RESPOSTA DO TANGOR MURCOTT À INOCULAÇÃO DO VÍRUS DA LEPROSE DOS CITROS EM CAMPO E EM CASA DE VEGETAÇÃO

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1 FITOPATOLOGIA RESPOSTA DO TANGOR MURCOTT À INOCULAÇÃO DO VÍRUS DA LEPROSE DOS CITROS EM CAMPO E EM CASA DE VEGETAÇÃO MARINÊS BASTIANEL 1,2, JULIANA FREITAS-ASTÚA 2,3, VANDECLEI RODRIGUES 2, RENATA ANTONIOLI-LUIZON 2, FERNANDA ARRIVABEM 2 e MARCOS A. MACHADO 2 RESUMO Considerada a virose mais importante na citricultura paulista, com gastos anuais superiores a 75 milhões de dólares para o controle do seu vetor, a leprose tem sido observada com maior freqüência em laranjas-doces enquanto as tangerinas e alguns de seus híbridos se apresentam menos afetados em condições de campo. Parece não existir resistência à colonização do vetor em nenhum desses grupos, o que sinaliza um caráter de tolerância ou imunidade ao vírus para aquelas variedades, nas quais se observa a ausência de sintomas mesmo sob alta infestação do vetor, como o tangor Murcott (Citrus sinensis L. Osbeck x C. reticulata Blanco). Sendo esse um híbrido de tangerina e laranja-doce, possivelmente tal característica teria sido herdada do grupo das tangerinas. Por ser uma variedade comercial com características agronômicas desejáveis, o híbrido tem despertado interesse para utilização em programas de melhoramento genético. Neste estudo, objetivou-se avaliar a resposta do tangor Murcott à inoculação do vírus da leprose 1 Departamento de Genética e Evolução, UNICAMP, Caixa Postal Campinas (SP). mbastianel@centrodecitricultura.br 2 Centro APTA Citros Sylvio Moreira, Caixa Postal Cordeirópolis (SP). 3 Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas (MG). COMUNICAÇÃO

2 338 MARINÊS BASTIANEL et al. dos citros (Citrus leprosis virus - CiLV) em campo e em casa de vegetação. A avaliação dos sintomas e os resultados obtidos por RT-PCR para detecção do vírus da leprose confirmam que esse híbrido apresenta tolerância ou alta resistência à leprose, podendo ser utilizado em programas de melhoramento visando à obtenção de variedades menos suscetíveis à doença. Termos de indexação: RT-PCR, CiLV, melhoramento de citros SUMMARY RESPONSE OF MURCOTT TANGOR TO INOCULATION OF CITRUS LEPROSIS VIRUS UNDER FIELD AND GREENHOUSE CONDITIONS Citrus leprosis is considered the most important viral disease affecting citrus in Brazil, where it causes yearly losses of US$ 75 million for the control of its mite vector. Leprosis is often observed in sweet orange varieties and is less common in mandarins and their hybrids. Since none of these varieties exhibit resistance to the mite colonization, it has been suggested that plants of the varieties that remain asymptomatic under high infestation of the vector have tolerance or immunity to the virus. An example of such variety is Murcott tangor (Citrus sinensis L. Osbeck x C. reticulata Blanco), a hybrid between mandarin and sweet orange, which possibly inherited such characteristic from the group of the mandarins. Since Murcott is a commercial variety bearing good agronomical characteristics, this hybrid has been used in citrus breeding programs. The objective of this study was to assess the response of Murcott tangor to Citrus leprosis virus (CiLV) inoculation under field and greenhouse conditions. Symptom analyzes and viral detection through RT-PCR confirm that this hybrid exhibits tolerance or resistance to leprosis, and can be used in breeding programs with the objective of obtaining varieties less susceptible to the disease. Index terms: RT-PCR, CiLV, citrus breeding.

3 RESPOSTA DO TANGOR MURCOTT À INOCULAÇÃO DO VÍRUS INTRODUÇÃO A leprose dos citros é relatada no Brasil desde a década de 1930, tendo sido encontrada primeiramente em folhas de laranja Baia (C. sinensis L. Osb.), no município de Sorocaba (SP) (BITANCOURT, 1955, 1956). Anteriormente, a leprose havia sido relatada na Flórida (EUA), Argentina, Paraguai e Venezuela (BITANCOURT, 1955). Recentemente, foi encontrada no Panamá (DOMINGUEZ et al., 2001), Costa Rica (ARAYA GONZÁLES, 2000), Guatemala (MEJIA et al., 2002) e, possivelmente, na Colômbia (M. GIRALDO JARAMILLO, ICA-Colombia, 2004, comunicação pessoal) e no México (H. SÁNCHEZ ANGUIANO, Senasica-México, 2004, comunicação pessoal). Entretanto, ao contrário da Flórida, onde a doença não ocorre na atualidade, no Brasil a leprose dos citros continua sendo um sério problema fitossanitário, principalmente no Estado de São Paulo, embora ocorra em outros Estados (BITANCOURT, 1955; FREITAS-ASTÚA et al., 2004a,b; LOCALI et al., 2004). São conhecidas três espécies do gênero Brevipalpus como vetores da leprose. VERGANI (1945) demonstrou que a doença, chamada de lepra explosiva no Paraguai e na Argentina, era transmitida pelo ácaro Brevipalpus obovatus, enquanto, na Flórida, o ácaro B. californicus foi associado à leprose (KNORR, 1950). No Brasil, MUSUMECCI & ROSSETTI (1963) comprovaram a transmissão por B. phoenicis. Partículas similares a vírus e efeitos citopáticos similares aos induzidos pelo Orchid fleck virus (OFV) foram observados em 1972 nos tecidos de lesões foliares de leprose (KITAJIMA et al., 1972). Entretanto, exames posteriores revelaram partículas baciliformes curtas no retículo endoplasmático e viroplasma denso no citoplasma (KITAJIMA et al., 1974; COLARICCIO et al., 1995), e que se mostrou ser a forma prevalente do vírus (LOCALI et al., 2003). Esse tipo de vírus é referido como citoplasmático (CiLV-C) (RODRIGUES et al., 2003), em contraposição ao tipo descrito em 1972, referido como nuclear (CiLV-N), de rara ocorrência, tendo sido encontrado no Panamá (DOMINGUEZ et al., 2001) e em algumas localidades do Estado de São Paulo e Rio Grande do Sul (FREITAS-ASTÚA et al., 2004b; KITAJIMA et al., 2004).

4 340 MARINÊS BASTIANEL et al. A importância da leprose na citricultura brasileira, considerada a principal virose dos citros na atualidade, está relacionada, principalmente, com o alto custo para o controle químico do seu vetor, o ácaro B. phoenicis, que pode alcançar mais de 75 milhões de dólares anuais (RODRIGUES & MA- CHADO, 2000). A presença do vetor nos pomares tem sido o principal fator para tomada de decisão para o controle da leprose no campo (SALVO FI- LHO, 1997). Por ser um vetor cosmopolita e polífago, podendo ser encontrado não só em citros, mas, também, em mais de 450 outras espécies vegetais (CHILDERS et al., 2003), seu controle é ainda mais difícil. As laranjas-doces são, freqüentemente, relacionadas na literatura como as variedades cítricas mais suscetíveis à leprose (BITANCOURT, 1955; CHIAVEGATO & MISCHAN, 1987; RODRIGUES et al., 2000), tendo sido demonstrado que tangerinas e mandarinas são significativamente mais resistentes ao CiLV-C (BITANCOURT, 1955, 1956; CHIAVEGATO & MISCHAN, 1987; SALVO FILHO, 1997; RODRIGUES et al., 2003). Observações preliminares sugerem que o mesmo ocorre em relação ao CiLV-N (E.W. KITAJIMA, comunicação pessoal). Entretanto, apesar de se observar resistência genética ao vírus entre as tangerinas, poucos estudos têm sido relatados buscando variedades resistentes à leprose dentro desse grupo de citros. Os sintomas característicos da leprose são lesões locais, ou seja, restritas aos locais de inoculação do vírus pelo ácaro (KITAJIMA et al., 1972; COLARICCIO et al., 1995) e atingem toda a parte aérea da planta, podendo ocasionar reduções drásticas na produção, determinadas pela queda prematura de folhas e frutos e seca de galhos, ocasionando, muitas vezes, a morte de plantas (RODRIGUES, 2000). Em folhas, as lesões são normalmente rasas, visíveis nas duas faces, porém bastante variáveis mesmo entre laranjas- -doces e em outras espécies e variedades de citros (BITANCOURT, 1955; RODRIGUES, 2000). Por não ser uma doença sistêmica, como a maioria das viroses, o ácaro tem considerável importância na epidemiologia da doença, uma vez que sua ocorrência é condição fundamental para sua disseminação dentro de e entre plantas (RODRIGUES, 2000). A leprose dos citros pode ser facilmente identificada pelas lesões locais típicas, em folhas, ramos e frutos (RODRIGUES, 2000; RODRIGUES et al., 2003), por microscopia eletrônica de tecidos lesionados (KITAJIMA

5 RESPOSTA DO TANGOR MURCOTT À INOCULAÇÃO DO VÍRUS et al., 1972; COLARICCIO el al., 1995; DOMINGUEZ et al.; 2001), ou, ainda, por diagnose molecular, através de pares de primers obtidos pelas informações do genoma do vírus (LOCALI et al., 2003). Entre os estudos desenvolvidos pelo Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC envolvendo o patossistema vetor-patógeno-hospedeiro, avaliou- -se o tangor Murcott quanto à resposta à inoculação do CiLV-C por ácaros em condições de campo e em casa de vegetação. Essa variedade, além de sua relativa importância comercial, tem sido incluída em programas de melhoramento genético com vistas à obtenção de variedades resistentes a doenças como a leprose e a clorose variegada dos citros (OLIVEIRA, 2003; BASTIANEL et al., 2004) Avaliação no campo 2. MATERIAL E MÉTODOS Dez mudas de tangor Murcott (Citrus sinensis L. Osbeck x C. reticulata Blonco) e dez de laranja Pêra (C. sinensis L. Osbeck), enxertadas sobre limão Cravo (C. limonia Osbeck), foram plantadas no campo em 2001, distribuídas em 10 blocos ao acaso, juntamente com 148 híbridos F 1 obtidos do cruzamento de ambas as variedades. O experimento foi desenvolvido no Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC, em Cordeirópolis (SP). Ácaros provenientes de laranja com sintomas de leprose (população 17), mantidos na Clínica Entomológica, foram multiplicados em frutos de laranja-doce em condições laboratoriais. Os ácaros foram colocados para se alimentar em folhas de laranja-doce sintomáticas para leprose, coletadas na fazenda Areão, Piracicaba (SP) (gentilmente cedidas pela Dra. Neusa Nogueira, CENA/USP) por um período de 48 horas. Após esse período, os ácaros supostamente virulíferos foram transferidos para as plantas no campo (30 ácaros/ planta) e, as inoculações no campo, realizadas em meados de A resposta das plantas à doença no campo foi obtida por avaliações periódicas da incidência de sintomas característicos da leprose. Decorridos 18 meses da infestação, avaliou-se, também, o número de ácaros nas plantas, mediante uma amostragem de 20 folhas por planta.

6 342 MARINÊS BASTIANEL et al Avaliação em casa de vegetação Duas plantas de tangor Murcott e duas plantas de laranja Pêra foram inoculadas com ácaros virulíferos para CiLV-C, conforme método descrito para o experimento de campo, utilizando-se, para cada variedade, 10 folhas jovens delimitadas com cola entomológica (10 ácaros/folha). As plantas estavam em vasos de 1kg de substrato e encontravam-se com poucas folhas por ocasião da infestação. A avaliação para a presença de CiLV-C foi realizada em duas épocas: 10 e 30 dias após o aparecimento dos primeiros sintomas na variedade suscetível laranja Pêra, coletando-se cinco folhas, ao acaso, em cada uma das épocas. As amostras coletadas foram maceradas com nitrogênio líquido, postas em tubos plásticos de 1,5 ml e armazenadas a -80 C até a extração do RNA total, de acordo com o método de GIBBS & MACKENZIE (1997). A detecção do vírus foi realizada por meio de um teste de diagnóstico de leprose desenvolvido por LOCALI et al. (2003), que consiste na amplificação, via RT-PCR, de regiões do genoma do CiLV-C, codificadoras das proteínas de movimento e replicase do vírus utilizando primers específicos para essas regiões (MP e Rep). Como controle positivo e negativo, utilizaram-se folhas com sintomas típicos de leprose e folhas sadias de laranja Pêra ; respectivamente. Alíquotas dos produtos da RT-PCR foram observadas em gel de agarose 1% (TAE 1X), corado com brometo de etídeo. O teste foi repetido duas vezes para confirmação dos resultados. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os primeiros sintomas de leprose nas plantas mantidas no campo foram observados após seis meses da infestação com os ácaros virulíferos. A demora no surgimento dos sintomas deveu-se, possivelmente, a problemas climáticos e/ou à baixa pressão de inóculo inicial. Decorridos dois anos da inoculação no campo, nenhum sintoma foi observado no tangor Murcott em nenhum dos blocos experimentais, ao passo que 40% das parcelas experimentais da variedade suscetível laranja Pêra estavam mortas, após terem apresentado significativa desfolha e seca de ramos.

7 RESPOSTA DO TANGOR MURCOTT À INOCULAÇÃO DO VÍRUS As respostas dos híbridos têm sido variáveis, de altamente suscetíveis, levando à morte da parcela experimental, a altamente resistentes (dados não apresentados). A segregação da resistência na progênie, bem como estudos de QRLs (Quantitative resistance loci) estão sendo analisados e serão empregados na seqüência dos trabalhos, para sugerir o tipo de resistência (mono, oligo ou poligênica) à leprose nos citros. Em relação à presença do vetor nas plantas, o tangor Murcott apresentou maior número de ácaros (1,12) que a laranja Pêra (0,12) (média de 10 plantas), confirmando que o híbrido não apresenta resistência ao ácaro, como sugerido por CHIAVEGATO & MISCHAN (1987), BOARETTO & CHIAVEGATO (1994) e RODRIGUES (1995). De maneira geral, os sintomas de leprose mais freqüentemente observados nas plantas, em ambos os experimentos, foram semelhantes àqueles descritos na literatura para as laranjas-doces, ou seja, manchas rasas, com um centro ligeiramente escurecido, acompanhado de anéis nem sempre contínuos (fechados) e rodeados marginalmente por uma região amarelada difusa. Em casa de vegetação, os primeiros sintomas em laranja Pêra foram observados 25 dias após a inoculação com ácaros virulíferos. RODRIGUES (2000) observou sintomas de leprose nessa variedade 18 dias após a infestação nas mesmas condições ambientais. O menor tempo demandado para o surgimento dos sintomas nesse experimento em relação ao de campo (seis meses), deveu-se, possivelmente, ao fato de que, em casa de vegetação, a área de circulação do ácaro foi delimitada na própria folha infestada, sendo maior a pressão de inóculo na planta. Das 10 folhas coletadas dessa variedade, apenas duas não apresentavam sintomas por ocasião da coleta (L8 e L10), porém o teste de diagnóstico por RT-PCR foi eficiente para detectar a presença do CiLV-C em todas as suas amostras, em ambas as épocas de coleta, mesmo quando assintomáticas. Isso demonstra a alta suscetibilidade da laranja Pêra ao vírus, que, provavelmente, alcança títulos elevados nas células vegetais, como se pôde observar através das fortes amplificações obtidas através de RT-PCR (Figura1). Nenhum sintoma aparente foi observado nas duas épocas de coleta nas folhas do tangor Murcott, o que demonstra mais uma vez que esse híbrido apresenta um comportamento diferencial ante o vírus da leprose dos

8 344 MARINÊS BASTIANEL et al. citros quando comparado com a laranja Pêra. Entretanto, um produto de amplificação da RT-PCR, com tamanho esperado, porém de baixa intensidade de banda, pôde ser observado em três das amostras foliares de tangor Murcott (M1, M5 e M6), como assinalado na Figura 1. Esse resultado foi consistente nas duas repetições do teste, podendo ser decorrente de uma baixa concentração do vírus encontrada nessas folhas e sugerindo elevada resistência ou tolerância, mas não imunidade, do tangor Murcott ao CiLV-C. Figura 1. Análise eletroforética em gel de agarose, de uma região de 339pb do gene da proteína de movimento do CiLV, via RT-PCR, utilizando primers específicos (MP). M = Marcador molecular 1Kb; C- = Controle negativo; C+ = Controle positivo; L1 a L7 e L9 = amostras de laranja Pêra sintomáticas; L8 e L10 = amostras de laranja Pêra assintomáticas para leprose; M1 a M10 = amostras de tangor Murcott assintomáticas para leprose e A= água (controle negativo). Amostras de Murcott positivas: M1, M5 e M6. Essa informação tem grande importância para a epidemiologia da doença, pois plantas de tangor Murcott seriam fontes potenciais de inóculo do vírus no campo, uma vez que ácaros alimentando-se em folhas aparentemente sadias poderiam adquirir o vírus e transmiti-lo para outras plantas. BOARETTO & CHIAVEGATO (1994) demonstraram, em experimento de casa de vegetação, que ácaros inicialmente avirulíferos, que se alimentaram em folhas assintomáticas de tangor Murcott, mas previamente inoculadas com CiLV-C, foram capazes de transmitir o vírus para plantas de laranja-doce. Segundo esses autores, esse híbrido pode servir de

9 RESPOSTA DO TANGOR MURCOTT À INOCULAÇÃO DO VÍRUS hospedeiro assintomático para o vírus. Além disso, a presença abundante do vetor em plantas do tangor Murcott (CHIAVEGATO & MISCHAN, 1987; BOARETTO & CHIAVEGATO, 1994; RODRIGUES, 1995), aumenta a importância dessa variedade na epidemiologia da doença no campo. Apesar dos indícios de que o tangor Murcott seja altamente resistente à leprose, a detecção do vírus em três das dez amostras, com títulos aparentemente baixos, deixam algumas questões para serem resolvidas, como, por exemplo, se a baixa concentração do vírus na planta seria suficiente para sua aquisição e transmissão pelo ácaro em condições de campo. Assim, para determinar o papel desse híbrido na epidemiologia da doença no campo, faz-se necessário realizar uma avaliação criteriosa em condições normais de plantio e não em condições controladas em casa de vegetação, como realizado nesse estudo ou naquele relatado por BOARETTO & CHIAVEGATO (1994). AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Dra. Neusa Nogueira a cessão do inóculo inicial do CiLV-C, ao Dr. José Carlos Verle Rodrigues, a contribuição na instalação do experimento de campo, ao Eng. Agr. Celso Nogueira (Fischer S/A), o envio de frutos para manutenção de ácaros, à FAPESP e ao CNPq, o apoio financeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAYA GONZÁLES, J. Informe sobre la prospección de la leprosis de los cítricos en la zona fronteriza sur (Costa Rica Panamá). Ministério de Agricultura y Ganadería, p.5. BASTIANEL, M.; OLIVEIRA, A.C.; RODRIGUES, V.; CRISTOFANI, M.; FREITAS-ASTÚA, J. & MACHADO, M.A. Avaliação da herança da resistência à leprose dos citros. Fitopatologia Brasileira, Fortaleza, v.29, p.87, (Supl.) BITANCOURT, A.A. Estudos sobre a leprose dos citros. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.22, p , 1955.

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