MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

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1 MICROBIOLOGIA AMBIENTAL AULA 7 - Microbiologia da água PROF. GUSTAVO H. COUTO Ciclo Hidrológico 1

2 Águas Naturais Água atmosférica: nuvens. Chuva, neve, granizo Água superficial: lagos, riachos, rios, oceanos Água subterrânea: lençóis freáticos Hábitats aquáticos Água doce: lagos, açudes, nascentes, pântanos e rios Marinho: oceanos (maior dos hábitats) Estuários: extensões de água costeira, semifechadas, que apresentam uma conexão livre com o mar aberto. Uma gota de água pode conter compostos químicos e microrganismos de muitas espécies. Microrganismos podem alterar as substâncias químicas e também fornecerem nutrientes para outros organismos aquáticos. A água utilizada pelo homem vem de fontes naturais de água doce. Essa água deve ser tratada para eliminar microrganismos potencialmente patogênicos. 2

3 Qual amostra apresenta maior diversidade de microrganismos? Por quê? Nutrientes estão diluídos: Baixa diversidade microbiana Presença de matéria orgânica: aumenta sua atividade Mudança da composição química da água/ risco para saúde Cianobactérias (ou algas azuis) Floração de cianobactérias - Devido principalmente ao acúmulo de nutrientes ricos em fósforo e nitrogênio - Pode produzir metabólitos secundários que dão gosto e odor desagradáveis à água, além de toxinas - Off-flavor: gosto de barro, inseticida, mofo, que muitas vezes encontramos nos peixes. Gesosmina (GEO) e o 2-Metilisoborneol (MIB): compostos orgânicos que conferem o sabor e odor na água, e deve-se pela proliferação de algas nos mananciais com alto índice de nutrientes, e é ampliada por fatores como luz, poluição, temperatura e chuvas. São totalmente prejudiciais a saúde quando em excesso. 3

4 Cianobactérias (ou algas azuis) - Cianotoxinas: podem ser altamente tóxicas para animais aquáticos, terrestes e humanos através da ingestão ou contato com água contaminada. - Principais toxinas: nodularinas, microcistinas, anatoxinas, saxitoxinas - Toxicidade: hepatóxicas, neurotóxicas, dermatóxicas ou inibidoras da síntese de proteínas de acordo com seu mecanismo de ação. Fenômeno da maré-vermela (red bloom) Dinoflagelados - protistas - Possuem pigmentos fotossintéticos que varia de cor (de verde à marron ou vermelho). Ambientes Aquáticos O que determina a quantidade e tipo de microrganismos no ambiente aquático? - temperatura, luminosidade, ph, pressão, salinidade, turvação e nutrientes. Os microrganismos podem: - Mudar a composição química da água, - Fornecer nutrientes para outros organismos, - Representar um grande risco para a saúde. 4

5 Temperatura Águas superficiais: 0ºC a 40ºC Sob a superfície: mais de 90% do ambiente marinho está t<5ºc: ideal para PSICRÓFILOS Fendas oceânicas: TERMÓFILOS isolados de sedimentos anaeróbios: - Arqueobactéria Pyrodictium occultum (Ilha de Vulcano-Itália, água a 103ºC): bactéria fluindo no fundo do mar. - Bactéria autotrófica anaeróbia que cresce formando H 2 S a partir de H 2 e do enxofre elementar (S). - Estudos de laboratório: P. occultum tem uma temperatura ótima de crescimento 105ºC e não cresce abaixo de 82ºC. Exemplo: Fontes hidrotermais - a temperatura da água pode exceder os 100ºC. - O sulfato quando aquecido reage com a água formando sulfeto de hidrogênio (H2S) - produção primária é assegurada por bactérias quimiossintéticas, que obtêm a energia necessária para a fixação do CO2 a partir da oxidação dos sulfuretos (e em particular do H2S) presentes nos fumos emergentes 5

6 Thermus aquaticus: espécie de bacteria que suporta temperaturas elevadas que foi isolada de um geiser. - É fonte da enzima termoresistente Taq polimerase, uma das principais enzimas utilizadas em biologia molecular para a amplificação de fragmentos de DNA Pressão hidrostática: pressão do fundo de uma coluna vertical de água Aumento de 1 atm a cada 10 m de profundidade. Fundo de oceanos: pressão elevada Alterações fisiológicas: velocidade de reações químicas, solubilidade de nutrientes e ponto de ebulição da água. - BARÓFILOS: encontrados a m de profundidade. - BARÓFILOS EXTREMOS: em profundidades acima de m. 6

7 Luz A vida na água depende, direta ou indiretamente, dos produtos metabólicos de organismos fotossintéticos. Algas e cianobactérias: principais microrganismos fotossintetizantes encontrados nos ambientes aquáticos. Crescimento limitado às regiões superficiais: ZONA FÓTICA. Tamanho da zona: depende das condições do local (posição do sol, estação do ano e turbidez da água). Em geral: atividade fotossintética restrita a m de profundidade. Salinidade: concentração de NaCl (0% - 32%) Água doce: 0 %; inibição em concentrações a 1%. Água do mar: 2,75% de NaCl; concentração total (NaCl + outros sais) = 3,3-3,7% Estuários: alta variação da superfície ao fundo. Manguezal é um ecossistema costeiro, de transição entre os ambientes terrestre e marinho, uma zona úmida característica de regiões tropicais e subtropicais. 7

8 Exemplos de Microrganismos tolerantes a altas concentrações de sais: HALOFÍLICOS: 2,5-4,0 % de NaCl HALOFÍLICOS EXTREMOS: Lagos salgados (ex.: Salt Lake, EUA): 32% de salinidade, mar morto (lago hipersalino). Mar morto (34.2% de salinidade em 2011, densidade de kg/l) Turbidez: material suspenso + luz variações na limpidez das águas de superfícies. Material suspenso: - partículas minerais: erosão das rochas e solo. - detritos: matéria orgânica particulada decomposição de materiais vegetais e animais. - microrganismos suspensos. Quanto maior a turvação da água menor a penetração da luz e menor a profundidade da zona fótica. Material particulado: superfície à qual os microrganismos aderem. 8

9 ph Maioria dos microrganismos aquáticos: 6,5-8,5; ph dos oceanos: 7,5-8,5; Organismos marinhos: 7,2-7,6; Lagos e rios: variação ampla. Exemplos de microrganismos em condições de ph extremos: - Arqueobactérias de lagos salgados da África: ph = 11,5 - Arqueobactérias de geisers: ph= 1,0 Nutrientes: inorgânicos e orgânicos. Influenciam significativamente o crescimento microbiano. Nitratos e fosfatos: algas Eutrofização: super crescimento de algas: O 2 Carga de nutrientes: águas próximas à praia: variável - esgotos domésticos (compostos orgânicos e inorgânicos). águas de mar aberto: estável e baixa. efluentes industriais: presença desubstâncias antimicrobianas Podem inibir o crescimento de alguns microrganismos mas também podem permitir o crescimento de formas mais resistentes. 9

10 EUTROFIZAÇÃO Mudança da composição química da água/ risco para saúde Cianobactérias (ou algas azuis) Floração de cianobactérias - Devido principalmente ao acúmulo de nutrientes ricos em fósforo e nitrogênio - Pode produzir metabólitos secundários que dão gosto e odor desagradáveis à água, além de toxinas - Off-flavor: gosto de barro, inseticida, mofo, que muitas vezes encontramos nos peixes. Gesosmina (GEO) e o 2-Metilisoborneol (MIB): compostos orgânicos que conferem o sabor e odor na água, e deve-se pela proliferação de algas nos mananciais com alto índice de nutrientes, e é ampliada por fatores como luz, poluição, temperatura e chuvas. São totalmente prejudiciais a saúde quando em excesso. 10

11 Cianobactérias (ou algas azuis) - Cianotoxinas: podem ser altamente tóxicas para animais aquáticos, terrestes e humanos através da ingestão ou contato com água contaminada. - Principais toxinas: nodularinas, microcistinas, anatoxinas, saxitoxinas - Toxicidade: hepatóxicas, neurotóxicas, dermatóxicas ou inibidoras da síntese de proteínas de acordo com seu mecanismo de ação. Fenômeno da maré-vermela (red bloom) Dinoflagelados - protistas - Possuem pigmentos fotossintéticos que varia de cor (de verde à marron ou vermelho). Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) Quantidade de oxigênio necessária para a oxidação biológica e química das substâncias oxidáveis contidas na amostra DBO é o parâmetro fundamental para o controle da poluição das águas por matéria orgânica. Degradação microbiológica de matéria orgânica utilizando O 2 dissolvido no corpo d água. Permite indiretamente avaliar a quantidade de matéria orgânica presente na água capaz de ser oxidada pelos microrganismos presentes. 11

12 - análise de consumo de oxigênio feita pelos microrganismos envolvidos em processos de oxidação do substrato. - corresponde à diferença entre as concentrações de oxigênio no início e no fim de um período de incubação, em condições específicas do ensaio. - A temperatura de incubação é padronizada em 20 C e o tempo de incubação em 5 dias Microrganismos no ambiente aquático: Podem ocorrer em todas as profundidades Destaque para camadas superior (plâncton) e o sedimento (bento). PLÂNCTON: Coleção de vida microbiana que flutua e se movimenta na região superficial dos pântanos, lagos e oceanos. População de plâncton pode ser constituída especialmente de algas e cianobactérias (FITOPLÂNCTON) ou por protozoários e outros animais microscópicos (ZOOPLÂNCTON). 12

13 Os microrganismos fototróficos são considerados como plâncton mais importante São os produtores primários de matéria orgânica por meio da fotossíntese. Condições como: luz solar, ventos, marés, correnteza, nutrientes e ingestão por formas superiores Afetam o número e o tipo de organismos na população do plâncton. Em áreas que recebem esgoto doméstico rico em nutrientes: Bactérias (coliformes e estreptococos fecais) Aeromonas, Bacillus, Proteus, Clostridium, Thiobacillus Vírus intestinais Estuários nutritivamente pobres: Bactérias Hyphomicrobium e Caulobacter Bactérias do solo como Azotobacter, Nitrosomonas e Nitrobacter Numerosos fungos também em várias regiões dos estuários (Ascomycetes, Phycomycetes e Deuteromycetes) Hyphomicrobium Azotobacter Nitrosomonas 13

14 Fungos e protozoários marinhos: - Esporos de bolores e fragmentos de micélios estão presentes na água do mar em toda a zona fótica. Fungos: Deuteromicetos, Ficomicetos e Mixomicetos. Protozoários: - Espécies de Foraminífera e Radiolaria. - Grande número na região habitada pelo fitoplâncton. Durante o dia eles vivem abaixo da região da atividade fótica e à noite eles migram e se alimentam do fitoplâncton na superfície. Contaminação da água por microrganismos Bactérias patogênicas: Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, E. coli Fungos: Candida albicans, C. tropicalis Vírus: Poliomielite, hepatite, rotavírus, adenovírus. Protozoários: Entamoeba histolitica, Giardia, Schistossoma, Ascaris 14

15 Controle - Responsabilidade das autoridades sanitárias - Deve ser testada em intervalos regulares - Portaria 518/2004 do MS Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano * PORTARIA Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011 Distribuição: bactérias heterotróficas - até 100 UFC/mL aceitável (padrão internacional) - se exceder 500 UFC/mL: medidas devem ser tomadas Preferencialmente: ausência de coliformes em 100 ml de água Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde De acordo com essa portaria, os padrões que determinam se uma água é potável ou não são: 15

16 Água Potável Livre de microrganismos patogênicos e de substâncias químicas nocivas. Águas superficiais (rios, riachos e lagos) e subterrâneas: esgoto doméstico; dejetos agrícolas; dejetos industriais. A água pode ser límpida, inodora e insípida e mesmo assim não ser potável: contaminantes físicos, químicos e BIOLÓGICOS. Legislação brasileira: Portaria n o 2914/2011, MS Resolução CONAMA 357/2005 e 397/2008 Microrganismos Patogênicos na Água Doenças de veiculação hídrica Bactérias Vírus Protozoários Helmintos Espiroquetas Riquétsias Algas 16

17 Doenças de Veiculação Hídrica Bactérias - Salmonella spp.: gastroenterite / S. typhi: febre tifóide - Vibrio cholerae: gastroenterite - Shigella spp.: disenteria bacilar (shigelose) - Yersinia enterocolitica: gastroenterite aguda - Escherichia coli: linhagens patogênicas (enterites) - Clostridium perfringens: enterite, gangrena gasosa - Vibrio parahaemolyticus: gastroenterites - Pseudomonas aeruginosa: infecções nos olhos e ouvidos. - Staphylococcus aureus: infecções cutâneas, garganta e intoxicações alimentares - Leptospira spp.: hepatite, conjuntivite e insuficiência renal Doenças de Veiculação Hídrica Fungos: - saprófitas e parasitas de peixes - oriundos do solo: Candida albicans (infecções da pele e mucosas) - Geotrichum: fungo dermatófito Protozoários: - ciliados: Giardia lamblia (esporos resistentes ao cloro) - amebas: Entamoeba histolytica (amebíase intestinal) Vírus: - Hepatites A e B - Rotavírus: gastroenterite infecciosa não bacteriana - Enterovírus: poliomielite 17

18 Detecção de Patógenos em Água PROBLEMAS: Grande variedade de microrganismos patogênicos. Espécies podem estar em pequeno número para detecção nas amostras coletadas. Isolamento e detecção de alguns patógenos podem levar vários dias, semanas ou meses. Ausência de um patógeno em particular não significa ausência de outro. Microrganismos Indicadores da Qualidade da Água A análise microbiológica para determinação da potabilidade não deve ser baseada no isolamento e identificação de microrganismos patogênicos: Os agentes patogênicos têm acesso esporádico ao ambiente hídrico e não demonstram sobrevivência durante um longo período de tempo. Estando em pequeno número, os microrganismos patogênicos podem não ser detectados pelos procedimentos laboratoriais. É necessário um período de pelo menos 24 horas para obtenção de resultados laboratoriais para microrganismos patogênicos. 18

19 A classificação ambiental das infecções relacionadas com a água: 1) de transmissão hídrica ou relacionadas com a higiene, da categoria feco-oral, onde podemos assinalar as diarréias e disenterias, febres entéricas, poliomielite, hepatite A, leptospirose, ascaridíase e tricuríase; 2) de transmissão relacionada com a higiene propriamente dita, como as infecções dos olhos e pele; 3) aquela baseada na água, quando o organismo patogênico desenvolve parte do seu ciclo vital em um animal aquático, como no caso da esquistossomose, por exemplo; e 4) a transmissão por um inseto vetor que procria na água ou cuja picada ocorre próximo a ela nesta categoria, destacam-se a malária, a filariose e as arboviroses (dengue e febre amarela). Microrganismos Indicadores da Qualidade da Água O monitoramento de todos os microrganismos patogênicos é difícil e inviável economicamente: meios de cultura e metodologias diferentes. dificuldade de analisar os resultados. O que é um microrganismo indicador? Qual seria o ideal? 19

20 Microrganismos Indicadores da Qualidade da Água Tipo de microrganismo cuja presença na água é evidência de que ela está poluída com matéria fecal de origem humana ou de outros animais de sangue quente. Indica a ausência/presença correlacionados a ausência ou presença de microrganismos patogênicos. Microrganismos Indicadores da Qualidade da Água Indicador ideal de qualidade sanitária: - Presente em águas poluídas e ausentes em águas não poluídas. - Presente na água quando os microrganismos patogênicos estão presentes. - Número de microrganismos indicadores está correlacionado com o índice de poluição. - Sobrevive melhor e por mais tempo na água que os microrganismos patogênicos. - Apresenta propriedades uniformes e estáveis. - Geralmente é inofensivo ao homem e a outros animais. - Presente em maior número do que os patogênicos. - Facilmente evidenciado por técnicas laboratoriais padronizadas. 20

21 Microrganismos Indicadores da Qualidade da Água Escherichia coli microrganismo mais utilizado, pois satisfaz as exigências de um indicador de poluição. Streptococcus faecalis Anaeróbios: Clostridium perfringens e Bifidobacteria sp. Vírus bacteriófagos Vírus entéricos métodos mais elaborados para detecção na água. Embora existam pesquisas em andamento nesta área, nenhum método padrão para detecção de vírus na água tem sido adotado. Microrganismos Indicadores da Qualidade da Água Grupo COLIFORME: Família Enterobacteriaceae Bacilos gram-negativos; Aeróbios ou anaeróbios facultativos; Não formadores de esporos; Fermentam a lactose (lac+) gerando ácidos orgânicos e gás em 48 horas a 35 C. Principais Gêneros: - Coliformes totais: coliformes ambientais (fezes, vegetais e solo) - Enterobacter (E. aerogenes), Klebsiella, Citrobacter, etc. - Coliformes fecais: coliformes termotolerantes (crescem a 44,5 o C) - Escherichia coli 21

22 Utilização da lactose por E. coli 22

23 Análise Bacteriológica da Água Métodos apresentados no livro: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - publicado pelas associações: - American Public Health Association - American Water Works Association - Federation of Sewage and Industrial Wastes Associations Métodos são padronizados Análise Bacteriológica da Água Critérios: - A amostra deve ser coletada em frasco estéril. - A amostra deve ser representativa do universo do qual foi colhida. - A contaminação da amostra deve ser evitada durante e após a coleta. - A amostra deve ser analisada logo após a sua obtenção. - Havendo a necessidade de uma demora na realização da análise, a amostra deve ser guardada a uma temperatura de 0 a 10 0 C. 23

24 Análise Bacteriológica da Água Contagem padrão em placa - Quantidades de 1,0 e 0,1 ml plaqueadas. - Não há um número particular de bactérias que seja aceitável água com poucas bactérias patogênicas é mais perigosa do que com muitas bactérias saprófitas. - Úteis na determinação da eficiência das operações destinadas à remoção ou à destruição de organismos (sedimentação, filtração e cloração). 24

25 Análise Bacteriológica da Água Teste dos tubos múltiplos e cálculo do número mais provável (NMP/100mL) Teste presuntivo Teste confirmativo Teste completo ou final Membrana filtrante (UFC/mL) Teste cromogênico/fluorogênico Tubos Múltiplos Diluição seriada: extinção Inoculação em baterias de tubos múltiplos com meio de cultivo. Incubação 35 ou 44,5 o C Contagem dos tubos positivos. Uso da tabela de Número Mais Provável (NMP) para estimar densidade. 25

26 Técnica dos tubos múltiplos: determinação do NMP de coliformes (CT) Teste Presuntivo: 10 ml por tubo 1 ml por tubo Amostra de água 0,1 ml por tubo Caldo Lauril Triptose (caldo lactosado) Incubação a 35 ºC / h: formação de gás: NMP Teste Confirmativo Tubos com gás do teste anterior Tubos com caldo lactosado + bile verde brilhante Incubação a 35ºC /24-48 h 26

27 Teste Coliformes Fecais Tubos com gás Caldo E.C. do teste confirmativo incubação a 44,5 ºC Coliformes fecais fermentam a lactose a 44,5 ºC Coliformes não fecais fermentam a lactose somente até ºC 27

28 Técnica da Membrana Filtrante Um disco filtrante é colocado na unidade de filtração (poros de 0,45 μm diâmetro). Um volume determinado de água passa pelo disco filtrante e as bactérias são retidas na superfície da membrana filtrante. A membrana é retirada e colocada sobre uma almofada absorvente saturada com meio de cultura apropriado. Incubação 35 o C: coliformes totais 44,5 o C: coliformes fecais Contar as colônias 28

29 Colônias: membrana filtrante e meio de cultivo Colônias típicas: azuis Colônias típicas: brilho metálico 29

30 Teste Cromogênico e Fluorogênico: ONPG e MUG Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose (glicopiranosídeos) Específicos para Escherichia coli Exemplos: - ONPG (Orto Nitrofenil galactopiranosídeo) - MUG (Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo) Ferramenta poderosa para identificação de Escherichia coli (teste confirmativo) Teste Cromogênico e Fluorogênico: ONPG e MUG Usado como teste complementar. Coliformes Totais: enzima β-d-galactosidase: hidrolisa o orto-nitrofenil-β-d-galactopiranosidio (ONPG) Amarelo quando hidrolisado E. coli : enzima β-glucuronidase: hidrolisa o 4-metilumbeliferil-β-glucuronidio (MUG) Azul Fluorescente quando hidrolisado 30

31 Teste Cromogênico e Fluorogênico: ONPG e MUG MUG - galactosidase Composto fluorescente azul 31

32 Amostras com resultados positivos para coliformes totais devem ser analisadas para Escherichia coli e, ou, coliformes termotolerantes, devendo, neste caso, ser efetuada a verificação e confirmação dos resultados positivos 8º Em amostras individuais procedentes de poços, fontes, nascentes e outras formas de abastecimento sem distribuição canalizada, tolera-se a presença de coliformes totais, na ausência de Escherichia coli e, ou, coliformes termotolerantes, nesta situação devendo ser investigada a origem da ocorrência, tomadas providências imediatas de caráter corretivo e preventivo e realizada nova análise de coliformes. 32