22º Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental II-016 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM LAGOAS DE ESTABILIZAÇÃO

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1 22º Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 14 a 19 de Setembro 2003 Joinville Santa Catarina II016 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM LAGOAS DE ESTABILIZAÇÃO Adriana Cristina Poli Miwa(1) Licenciada em Ciências Exatas com Habilitação em Química no ano de 2000 pela Universidade de São Paulo, São Carlos. Mestre em Hidráulica e Saneamento, Escola de Engenharia de São Carlos (EESC), Universidade de São Paulo (USP) em Doutoranda em Hidráulica e Saneamento, na EESC/USP com início Maria do Carmo Calijuri Licenciada e Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de São Carlos, em 1982, com mestrado em Ecologia e Recursos Naturais pela Universidade Federal de São Carlos, Doutora em Hidráulica e Saneamento, 1988 pela EESC/USP, e livredocente pelo Departamento de Hidráulica e Saneamento, EESC/USP. Atualmente, professora e coordenadora do PPG em Hidráulica e Saneamento. Patrícia Bortoletto de Falco Formada em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de São Carlos em Mestrado em Ciências da Engenharia Ambiental pela Universidade de São Paulo em Início do doutorado em 2000 na área de Hidráulica e Saneamento, Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo. Endereço(1): Rua Dr. Nestor de Campos, 272 Planalto Paraíso São Carlos SP CEP: Brasil Tel: 55 (16) adrimiwa@sc.usp.br RESUMO Um dos métodos mais simples utilizado no tratamento de esgoto sanitário são as lagoas de estabilização. Grande parte da matéria orgânica presente no esgoto sanitário é constituída por proteínas, a qual tornase fator limitante aos processos biológicos de tratamento de águas residuárias em que se encontram presentes. O objetivo deste trabalho foi avaliar e

2 comparar alguns métodos colorimétricos para determinação de proteínas, definindo qual é o mais apropriado para esse tipo de ambiente. Os métodos utilizados foram Lowry, Bradford e Biureto e os padrões de proteínas foram soroalbumina, caseína e ovoalbumina. O método de Bradford apresentou várias desvantagens como curvas padrão nãolineares, complexo coranteproteína impregnase na parede das cubetas tornando o procedimento demorado, entre outros. O método do Biureto apresentou altas concentrações de proteínas por medir outros compostos além daqueles que contenham grupo NH2. O método de Lowry apresentou reagente específico para proteínas, é sensitivo e reprodutivo sendo, portanto, o mais apropriado para o ambiente em estudo. Para comprovar essa escolha, análise de adição de padrão à amostra foi realizada. A água residuária estudada não apresentou substâncias interferentes. PALAVRASCHAVE: Proteínas, Lagoas de Estabilização, Métodos Colorimétricos. INTRODUÇÃO Os sistemas de lagoas de estabilização são os mais utilizados para tratamento de esgoto sanitário devido sua simplicidade, principalmente pela facilidade de operação e manutenção, com capacidade de suportar sobrecargas hidráulica e orgânica durante vários dias. Utilizam radiação solar e energia química liberada na degradação da matéria orgânica ao invés de energia elétrica. Nessas lagoas, uma enorme variedade de organismos vivos é encontrada, os quais se reproduzem de acordo com a disponibilidade de alimento. Geralmente, esses sistemas são compostos por duas ou três lagoas, sendo uma anaeróbia seguida de facultativa, ou ainda uma lagoa de maturação. Os parâmetros de projeto de unidades de tratamento dependem das características da água residuária a ser tratada. Nem sempre as determinações usuais fornecem informações suficientes para uma investigação adequada, tornandose necessária a procura de metodologias mais apropriadas. Normalmente, a matéria orgânica presente em águas residuárias é determinada através da Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) ou pela Demanda Química de Oxigênio (DQO). Apesar destes métodos estarem sujeitos a interferências e limitações que condicionam seu uso são, ainda, os mais comumente utilizados na determinação da matéria orgânica em laboratórios de saneamento. Levandose em consideração as diversas origens das águas residuárias, tornase bastante evidente a necessidade de se proceder a estudos mais detalhados, relativos à matéria orgânica. As proteínas são moléculas complexas, limitantes aos processos biológicos e são responsáveis pela maioria dos processos metabólicos. Destas moléculas, os organismos envolvidos na estabilização da matéria orgânica, retiram sua energia. Os métodos colorimétricos para determinação de proteínas mais comumente utilizados são, em sua maioria, viáveis economicamente variando na sensitividade e reprodutividade. Estudos mostram a necessidade de detalhar a complexa atividade microbiana que ocorre nessas lagoas e não somente a eficiência do sistema de tratamento. Vários trabalhos abordam essa eficiência e se distanciam da complexidade que os microrganismos presentes nas lagoas representam.

3 Os métodos colorimétricos para determinação de proteínas são baseados em formação de complexos coranteproteína ou reagente químicoproteína. Dos métodos analisados, o de Lowry baseiase na adição de reagentes específicos que, por redução dos íons cobre, se ligam às proteínas presentes em solução. No método do Biureto também ocorre formação de complexo reagenteproteína. O método de Bradford apresenta ligação de corante específico às cadeias laterais das proteínas. Estes métodos apresentaram vantagens e desvantagens entre si e estas foram analisadas utilizandose amostras provenientes de lagoas de estabilização tratando esgoto doméstico. Poucos estudos metodológicos têm comparado o desempenho de ensaios espectrofotométricos de proteínas. Para tal determinação, vários métodos colorimétricos são utilizados em diferentes trabalhos. Nesta pesquisa, foram comparados e avaliados os métodos de Lowry, Biureto e Bradford. A partir da escolha do método mais apropriado para o ambiente em estudo será possível obter avanços conceituais de interações entre organismos e processos em lagoas de estabilização, podendo trazer contribuições importantes ao estudo da interação substratobiomassa no tratamento de esgotos, visto que são nessas lagoas que ocorrem as maiores interações entre algas e bactérias. Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de metodologia, porém o conhecimento da natureza dos constituintes da amostra e suas concentrações aproximadas são essenciais. O objetivo desta pesquisa foi encontrar um método que fosse sensitivo e viável economicamente para determinação de proteínas em estações de tratamento, já que esta biomolécula, geralmente, está presente em maiores quantidades na matéria orgânica do esgoto sanitário. Os trabalhos com lagoas de estabilização são poucos e há necessidade de mais estudos nesses ambientes para melhor entendimento e melhoramento dos processos e das interações entre os organismos. MATERIAL E MÉTODOS Amostras foram coletadas na Estação de Tratamento de Esgoto de Novo Horizonte, localizada a noroeste do Estado de São Paulo. O sistema é composto por três lagoas de estabilização, sendo os pontos de amostragem: afluente bruto (P1), lagoa anaeróbia (P2), facultativa (P3), maturação (P4) e efluente final (P5), conforme observado na Figura 1. Durante as coletas, foi realizada filtração para eliminação de problemas relacionados a turbidez. Os filtros utilizados foram de fibra de vidro de 0,45 m m da marca Whatmam. Os métodos colorimétricos utilizados para determinação de proteínas foram o de Lowry descrito em LOWRY et al. (1951), o de Bradford descrito em BRADFORD (1976) e do Biureto descrito em ITZHAKI & GILL (1964). Esses métodos foram testados, avaliados e comparados, discutindose vantagens e desvantagens de cada um. Foram realizadas leituras de absorbância em diferentes tempos após o término de cada ensaio com intuito de analisar a estabilidade do complexo formado. As leituras foram realizadas em quintuplicata para verificação da reprodutividade dos

4 métodos. Foi realizada ainda, análise de adição de padrão à amostra para verificação de substâncias interferentes com objetivo de comprovar a escolha do método mais apropriado. As proteínas padrões utilizadas foram soroalbumina bovina, caseína e ovoalbumina, obtidas da SIGMA. As análises de Demanda Química de Oxigênio (DQO) foram realizadas de acordo com APHA (1995). Foi realizada uma coleta em fevereiro/2002 para análises dos métodos. Em maio/2002 e agosto/2002 foram realizadas coletas nictemerais para verificação de variação nas concentrações de proteínas em vinte e quatro horas. Figura 1 Estação de tratamento de lagoas de estabilização em Novo Horizonte SP com respectivos pontos de amostragem (P1 afluente bruto; P2 efluente da lagoa anaeróbia; P3 lagoa facultativa; P4 lagoa de maturação; P5 efluente final). Resultados e discussão Na amostragem realizada em fevereiro/2002, foram testados os métodos colorimétricos e, para cada um, foram realizadas curvas padrão com soroalbumina bovina, caseína e ovoalbumina. Foram preparadas soluções estoque de 1 g.l1 e para cada método foram realizadas várias diluições de diferentes concentrações. O solvente utilizado foi água, exceto para caseína, que foi hidróxido de sódio. A DQO no afluente bruto foi de 1574 mg.l1 e no efluente final foi de 252 mg.l1 apresentando, portanto, uma eficiência de remoção de 84%. A Tabela 1 e Figura 2 mostram as concentrações de proteínas obtidas pelos métodos de Lowry, Bradford e Biureto.

5 Tabela 1 Concentrações de soroalbumina (mg.l1) obtidas pelos métodos de Lowry, Bradford e Biureto, nos diferentes pontos de coleta Pontos de coleta Concentração de soroalbumina (mg.l1) Bradford Lowry Biureto P1 5,9 46,5 198,3 P2 7,4 36,8 114,4 P3 14,4

6 31,9 104,4 P4 9,8 38,4 112,2 P5 16,2 35,5 103,3 Método de Bradford As leituras de absorbância neste método devem ser realizadas imediatamente após o término do ensaio. As curvas padrão não apresentaram linearidade. Segundo ZAIA et al. (1998), a falta de linearidade na lei de BeerLambert tem surgido devido a uma variação no ph quando ocorre adição da amostra ao reagente Azul de Coomassie G250. As concentrações de proteínas obtidas por esse método foram muito menores em relação aos outros, cerca de 7 a 8 vezes menores que no método de Lowry, talvez pelo fato do método de Bradford medir compostos com no mínimo 8 a 9 ligações peptídicas e o de Lowry compostos com duas ligações. Corroborando com este resultado, RAUNKJAER et al. (1994) encontraram concentrações de soroalbumina de 4 a 7 vezes mais baixas pelo método de Bradford que pelo de Lowry. Método de Lowry Neste método, as diluições nas concentrações da solução estoque para realização das curvas padrão ficaram entre 0 e 100 mg.l1 e as curvas foram lineares para os três padrões estudados. Com intuito de analisar a estabilidade do complexo formado, várias leituras de absorbância foram realizadas: logo após o término do experimento, após 10, 20 e 30 minutos. Os resultados mostraram que leituras devem ser realizadas após 20 minutos do término do experimento.

7 Houve degradação de proteína de 24% no sistema de tratamento, sendo que destes, 20,8% ocorreu na lagoa anaeróbia e 3,2% no restante do sistema. Conforme observado na Tabela 1, houve aumento de 20,3% na concentração de proteínas na lagoa de maturação em relação à facultativa. Esta lagoa de maturação também apresentou um aumento de 35% na DQO. Neste método, encontrouse que 3% da DQO correspondeu a proteínas. Método do Biureto As curvas padrão neste método foram lineares para as proteínas estudadas. As leituras de absorbância das amostras devem ser realizadas após cinco minutos do término do experimento. Houve uma variação significativa entre as proteínas, cerca de 20%. Houve degradação de 48% em todo sistema. Com este método também pode ser observado aumento de proteínas de 7,5% na lagoa de maturação, conforme observado na Tabela 1. As altas concentrações obtidas neste método foram devido o reagente medir não somente compostos com o grupo CONH2, mas, também, todos os compostos que apresentam NH2. Assim, não somente proteínas responderam ao teste. Encontrouse que cerca de 13% da DQO correspondeu a proteínas, neste método. BLUNDI (1988), analisando amostras provenientes de esgoto sanitário e sintético, encontrou, utilizando o mesmo método, que 40% da DQO correspondeu a proteínas, mostrando que a água residuária estudada apresenta baixa concentração de proteínas em relação aos outros ambientes. Figura 2 Concentrações de soroalbumina (mg.l1) obtidas pelos métodos Bradford, Lowry e Biureto nos diferentes pontos de amostragem Na Tabela 2 estão apresentadas as médias de absorbância, erros, desvios padrão e coeficientes de variação para os diferentes métodos estudados. Como em todos os pontos de amostragem os valores ficaram próximos decidiuse apresentar somente os obtidos em P1. Tabela 2 Médias, erros padrão, desvios padrão e coeficientes de variação calculados para os métodos estudados no ponto P1 de amostragem

8 P1 Bradford Lowry Biureto Média 0,104 0,144 0,356 Erro padrão 0,001 0,0006 0,002 Desvio padrão 0,003 0,001 0,005 Coef. de variação 2,9% 0,7% 1,4%

9 O método de Bradford apresentou várias desvantagens como curva padrão nãolinear; o complexo coranteproteína impregnase a parede das cubetas causando coloração azul intensa levando a erros de leitura, e tornando o procedimento demorado devido a necessidade de lavagens adicionais. Foi o método que apresentou o maior coeficiente de variação. O método de Bradford baseiase na ligação do corante Azul de Coomassie G250 com a proteína. São utilizados etanol, ácido fosfórico e corante que reagem com grupos funcionais básicos ou aromáticos das proteínas. Para que ocorra esta ligação, as proteínas devem ter estruturas macromoleculares, com no mínimo 8 a 9 ligações peptídicas. O método do Biureto também apresentou algumas desvantagens como variação grande entre os padrões de proteínas utilizados; apresentou altas concentrações de proteínas devido medir outros compostos como CSNH2, C(NH)NH2, CH2NH2, CRHNH2, CH(OH)CH2NH2, CHNH2CH2OH e CHNH2CH(OH). Nesse método ocorre, também, reação com o próprio biureto: OC(NH2)NHCONH2. Assim, não somente proteínas respondem ao teste. Este método requer altas quantidades de proteína na amostra (RAUNKJAER et al, 1994), o que não caracterizou o tipo de água residuária trabalhada. O método de Lowry tem reagente específico para proteínas e foi o mais sensitivo, pois mediu moléculas tão pequenas quanto dipeptídeos (LOWRY et al., 1951). Num primeiro momento, ocorre a reação biureto devido o reagente ser constituído de hidróxido de sódio e sulfato de cobre, além de carbonato de sódio e tartarato de sódio. Em seguida, acrescentase o reagente Folinfenol Ciocalteau que sofre redução quando em contato com proteína. Ocorrem, portanto, duas reações: uma reação mais lenta com os quelatos de cobre com cadeias peptídicas e uma mais rápida de redução do reagente Folinfenol Ciocalteau com resíduos de aminoácidos aromáticos (tirosina e triptofano). O método apresentou menores erros, desvio padrão e coeficiente de variação. Portanto, o método escolhido foi o de Lowry, pois pareceu ser o mais acurado e preciso para determinar proteínas em águas residuárias domésticas. Análise de adição de padrão à amostra Para comprovar a escolha do método mais apropriado para esse ambiente, análise de adição de padrão soroalbumina à amostra foi realizada. Na Figura 3 podem ser observados os valores de inclinação das curvas padrão e adição de padrão à amostra.

10 Figura 3 Curva padrão e adição de padrão soroalbumina a amostra do ponto P1 Os valores mostraram que a água residuária doméstica estudada não apresentou substâncias interferentes com o método de Lo wry. O valor de inclinação da curva padrão foi de 0,0027 e de adição de padrão a amostra foi de 0,0026. RAUNKJAER et al. (1994) realizaram o mesmo experimento e obtiveram os mesmos resultados, ou seja, utilizando o método de Lowry, os autores mostraram que não havia substâncias interferentes na água residuária doméstica estudada. Foram realizadas outras amostragens, Maio/2002 e Agosto/2002, onde as concentrações de proteínas mostraramse variáveis. A Tabela 3 e Figura 4 mostram as concentrações de proteína (soroalbumina) nos diferentes períodos e pontos de amostragem. Tabela 3 Concentrações de soroalbumina (mg.l1) nos diferentes pontos de amostragens, em Maio e Agosto de 2002 Pontos de amostragem Amostragem Maio/2002 Amostragem Agosto/2002 T0 T1 T2 T3 T4

11 T0 T1 T2 T3 T4 P1 69,3 85,4 80,4 111,7 P2 48,0 45,7 54,3 47,7 47,3 51,0

12 51,3 38,7 68,7 54,0 P3S 40,1 39,1 41,1 44,7 35,4 65,0 39,2 60,2 58,5 49,4 P3M 36,9 40,9 39,1 39,8 35,1 59,4 55,8 61,7

13 31,3 60,8 P3F 39,8 41,1 42,7 40,7 38,5 55,0 76,3 56,2 24,2 62,3 P4S 39,1 46,8 41,4 42,5 37,0 66,7 62,7 63,1 68,1

14 64,2 P4M 38,1 43,0 43,0 43,8 36,3 57,5 60,8 53,7 64,0 68,5 P4F 39,5 44,9 44,3 43,0 35,3 65,2 44,6 46,9 62,3 63,8 P5

15 38,9 37,2 61,9 54,4 S = Superfície; M = Meio; F = Fundo; Na amostragem realizada em maio/2002, a eficiência de redução na DQO em T0 ficou em 67% e em T4, 76%. Em agosto/2002, a eficiência de redução na DQO ficou em 68% em T0 e 70% em T4. Em maio/2002, as concentrações de proteínas apresentaram menores variações que em agosto/2002. As concentrações de proteínas em maio aumentaram na lagoa de maturação e, na amostragem de agosto, elas variaram mais em relação ao período anterior.

16 Figura 4 Concentração de proteínas (mg.l1) nos diferentes pontos de amostragem em a Maio/2002 e b Agosto/2002 Na amostragem de agosto/2002, em T0 e T4, a concentração de proteínas aumentou na lagoa facultativa e apresentou um aumento maior na de maturação. Nos outros horários de coleta, T1, T2 e T3, o aumento foi variado. A maior parte da degradação ocorreu na lagoa anaeróbia devido a presença de uma maior biomassa de bactérias. Esta degradação anaeróbia é um processo complexo envolvendo tipos diferentes de microrganismos. Nesta lagoa, as proteínas são hidrolisadas a peptídeos e aminoácidos por enzimas extracelulares e estes são, posteriormente, fermentados a ácidos graxos voláteis, hidrogênio e dióxido de carbono, antes de serem convertidos a metano. Segundo McINERNEY (1988), as bactérias realizam tal processo em busca de energia. De acordo com MACKIE & BRYANT (1990), peptídeos, aminoácidos e amônia podem ser reaproveitados para síntese de proteínas bacterianas. Durante a amostragem de Agosto, houve ocorrência de ventos fortes, o que pode ter ocasionado a variação na concentração de proteínas entre superfície, meio e fundo das lagoas facultativas e de maturação (Tabela 3). Portanto, não devem ser considerados apenas o afluente bruto e efluente final desses sistemas de tratamento, já que os processos envolvidos nessas lagoas são bastante complexos. Essas lagoas de estabilização necessitam de maiores estudos para o entendimento nas variações das concentrações de proteínas ocorridas nesses períodos estudados. Os ensaios espectrofotométricos de proteínas são simples, não dispendiosos e podem ser amplamente utilizados. Antes de qualquer nova aplicação, os métodos devem ser sempre testados e avaliados. CONCLUSÕES O sistema de lagoas de estabilização estudado apresentou, na amostragem de fevereiro/2002, uma eficiência na redução de DQO de 84%. No método de Bradford, as curvas padrão não apresentaram linearidade e as concentrações de proteínas foram de 7 a 8 vezes menores que no método de Lowry. Utilizando o método de Lowry, observouse degradação de proteínas de 24% em todo sistema. Foi observado também que a maior parte dessa degradação ocorreu na lagoa anaeróbia devido a maior presença bacteriana nessas lagoas. Houve aumento de 20,3% na concentração de proteínas na lagoa de maturação em relação à lagoa facultativa. A DQO acompanhou esse aumento em 35%. O método do Biureto apresentou variação significativa entre proteínas padrões de cerca de 20%. Com este método também pode ser observado aumento na concentração de proteínas na lagoa e maturação de 7,5%.

17 A água residuária estudada apresentou baixas concentrações de proteínas em relação à outros ambientes. No método de Lowry, 3% da DQO correspondeu a proteínas. No método do Biureto, esta relação ficou em 13%. O método de Lowry foi o que apresentou menores valores de coeficiente de variação (0,7%), erro (0,0006) e desvio padrão (0,001) e foi o mais apropriado para determinar proteínas em lagoas de estabilização. A análise de adição de padrão à amostra revelou que a água residuária estudada não apresentou substâncias interferentes com o método de Lowry. O valor de inclinação da curva padrão de soroalbumina foi de 0,0027 e de adição de padrão 0,0026. Na amostragem realizada em maio/2002, a eficiência de redução na DQO em T0 ficou em 67% e em T4, 76%. Em agosto/2002, essa redução ficou em 68% em T0 e 70% em T4. As concentrações de proteínas nas amostragens de maio/2002 e agosto/2002 mostraramse variadas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS von SPERLING, M. (1996). Lagoas de estabilização. Vol. 3, Princípios do tratamento biológico de águas residuárias, Depto de Engenharia Sanitária e Ambiental (DESA), Universidade Federal de Minas Gerais. LOWRY, O.H.; ROSEBROUGH, N. J.; FARR, A. L; RANDALL, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. v. 193, p BRADFORD, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. v. 72, p ITZHAKI, R.F.; GILL, D.M. (1964). A MicroBiuret Method for estimating proteins. Anal. Biochem., n. 9, p APHA American Public Health Association (1995). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. 19 th edition. Washington. ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. (1998). Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química nova. v.21, n. 6, p RAUNKJAER, K.;HVITVEDJACOBSEN, T.; NIELSEN, P. H. (1994). Measurement of pools of protein, carbohydrate and lipid in domestic wastewater. Wat. Res. V. 28, n. 2, pp

18 BLUNDI, C.E. (1988). Aplicação de métodos alternativos para a determinação de matéria orgânica e biomassa em águas residuárias. São Carlos, 329 p. Tese (Doutorado) Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo. McINERNEY, M. J. (1988). Anaerobic hydrolysis and fermentation of fats and protein. In: ZEHNDER, J.B. Biology of anaerobic microorganisms. John Willey & Sons, eds cap. 8, p MACKIE, R. I.; BRYANT, M. P. (1990). Efficiency of bacterial protein synthesis during anaerobic degradation of cattle waste. Appl. Environ. Microbiol., v. 56, n. 1, p. 8792