IDENTIFICAÇÃO DA REGIÃO ORGANIZADORA NUCLEOLAR DE JATROPHA CURCAS L.*

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1 IDENTIFICAÇÃO DA REGIÃO ORGANIZADORA NUCLEOLAR DE JATROPHA CURCAS L.* MARGARETH APARECIDA DOS SANTOS MARGONAR, ISANE VERA KARSBURG, DIEGO ANTONIO OTTONELLI DE BONA Resumo: as sementes de Jatropha curcas destacam-se pelo alto teor de óleo. Objetivou-se identificar a RON em cromossomos. Os meristemas radiculares foram submetidos a substâncias antimitóticos, fixação, digestão celular e dissociação celular. Jatropha c. apresenta 2n = 22 cromossomos (5 M + 6SM), pequenos variando de 1,76 a 1,00 µm. A RON foi identificada nos pares cromossomos 1 e 3. Palavras-chave: Citogenética. Euphorbiaceae. RON. AgNO3. Cromossomos. J atropha curcas L. pinhão manso, também conhecido como pinhão-paraguaio, purgueira, pinhão -de-cavalo, pinhão bravo, pinhão-de-purga (MARTINS, CRUZ, 1985; TEIXEIRA,1987), pertence à família Euphorbiaceae, subfamília Crotonidae, Tribo Hippomaneae, subtribo Jatropheae,o gênero Jatropha, que possue 175 espécies, entre herbáceas e arbustivas, apresentam valor medicinal, ornamental e algumas são produtoras de óleo (AL- VES et al., 2008; SOUZA, LORENZI, 2008). O gênero Jatropha provavelmente foi distribuído pelos Portugueses pela Ilhas do Cabo Verde e Guiné Bisau para outros países como África e Ásia (HELLER, 1996). Ocorre em maior proporção nas regiões tropicais e subtropicais (HELLER, 1996; SWOT, 2002; ARRUDA et al., 2004; SATURNINO et al., 2005). Caracteriza-se por sua rusticidade; sendo

2 pouco suscetível a pragas e doenças. A produtividade máxima é atingida em cinco anos e seu longo ciclo produtivo pode chegar a 50 anos e manter a média de produtividade de duas ton./há (AZEVEDO, 2006; LUO et al., 2007; SIRISOM- BOON et al., 2007). Jatropha curcas L destaca-se com grande potencial na produção de biodiesel (PINTO et al., 2009), e para outros afins, isto se deve ao alto teor de óleo encontrado em suas sementes até 39,8% (SHAO-CHUN et al., 2007). As características físico-químicas do óleo, rusticidade da planta, resistência ao déficit hídrico e ao ataque de pragas, adaptável a uma vasta gama de condições edafoclimaticas, crescendo inclusive em solos de baixa fertilidade (TEIXEIRA, 2005). As caracterizações citogenéticas do gênero Jatropha tem apresentado variações entre as espécies e os híbridos interespecíficos. A maioria das espécies apresentam 2n = 2x = 22 cromossomos, entre elas J. curcas L. (FEDOROV, 1969; SOONTORNCHAINAK- SAENG, JENJITTIKUL, 2003; CARVALHO et al., 2008; IPCN, 2009; DAHMER et al., 2009). As espécies J. cuneata Wiggins & Rollins, J. dioica Sesse e muitas populações de J. heterophylla Heyne) são tetraplóides (2n=4x=44) e J. tirucalli L. tem 2n=20 cromossomos (IPCN, 2009; FEDOROV, 1969), além dos híbridos artificiais triplóides (2n=3x=33) obtidos dos cruzamentos de J. curcas x J. cathartica Teran & Berlan e J. curcas x J. podagrica Hook (DEHGAN, 1984). Com o bandeamento Ag-NOR, é possível identificar as regiões organizadoras nucleolares ativas (NOR ativa), que é constituída em um ou mais pares cromossômicos, oos quais possuem os genes rdna responsáveis pela formação dos diferentes tipos de rrna que formam o nucléolo e os ribossomos (MILLER et al., 1976; HOWELL, BLACK, 1980; SUMNER, 1990; GUERRA, 1988; SUMNER, 2003).O rrna codificado pelo genes rdna associa-se a proteínas específicas no nucléolo para formar as subunidades ribossomais (LACADENA et all., 1984; HASTEROK, MALUSZYNSKA, 2000). Técnicas como a fixação do material, maceração enzimática, dissociação celular e secagem ao ar possibilitam a obtenção de um material cromossômico adequado para a realização de bandeamentos. Além disso, as metodologias de dissociação celular e secagem ao ar permitem preparações sem resíduos de parede celular, com cromossomos no mesmo plano da lâmina, individualizados e com constrições primárias e secundárias bem preservadas (CARVALHO, SARAIVA, 1993; ANDRAS et al., 2000; CARVALHO, SARAIVA, 2007). Este estudo teve por objetivo a identificação da região organizadora nucleolar de Jatropha curcas de diferentes populações ocorrentes em Alta Floresta MT. MATERIAIS E METODOS As sementes utilizadas no presente trabalho foram coletadas de cinco plantas de cinco locais diferentes (Tabela.1) no município de Alta Floresta/MT. Para as análises citogenéticas foram utilizadas 100 sementes. As análises mitóticas foram conduzidas no Laboratório de Citogenética e Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade do Estado de Mato Grosso no Campus de Alta Floresta-MT. estudos, Goiânia,. 39, n. 2, p , abr./jun

3 Tabela 1: Localização por GPS (Sistema de Posição Global) de cinco populações de Jatropha curcas ocorrentes em Alta Floresta MT em 2010 População Localização Pop.1 S W Pop.2 S W Pop.3 S W Pop.4 S W Pop.5 S W As sementes foram escarificadas e imersas na água pelo período de 12 horas. Após processo de quebra de dormência, as sementes das diferentes populações foram distribuídas em caixas do tipo gerbox com papel filtro umedecido com 10 ml de água destilada e mantidas em câmera de germinação a 28 C com foto período de 16 horas. Após quatro dias ocorreu a germinação e as sementes com meristemas radiculares com 1 a 1,5 cm foram submetidas aos procedimentos de bloqueio com Trifluralin na concentração de 3µM, por um período de 14 a18 horas a temperatura de 4 C. Em seguida as radículas foram lavadas em água destilada para remoção do excesso da solução antimitótica e fixadas em solução de metanol: ácido acético (PA) na proporção 3:1, a -20 C. As raízes foram retirada da solução fixadora e lavadas em água destilada, sendo transferidas para tubos tipo Eppendorf TM com capacidade para 1,5 ml, com 200µL de Pectinase SIGMA por 2h à 34 C. Realizada digestão enzimática, o material foi lavado novamente e fixado em solução metanol-ácido acético (3:1) (PA) por no mínimo 24 horas a 4 C. Os meristemas radiculares foram dissociados sobre lâmina e estas secadas ao ar em movimentos rápidos e em placa aquecedora a 50 C conforme descreve (CARVALHO; SARAIVA, 1993). As mesmas foram coradas com giemsa 5% por 3 minutos, lavada em água destilada, secadas novamente ao ar e na placa aquecedora por 5 minutos. Algumas lâminas foram submetidas à solução de nitrato de prata (AgNO3) 50% segundo Funaki et al. (1975), sendo esta gotejada sobre cada lâmina que posteriormente foi coberta com a lamínula. O material foi mantido em câmara úmida a 36 C por 15 a 19 horas. Finalizado o processo de incubação, as lamínulas foram retiradas com jato de água e as lâminas lavadas com água destilada por cerca de dois minutos. Para cada população foram avaliadas 25 células em estágio de metáfase. As imagens de interesse foram fotografadas com uso de microscópio fotômico binocular (Leica ICC 50) acoplado a um computador e no software LAZ EZ V As imagens foram analisadas pelo programa Image SXM (BARRET, 2002) de domínio público, cujo pode ser obtido via internet ( O comprimento dos braços dos cromossomos determinou-se segundo o critério de classificação morfológica dos cromossomos descrita por (GUERRA, 1986). RESULTADOS E DISCUSSÃO O pré tratamento utilizado nos meristemas radiculares de J. curcas possibilitou a caracterização morfológica dos cromossomos. O uso do Trifluralin como agente anti mitótico e a fixação em metanol: ácido acético solução fornecem cromossomos em

4 metafase, com alta integridade morfológica. De acordo com Planchais et al. (2000), herbicidas como APM e Trifluralin despolimerizam os microtúbulos, dificultando as células a entrar em anáfase, além de sua alta eficiência em baixas concentrações de micromolar. A solução de fixação evita a perda de ácidos nucléicos e proteínas, preserva a morfologia e provoca precipitação de nucleases que podem danificar os cromossomos (LEITCH; HESLOP-HARRISON, 1992). Além disso, a dissociação celular forneceu lâminas com cromossomos em metáfases bem individualizados. O processo descrito, permitiu para outros trabalhos a obtenção do acumulo de cromossomos mitóticos com alta qualidade para análises detalhadas (CARVALHO, SARAIVA, 1993, 1997; CAI- XETA, CARVALHO, 2000; CONTI et al., 2005; CLARINDO, CARVALHO, 2006; CLARINDO et al., 2007; ABREU et al., 2008; CARVALHO et al., 2008; CLARINDO, CARVALHO, 2009; KARSBURG et al., 2009). A presente espécie apresenta 2n = 22 cromossomos (Figura 1), concordando com Fedorov (1969); Soontornchainaksaeng e Jenjittikul (2003); Carvalho et al. (2008); Dahmer et al. (2009). E discordando com Saturnino et al. (2005) que relata 2n = 18 cromossomos. Em relação à posição do centrômero (Figura 1), foram observados 5 pares de cromossomos metacêntricos (1, 2, 5, 6 e 11) e 6 pares de cromossomos submetacêntricos (3, 4, 7, 8, 9 e 10), concordando com a descrição realizada por Carvalho et al. (2008). Figura 1: Cromossomos de meristemas radiculares de Jatropha curcas pré tratados com Trifluralin 3µM durante 16 horas a 4ºC. Metáfase com os cromossomos corados com Giemsa 5% e cariótipo, 2n = 22 cromossomos (5M + 6SM). Barra = 5 μm. Duranteas avaliações realizadas nas células em metáfase de J. curcas foi evidenciado que os pares cromossômicos apresentam diferenças métricas entre todos pares cromossômicos e a variação dos tamanhos entre os pares cromossômicos foi de 1,76 a 1,00 μm (Tabela 2). Sendo classificados como cromossomos pequenos por serem menores de 2 μm, segundo Guerra (1988). Não confirmando as observações relatadas por Carvalho et al. (2008), que verificou entre os pares cromossômicos, 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 e 9-10 eram similares quanto ao tamanho e morfologia na população Gonçalo e com poucas variações entre a maioria dos pares cromossômicos. As variações morfológicas muitas vezes estão associadas ao grau de compactação da cromatina, dependendo da substancia química utilizada e do tempo de ação dos agentes bloqueadores. E ainda a estudos, Goiânia,. 39, n. 2, p , abr./jun

5 morfometria cromossômica também pode estar associada a variações dentro da própria espécie. Tabela 2: Medidas e morfologia dos cromossomos de Jatropha curcas, de acordo com a posição do centrômero Cromossomo Comprimento Total (µm) Razão entre Braços Índice Centromérico (IC) Morfologia Cromossômica 1 1,76 1,32 56,82 M 2 1,74 1,26 44,25 M 3 1,43 1,75 34,97 SM 4 1,36 1,56 46,32 SM 5 1,33 1,22 45,11 M 6 1,22 1,30 43,44 M 7 1,17 1,92 34,19 SM 8 1,15 2,19 22,60 SM 9 1,12 2,39 29,46 SM 10 1,11 2,08 32,43 SM 11 1,00 1,13 47,00 M Total 14,39 Nota: Razão entre braços = Braço longo/braço curto; ÍC = Braço curto/ comprimento total x 100; M = metacêntrico; SM = submetacêntrico. Apesar dos cromossomos de J. curcas serem pequenos, foi possível a caracterização das constrições primárias a identificação da região organizadora nucleolar (RON) pelo bandeamento Ag-NOR, localizada na porção média do centromero nos pares de cromossomos 1 e 3 (Figura 2). Considerando que, durante a mitose, as RONs ativas são aquelas em que o rdnas estão associados com proteínas que se associam com a prata (ROUSSEL et al., 1996); Morais-Cecílio et al., (2000); Besendorfer et al., (2002); Brasileiro-Vidal et al., (2003), Almeida e Carvalho (2004); Neves et al., (2005), Clarindo e Carvalho (2006), a presença da RON ativa indica que os pares de cromossomos 1 e 3 possuem os domínios cromossômicos em torno do qual são organizados nucléolos no final da mitose, quando a transcrição do rdna é iniciada. Figura 2: Cromossomos de meristemas radiculares de Jatropha curcas pré tratados com Trifluralin 3µM durante 16 horas a 4ºC. Cromossomos corados com AgNO3 durante 18 horas a 36ºC com presença da NOR ativa nos pares cromossômicos 1 e 3. Barra = 5 μm

6 Durante a interfase, dois nucléolos foram identificados por célula (Figura 3). O número de NORs e dos nucléolos encontrado em J. curcas pode ser considerada característica de diplóide. Geralmente, os poliplóides mostram RONs menos visíveis nos conjunto cromossomico do que o esperado pela soma dos genomas diplóides (VAUGHAN et al., 1993; AARESTRUP et al., 2008). A redução do número de RONs e dos nucléolos durante poliploidização também pode estar associada supressão nucleolar (VAUGHAN et al.,1993). Figura 3: Célula em interfase corada com AgNO3 durante 18 horas a 36ºC com presença de dois nucléolos. Barra = 5 μm CONCLUSÃO Os padrões cromossômicos revelados pela impregnação com nitrato de prata e a distinção das constrições primárias, permitem com este estudo afirmar que J. curcas é uma espécie diplóide e as informações apresentadas podem servir para outros estudos citogenéticos mais abrangentes e que as metodologias utilizadas para a caracterização dos cromossomos podem servir para outras espécies que possuam cromossomos pequenos. IDENTIFICATION OF THE NUCLEOLAREGION ORGANIZER OF THE Jatropha curcas L. Abstract: the seeds of Jatropha curcas stands out for its high oil content. The objective was to identify the NOR in metaphase chromosomes. The root tips were subjected to antimitotic substances, fixation, digestion and cellular cell dissociation. Jatropha curcas has 2n = 22 chromosomes (5M+ 6SM), small ranging from 1.76 to 1.00 micrometers. The NOR has been identified in chromosomes 1 and 3. estudos, Goiânia,. 39, n. 2, p , abr./jun Keywords: Cytogenetics. Euphorbiaceae. NOR. AgNO 3. Chromosomes.

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