de agrupamento (análise de Cluster), a qual não mostrou haver, entre os animais estudados e segundo as variáveis consideradas, grupos homogêneos distintos, os quais os separassem dentro de diferenças entre as raças ou entre os animais individualmente, conforme demonstrado no Gráfico 1. Médias Grupo 2 Grupo 1 CL_FR PT_FR AL_FR CL_FP PT_FP AL_FP PROL Variáveis Gráfico 1 - Comportamento das médias das variáveis estudadas, quando realizada a análise de agrupamento (Análise de Cluster) dessas variáveis em dois grupos. CL-cloretos, PTproteínas totais, FR- fração rica do ejaculado, FP- fração pobre, AL- albumina, PROLprolificidade. DISCUSSÃO Os animais envolvidos no estudo apresentaram semelhanças em relação aos aspectos reprodutivos, dificultando assim a detecção de diferenças pequenas, através dos métodos disponíveis e utilizados na quantificação das características propostas. A utilização somente dos melhores cachaços, em centrais de produção, garantindo a qualidade dos descendentes, havia sido considerada por COLENBRANDER & KEMP (1990), para programas de reprodução de suínos. O baixo valor do R 2 mostrou que, para explicar a prolificidade, devem existir outras variáveis a serem consideradas, ou existe uma combinação complexa dessas variáveis, muito difícil de ser encontrada (não linear). As médias das variáveis, quando agrupadas em dois grupos, expressaram através de um gráfico da análise de Cluster a proximidade dos pontos representativos dos resultados do experimento, não apresentando diferença estatísticamente significativa. No presente estudo detectou-se que a quantidade de albumina nas frações rica e pobre do plasma seminal de suínos, representou aproximadamente 11% e 10%, respectivamente, da fração proteica total. RAVNIK et al. (1993) reportaram que as atividades atribuídas à albumina no suporte da capacitação espermática, in vitro, podem ser devidos à sua baixa afinidade de ligação às outras moléculas, e maior atividade de transferência de lipídeos. Todavia, no presente trabalho, esta atividade da albumina não pode ser evidenciada, uma vez que a deposição do sêmen foi feita diretamente no sistema genital das fêmeas. A análise estatística não detectou diferenças significativas nas concentrações de cloretos no plasma seminal, como detectado por EINARSSON ET AL. (1970). Segundo PANGAWKAR et al. (1988), que trabalharam com plasma seminal de bovinos, os cloretos desestruturariam as proteínas, impedindo-as de se ligarem à membrana dos espermatozóides, tornando-os vulneráveis às agressões externas. Portanto, a observação da tendência de uma menor concentração de cloretos na fração rica do plasma seminal, pode ser uma proteção intrínsica dos indivíduos, independente da espécie e raça. As concentrações médias de proteínas totais, albuminas e globulinas dos indivíduos das duas raças comportaram de forma semelhantes, não sendo possível a diferenciação em dois grupos diferentes entre si, porém com homogeneidade entre os indivíduos do grupo. Os resultados nas concentrações de proteínas obtidos no presente estudo, se equivalem àqueles encontrados por GERFEN et al. (1994) que compararam sêmen de uma raça ocidental (Duroc) e de duas raças chinesas, também não obtiveram diferenças

5 192 ARS VETERINARIA, 15(3): , estatísticamente significativas. Avaliando-se as informações reunidas, tanto em relação ao experimento realizado, como aquelas registradas na bibliografia revisada, observa-se que muitos estudos ainda são necessários para que se conheça mais detalhadamente a influência do plasma seminal sobre o espermatozóide. Além disso evidenciou-se que as quantificações dos constituintes bioquímicos do plasma não são suficientes para a determinação da relação destes com a capacidade fertilizante do sêmen. Acredita-se que há necessidade de não somente quantificar, mas de qualificar esses constituintes, principalmente as frações proteicas, com a finalidade de utilizá-los como possível indicador do desempenho reprodutivo dos animais. Face aos resultados obtidos e de acordo com os objetivos previamente delineados para o trabalho em questão, é possível concluir que a quantificação dos elementos bioquímicos constituintes do plasma seminal não foi suficiente para detectar diferenças entre os animais, e suas influências sobre a prolificidade. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CLAUS, R. Physiological role of seminal components in the reprodutive tract of the female pig. Journal of Reproduction and Fertility, Suppl 40, p , COLENBRANDER, B., KEMP, B. Factors influencing semen quality in pigs. Journal of Reproduction and Fertility, Suppl. 40, p , DAVIES, D.C., HALL, G., HIBBITT, K.G., MOORE, H.D.M. The removal of the seminal vesicles from the boar and the effects on the semen characteristics. Journal of Reproduction and Fertility, v. 43, p , EINARSSON, S., CRABO, B., ELKMAN, L. A comparative study on the chemical composition of plasma from the cauda epididymidis, semen fractions, and whole semen in boars. Acta Veterinaria Scandinavia, v. 11, p , GERFEN, R.W., WHITE, B.R., COTTA, M.A., WHEELER, M.B., Comparison of the semen characteristics of Fengjing, Meishan and Yorkshire boars. Theriogenology, v. 41, p , HANCOCK, J. L., HOVELL, G.L.C. The collection of boar semen. Veterinary Record, v. 71, p , HARRISON, R.A.P., DOTT, H.M., FOSTER, G.C. Effect of ionic strength, serum albumin and other macromolecules on the maintenance of motility and the surface of mammalian spermatozoa in a simple medium. Journal of Reproduction and Fertility, v. 52, p , METZ, K.W., BERGER, T., CLEGG, E.D. Adsorption of seminal plasma proteins by boar spermatozoa. Theriogenology, v. 34, n. 4, p , MOORE, H.D.M., HIBBITT, KG. The binding of labeled basic proteins by boar spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v. 46, p. 7l-6, PANGAWKAR, G.R., SHARMA, R.D., BISWAS, R.K., DUGWEKAR, Y.G. Electrolyte composition of seminal plasma in relation to freezability in Holstein- Friesian bulls. Indian Journal of Dairy Science, v. 41, n. 4, p , PARKS, J.E, GRAHAM, J.K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, v. 38, p , RAVNIK, S.E., ALBERS, J.J., MULLER, C.H., A novel view of albumin-supported sperm capacitation: role of lipid transfer protein-i. Fertility and Sterility, v. 59, n. 3, p , SINGER, S.J., NICHOLSON, G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, v. 175, p , SNEATH, P.H.A., SOKAL, R.P. Numeral taxonomy. São Francisco: W.H. Friemann, p.