MELHORAMENTO PARA RESISTÊNCIA À LEPROSE DOS CITROS

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1 MELHORAMENTO E BIOTECNOLOGIA MELHORAMENTO PARA RESISTÊNCIA À LEPROSE DOS CITROS MARINÊS BASTIANEL 1, ANTONIO CARLOS DE OLIVEIRA 2, MARIÂNGELA CRISTOFANI 1, JULIANA FREITAS-ASTÚA 1,3, VANDECLEI RODRIGUES 1, FERNANDA ARRIVABEM 1 e MARCOS ANTÔNIO MACHADO 1 RESUMO Nos últimos anos, o Centro APTA Citros Sylvio Moreira/ IAC vem conduzindo um amplo programa de melhoramento genético de citros, o qual usa de estratégias clássicas do melhoramento e de procedimentos da biotecnologia, visando à obtenção de novas variedades comerciais, principalmente com resistência às mais importantes doenças da citricultura brasileira. Entre essas, a leprose, causada pelo vírus da leprose dos citros (CiLV), merece destaque por ser a mais importante virose da cultura no País, por serem todas as variedades comerciais de laranjas-doces altamente suscetíveis ao vírus e pelos altos custos demandados para o controle do seu vetor, o ácaro da leprose (Brevipalpus phoenicis). Desde 2002, a resposta de híbridos obtidos entre tangor Murcott e laranja Pêra, respectivamente resistente e suscetível à doença e infestados com ácaros virulíferos,vem sendo avaliada em campo e em casa de vegetação. Após três anos de avaliações, selecionaram-se 88 híbridos com alta resistência genética em ambas as condições ambientais e sob alta pressão de inóculo e de vetor. Essas novas combinações genéticas representam materiais promissores para a citricultura do ponto de vista da resistência varietal ao CiLV e, concomitantemente, estão 1 Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC. Rod. Anhanguera, km 158, Caixa Postal 04, Cordeirópolis (SP). 2 DCN/UESB, Vitória da Conquista (BA). 3 EMBRAPA Milho e Sorgo, Sete Lagoas(MG). ARTIGO TÉCNICO

2 388 MARINÊS BASTIANEL et al. sendo também avaliadas para outras características agronômicas de interesse comercial. Termos para indexação: Citrus, doenças, vírus, melhoramento genético e CiL-C. SUMMARY BREEDING FOR RESISTANCE TO CITRUS LEPROSIS In the last years, the Centro APTA Citros Sylvio Moreira /IAC has led a wide program of genetic improvement of citrus, using both classical and biotechnological tools. This program seeks to provide new commercial varieties with resistance against the main diseases that affect the Brazilian citriculture. Among those, leprosis, caused by the Citrus leprosis virus (CiLV), is considered the most important viral disease of the culture in Brazil, not only because it affects all commercial varieties of sweet orange but also due to the high costs for the control of the mite vector, Brevipalpus phoenicis. Since 2002, hybrids obtained between Murcott tangor and Pera sweet orange, respectively resistant and susceptible to the disease, have been evaluated under field and greenhouse conditions for their response to leprosis after viruliferous mites infestation. After three years of evaluations, 88 hybrids that showed high genetic resistance in both environmental conditions and under high and continuous inoculum and vector pressure were selected. Those new genetic combinations represent promising materials for leprosis resistance and are being assessed for other agronomic characteristics of commercial interest. Index terms: Citrus, diseases, virus, improvement and CiLV-C. 1. INTRODUÇÃO A leprose dos citros foi constatada, pela primeira vez, no Estado de São Paulo, em 1931, em um pomar de laranja Bahia [C. sinensis (L.) Osb.] no município de Sorocaba (BITANCOURT, 1955) e, desde então, constitui um sério problema da citricultura paulista. Já na década dos 80s, a doença

3 MELHORAMENTO PARA RESISTÊNCIA À LEPROSE DOS CITROS 389 era considerada a principal virose da citricultura desse Estado (MÜLLER & COSTA, 1991). Muitos fatores contribuem para que hoje, passados mais de 70 anos, a leprose ainda seja um dos principais problemas fitossanitários dos citros. Dentre esses, destaca-se o fato de cerca de 80% das plantas dos pomares citrícolas serem variedades de laranjas doces altamente suscetíveis à leprose e à presença do vetor da doença, o ácaro Brevipalpus phoenicis, e do patógeno, o vírus da leprose dos citros (CiLV), em todas as regiões citrícolas do Estado de São Paulo (SALVA & MASSARI, 1995). Isso faz com que a população do vetor deva ser mantida em baixas densidades no pomar o ano todo, com vistas a evitar grandes perdas de produção, o que resulta em gastos anuais com acaricidas que ultrapassam os 75 milhões de dólares (RODRIGUES & MACHADO, 2000). O controle químico do ácaro da leprose, principal medida adotada para o controle da doença (SALVO FILHO, 1997), representa, em média, cerca de 50% do valor gasto em tratamentos fitossanitários da citricultura (GHILARDI et al., 2004). Essa preocupação com o controle do vetor tem-se justificado pelo grande risco de perdas na produção que a leprose dos citros pode acarretar. A doença, freqüentemente, causa lesões locais em folhas e ramos, desfolha, seca de ramos (RODRIGUES et al., 2003) e lesões em frutos, acarretando redução de seu valor comercial. Além disso, frutos atacados pela leprose são mais suscetíveis à queda antes do amadurecimento, podendo, em variedades altamente suscetíveis, ocasionar perdas de até 100% da produção (RODRI- GUES et al., 2000). Dessa forma, faz-se necessário buscar formas alternativas de controle para a leprose dos citros, como a utilização de variedades resistentes, para minimizar os prejuízos econômicos e conseqüentes efeitos ecológicos do emprego de controle químico do ácaro. Entretanto, a inexistência de variedades naturalmente resistentes de laranja-doce à leprose (RODRIGUES et al., 2000, 2003) demanda esforços mediante o melhoramento genético para a obtenção de novas variedades que apresentem resistência à doença e sejam economicamente viáveis. Existem relatos de variedades/espécies de citros resistentes à doença (RODRIGUES et al., 2003) como, por exemplo, o tangor Murcott (C.

4 390 MARINÊS BASTIANEL et al. reticulata Blanco x C. sinensis Osb.), híbrido de tangerina e laranja-doce que se tem mostrado bastante resistente à leprose tanto em condições normais de plantio quanto em casa de vegetação (RODRIGUES et al., 2003; BAS- TIANEL et al., 2004). Entretanto, essa não é uma variedade adequada para a indústria de suco concentrado congelado, que constitui o item de comercialização mais importante da citricultura brasileira. Os programas tradicionais de melhoramento de citros esbarram em alguns obstáculos decorrentes da biologia da espécie, como, por exemplo, o longo período de juvenilidade e, conseqüentemente, longo ciclo seletivo, alta heterozigosidade e, ainda, a poliembrionia, que gera um grande número de plantas nucelares, isto é, com a mesma constituição genética da planta mãe (CAMERON & FROST, 1968). Nesse sentido, a biologia molecular tem fornecido ferramentas fundamentais para a agilização de programas de melhoramento de citros nos últimos anos, merecendo destaque a identificação precoce das plantas de origem sexual (BASTIANEL et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2000, 2002) e a construção de mapas genéticos via marcadores moleculares e posterior localização de regiões genômicas associadas à resistência a doenças (CRISTOFANI et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2004), e outras características agronômicas. O Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC iniciou, em 1997, um programa de melhoramento genético para a resistência à leprose, com dois objetivos principais. Primeiro, obter novas variedades de híbridos de laranja-doce resistentes ao CiLV com potencial para a citricultura paulista e, segundo, buscar melhor entendimento do mecanismo genético da resistência à doença encontrada em algumas variedades de citros. Este trabalho aborda as estratégias utilizadas para a realização deste programa e seus principais resultados parciais decorridos oito anos de sua implantação. 2. MATERIAL E MÉTODOS Cruzamentos dirigidos - Parentais contrastantes em relação à resposta à doença foram escolhidos para a realização do cruzamento, viabilizando, assim, o estudo da herança da resistência. Efetuaram-se polinizações entre tangor Murcott (parental feminino, resistente à leprose) e laranja

5 MELHORAMENTO PARA RESISTÊNCIA À LEPROSE DOS CITROS 391 Pêra (parental masculino, altamente suscetível à doença) na primavera de Isolaram-se as flores polinizadas com sacos de papel, por um prazo máximo de sete dias, para evitar polinização não controlada via insetos e vento. Coletaram-se os frutos 330 dias após a polinização, quando as sementes foram extraídas e germinadas em sementeiras, tubetes e em cultura de tecido até a formação de plântulas. Estimou-se número de sementes por fruto pela contagem de todas as sementes de dez frutos amostrados ao acaso, e o número de embriões por semente pela contagem dos embriões em cem sementes. Identificação de híbridos - Realizou-se uma pré-seleção de plantas híbridas por características morfológicas (formato de folhas). Posteriormente, usaram-se marcadores moleculares RAPD (random amplified polymorphic DNA) e microssatélites para a confirmação da origem híbrida dessas plantas (OLIVEIRA et al., 2000, 2002). Avaliação fenotípica - As plantas foram enxertadas em limão Cravo (C. limonia Osbeck) em dois experimentos em Cada experimento foi composto de 143 híbridos identificados na etapa anterior com dez repetições de cada híbrido e de ambos os parentais, arranjadas em delineamento de blocos casualizados (experimento de campo) e delineamento inteiramente casualizado (experimento de telado). Infestaram-se ambos os experimentos com ácaros virulíferos na primavera de Para tal, uma população de ácaros obtidos a partir de uma única fêmea, coletada em um pomar de laranja Pêra com leprose, foi multiplicada em frutos de laranja doce ao longo de Submeteram-se os ácaros obtidos a um período de aquisição de 48 horas em folhas de laranja Pêra com sintomas de leprose por 48 horas. Posteriormente, empregaramse ácaros virulíferos para a infestação na razão de 30 ácaros/planta. Para a quantificação da doença, foram mensuradas variáveis de natureza fitopatológica, bem como variáveis relacionadas ao crescimento das plantas. A mensuração de tais variáveis deu-se mediante o emprego de duas escalas: uma descritiva de notas, que considera a severidade da doença em diversos setores e órgãos da planta (RODRIGUES, 2000) e uma escala diagramática, que mede a área foliar com lesão (RODRIGUES et al., 2002). Mensurou-se, ainda, a porcentagem de folhas com sintomas, o número de

6 392 MARINÊS BASTIANEL et al. ácaros em uma amostra de 20 folhas/planta, a altura e o diâmetro de tronco. Todas essas variáveis, exceto o número de ácaros, foram avaliadas anualmente desde 2003 para o experimento de campo. Para o de telado, apenas a escala descritiva de notas foi empregada desde o surgimento dos primeiros sintomas. Realizaram-se as análises estatísticas através dos aplicativos Bio- Estat (AYRES & AYRES, 2000), e Selegen (RESENDE, 2000, 2002). Construção de um mapa genético e identificação de QTL s Um mapa genético para citros foi construído utilizando-se o programa JoinMap (VAN OOIJEN & VOORRIPS, 2001), com marcadores AFLP e RAPD de segregação mendeliana 1:1 e 3:1 (BASTIANEL et al., 2003). As médias das variáveis fitopatológicas foram utilizadas para localização de regiões genômicas de citros ligadas à resistência à leprose (QTL s) via aplicativo MAPQTL (VAN OOIJEN et al., 2002). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Das polinizações efetuadas em flores de tangor Murcott, obtiveram-se 599 frutos (10,07% de pegamento) que continham, em média, 19,3 sementes por fruto e 3,4 embriões por semente (OLIVEIRA et al., 2000, 2002). Entre as plântulas germinadas, selecionaram-se, aproximadamente, que apresentavam morfologia foliar que sugeriam a sua natureza como híbridos entre tangerina Murcott e laranja-doce Pêra, isto é, que apresentavam formato de folha diferente do parental feminino tangor Murcott. A geração de marcadores moleculares RAPD e microssatélites genótipo-específicos para tangor Murcott e laranja Pêra permitiu identificar, inequivocamente, 376 híbridos entre essas plantas (OLIVEIRA et al., 2000, 2002; CRISTOFANI et al., 2005). Entre eles, 143 híbridos foram selecionados ao acaso e multiplicados vegetativamente para o estabelecimento dos experimentos de campo e telado para avaliação fenotípica da doença. Os primeiros sintomas típicos de leprose foram observados cerca de seis meses após as infestações com ácaros virulíferos para ambos os experimentos. Inicialmente, verificou-se a formação de reboleiras; entretanto, passados três anos da infestação, a doença estava amplamente distribuída entre as repetições de todos os genótipos, tanto no experimento do campo quanto no de telado.

7 MELHORAMENTO PARA RESISTÊNCIA À LEPROSE DOS CITROS 393 Todas as dez mudas que constituíam as repetições de laranja Pêra foram altamente suscetíveis à leprose; no experimento de campo, todas foram mortas em vista da grande severidade dos sintomas. O mesmo se observou em alguns híbridos que apresentaram, por ocasião da última avaliação (maio de 2005), grande número de parcelas/repetições mortas em ambos os experimentos, possivelmente pelo fato de as plantas serem relativamente pequenas (em média 2 m de altura e 4 cm de diâmetro de tronco). No entanto, não se verificaram correlações (r) significativas (p < 0,05) entre a severidade da doença e variáveis de crescimento (altura e diâmetro de tronco), indicando que as plantas de menor tamanho nem sempre eram as mais suscetíveis. No total, 60 híbridos revelaram uma alta incidência e severidade de sintomas em folhas e ramos, sendo considerados altamente suscetíveis, ao passo que 88 híbridos revelaram poucos sintomas em folhas, mesmo sob alta pressão do vetor e inóculo, e foram considerados de mediana a altamente resistentes à leprose. Entre os híbridos resistentes, 15 foram imunes, isto é, não demonstraram nenhum sintoma visual da doença, a exemplo do tangor Murcott, que não apresentou sintomas em nenhuma das duas condições experimentais avaliadas nesse estudo. A ausência de sintomas no tangor Murcott, sinalizando sua alta resistência ou tolerância ao CiLV, e a alta suscetibilidade da laranja Pêra, corroboram as informações encontradas na literatura quanto à resposta, em condições de campo, dessas variedades ante a leprose dos citros (BOARET- TO & CHIAVEGATO, 1994; RODRIGUES et al., 1995, 2000; BASTIA- NEL et al., 2004). Todas as variáveis associadas à expressão da doença, exceto quantidade de ácaros, correlacionam-se significativamente (p < 0,05) entre si. Incidência e severidade estão altamente relacionadas (r = 0,62 a 0,90), indicando que a resposta a eventos primários de infecção pelo vírus é decisiva na resposta do genótipo. As altas correlações entre essas variáveis permitem utilizá-las para estimar a resistência da doença em híbridos, podendo ser escolhidas em função da facilidade de avaliação e características dos experimentos. Já a variável quantidade de ácaros não apresentou correlação significativa com as demais [incidência, severidade da leprose e variáveis de crescimento (altura e diâmetro)]. A ausência de correlação entre a presença

8 394 MARINÊS BASTIANEL et al (7.616; (15.233; ) ) (725; 1.450) 725 (1450; 2.175) (22.850; ) (30.466; ) (38.083; ) (45.699; ) (53.315; ) Folhas com sintomas (%), ano 3 (2.175; 2.900) (2.900; 3.625) (3.625; 4.350) (4.350; 5.075) (5.075; 5.800) (60.932; ) (5.800; 6.525) > > Escala diagramática (% de área foliar com sintomas), ano (488; 976) 488 (976; 1.464) (1.464; 1.952) (1.952; 2.440) (2.440; 2.928) (2.928; 3.416) (3.416; Escala descritiva (notas 0-5), ano 3 (3.904; 4.392) > Figura 1. Distribuição de médias para as variáveis de incidência e severidade da leprose mensuradas em 143 híbridos de tangor Murcott e laranja Pêra, juntamente com os genitores, avaliadas por três anos após a infestação com ácaros virulíferos. Ambos os genitores, laranja Pêra e tangor Murcott, permaneceram nas classes extremas dos histogramas.

9 MELHORAMENTO PARA RESISTÊNCIA À LEPROSE DOS CITROS 395 do vetor e a ocorrência de sintomas sugere que as plantas não apresentaram resposta diferencial à colonização do ácaro, conforme relatado por BOARETTO & CHIAVEGATO (1994) e RODRIGUES et al. (2000). Os histogramas de freqüência de distribuição dos valores médios das variáveis de incidência (porcentagem de folhas com sintomas) e severidade (escalas descritiva e diagramática) apresentaram uma distribuição não contínua em ambos os experimentos (telado e campo) (Figura 1). Encontraram-se altos valores de coeficientes de herdabilidade (h 2 ) da resistência para leprose, de 0,84 e 0,91 para as variáveis fitopatológicas, valores próximos aos achados para características qualitativas, sugerindo que um gene de maior efeito, ou poucos genes podem estar envolvidos na herança genética da leprose nos citros. De fato, foi localizado um QTL de grande efeito (explicando 79% do fenótipo), relacionado com a resistência à leprose no mapa genético de citros. O grande número de híbridos altamente resistentes à doença (88) identificados no presente trabalho torna-os bastante promissores para sua utilização na resistência varietal ao CiLV. Esses híbridos encontram-se, atualmente, em avaliações de campo para outras características agronômicas desejáveis. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AYRES, M.; AYRES JR., M.; AYRES, D.L. & SANTOS, A.S. BioEstat: aplicações estatísticas nas áreas das ciências biológicas e médicas. Belém:Editora Mamirauá, p. BASTIANEL, M.; FREITAS-ASTÚA, J.; RODRIGUES, V.; ARRIVABEM, F.; ANTONIOLI-LUIZON, R. & MACHADO, M.A. Resposta do tangor Murcott à inoculação do vírus da leprose dos citros em campo e em casa de vegetação. Laranja, Cordeirópolis, v.27, n.2, p , BASTIANEL, M.; OLIVEIRA, A.C.; CRISTOFANI, M.; RODRIGUES, V.; RODRI- GUES, J.C.V. & MACHADO, M.A. Mapa genético de tangor Murcott (Citrus sinensis (L.) Osbeck x Citrus reticulata Blanco) e laranja Pêra (C. sinensis (L.) Osbeck) com marcadores AFLP. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MELHO- RAMENTO DE PLANTAS, 2., Porto Seguro. Program & Abstract Porto Seguro: SBMP, 2003, DD-ROM. BASTIANEL, M.; SCHWARZ, S.F.; COLETTA FILHO, H.D.; LEE, L.L.; MA- CHADO, M. & KOLLER, O.C. Identification of zygotic and nucellar tangerine seedlings (Citrus spp.) using RAPD. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v.21, n.1, p , 1998.

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12 398 MARINÊS BASTIANEL et al.

13 399 ERRATA No artigo científico É móvel ou imóvel o boro em laranjeira?, publicado na Revista Laranja, Cordeirópolis, v.25, n.1, p , 2004, as correções abaixo são necessárias. Nas p , onde se lê: % B ppf = [(RI amostra - RI natural ) / (RI adubo - RI natural )] x 100 (1) RI amostra = razão isotópica 11 B/ 10 B da amostra; RI natural = razão isotópica 11 B/ 10 B, igual a 4,044 e RI adubo = razão isotópica 11 B/ 10 B do ácido bórico empregado no preparo da solução para aplicação foliar ou na solução do solo, igual a 0,080. Leia-se: % B ppf = [(At. % 10 B amostra - At. % 10 B natural ) / (At. % 10 B adubo - At. % 10 B natural )] 100 (1) At. % 10 B amostra = Porcentagem de átomos de 10 B na amostra; At. % 10 B natural = Porcentagem de átomos de 10 B natural; At. % 10 B adubo = Porcentagem de átomos de 10 B no ácido bórico empregado no preparo da solução para aplicação foliar ou na solução do solo.