Elaboração Projeto Fronteiras: Alto Rio Negro; apoio FINEP, Financiadora de Estudos e Projetos. Inclui sugestão de referências.

Transcrição

1

2 F825 Franco, Antonia Maria Ramos Manual teórico-prático em leishmaniose tegumentar / Antonia Maria Ramos Franco, Liliane Correa da Rocha, Francimeire Gomes Pinheiro. --- Manaus : [s.n.], p. : il. color. Elaboração Projeto Fronteiras: Alto Rio Negro; apoio FINEP, Financiadora de Estudos e Projetos. Inclui sugestão de referências. ISBN: 1. Leishmaniose tegumentar. I. Rocha, Liliane Correa da. II. Pinheiro, Francimeire Gomes. III. Título. CDD 19. ed

3 MANUAL TEÓRICO-PRÁTICO EM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR Parasitas do gênero Leishmania podem reproduzir-se sexuadamente dentro de flebotomíneos. Fonte: N. Akopyants, W. Beatty, and S. M. Beverley Antonia Maria Ramos Franco, PhD Liliane Coelho da Rocha, PhD Francimeire Gomes Pinheiro, MSc

4

5 Descobrindo a Leishmaniose Diferentemente do mosquito da dengue (Aedes aegypti), que precisa de água para se reproduzir, a fêmea de Lutzomyia põe seus ovos em superfícies úmidas, como pedras e folhas em contato com a terra. Depois que os ovos eclodem, as larvas se alimentam de matéria orgânica encontrada no solo até se transformarem em insetos adultos. Já com asas e o resto do corpo formados, os adultos se alimentam do néctar das plantas e pousam, sempre com as asas levantadas, em áreas úmidas e sombreadas. Ao entardecer as fêmeas saem em busca do sangue necessário para colocarem seus ovos. Fazem vôos curtos, aos saltos, e picam as partes descobertas do corpo. Na dolorosa picada, a fêmea faz um pequeno corte na pele, se alimenta na poça de sangue e injeta saliva e substâncias que aumentam o calibre dos vasos sangüíneos e impedem a coagulação do sangue. Durante a refeição ou repasto sanguíneo, regurgita formas do parasita (promastigotas metacíclicas) que só se reproduzem em seu aparelho digestivo. Uma vez no sangue, o parasita se aproveita do próprio mecanismo de ação do sistema de defesa e se oculta antes de invadir outras células e se reproduzir, segundo descoberta recente. A equipe do pesquisador David Sacks, dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (NCBI), colocou fêmeas do inseto Phlebotomus duboscqi (vetor no Velho Mundo) portadoras de Leishmania major, capaz de infectar animais de laboratório, para se alimentarem na orelha de camundongos. Com o um microscópio que permite fazer imagens dos tecidos de animais vivos, acompanharam o combate aos parasitas. Tão logo o sistema imunológico dos roedores identificou a invasão, células de defesa chamadas neutrófilos se deslocaram até a região da picada. Em pouco mais de meia hora os neutrófilos já haviam engolfado a maior parte dos parasitas e tentavam destruí-los com um banho de enzimas digestivas. Como vivem por apenas umas poucas horas, os neutrófilos são depois digeridos por uma segunda leva de células de defesa, os macrófagos, uma espécie de

6 turma da limpeza. Os pesquisadores observaram que, após a morte dos neutrófilos, parasitas vivos se aproximavam dos macrófagos, células nas quais se alojam e se reproduzem. Em artigo publicado em 15 de agosto na Science, a equipe de D. Sacks chamou a estratégia de cavalo-de-tróia, em referência à tática usada pelos gregos para transpor as muralhas de Tróia, na guerra narrada por Homero. E assim, esta importante doença endêmica vai se disseminando... Antonia Franco 6

7 Índice Parte I Teoria Origem Formas clínicas da leishmaniose do Novo Mundo Agente etiológico Morfologia Reprodução Insetos vetores Ciclos biológicos Distribuição geográfica Espécies descritas no Estado do Amazonas Diagnóstico Tratamento Parte II Prática Prática de dissecação de flebotomíneos Coleta de material para demonstração direta do parasito Prática de coloração de lâmina para o diagnóstico de leishmaniose Coloração Giemsa Isolamento de parasitas em meio de cultura NNN Agar sangue Sugestões de referências

8 8

9 Parte I - Teoria Leishmania é o parasita responsável pela leishmaniose. Ela é transmitida através flebotomíneos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e do gênero Lutzomyia no Novo mundo. Seus hospedeiros primários são vertebrados; e comumente infecta canídeos, roedores, edentados, marsupiais entre outros, além dos seres humanos. Afeta atualmente 12 milhões de pessoas em 88 países. O gênero Leishmania (Ross, 1903) pertence a ordem Kinetoplastida, à família Trypanossomatidae e agrupa espécies de protozoários unicelulares, digenéticos (heteroxenos), encontradas nas formas promastígota e paramastigota, flageladas livres ou aderidas ao trato digestivo dos hospedeiros invertebrados, e amastigota, sem flagelo livre, parasito intracelular. A reprodução ocorre por divisão binária simples em ambos os hospedeiros. Os hospedeiros vertebrados incluem uma grande variedade de mamíferos. Embora as infecções por esses parasitos sejam mais comuns nos roedores e canídeos, são conhecidas também entre edentados, marsupiais, procionídeos, ungulados primitivos, primatas e, entre estes, o homem. Como hospedeiros invertebrados são identificados, exclusivamente, fêmeas de insetos hematófagos conhecidos como flebotomíneos (Diptera: Psychodidae da subfamília Phlebotominae - ver o item vetores). A transmissão ocorre por mecanismo complexo, através da picada do inseto infectado, no momento da hematofagia. A infecção em aves e anfíbios nunca foi descrita, e os organismos encontrados parasitando répteis, principalmente lagartos, que até o século passado pertenciam ao gênero Leishmania, foram agrupados em outro gênero, o Sauroleishmania, Saf Janova, 1982, na classificação, revisada em 1987, por R. Lainson e J. J. Shaw. Assim, trataremos neste manual básico apenas das espécies do gênero Leishmania que parasitam o homem e outros mamíferos Origem As origens da Leishmania não são claras. Uma teoria propõe 9

10 uma possível origem Africana, com a migração para as Américas. Outra migração das Américas para o Velho Mundo cerca de 15 milhões de anos atrás, através da Estreito de Bering ponte de terra. Outro propõe uma origem Paleártica. Tais migrações implicariam na migração de vetores e reservatórios ou adaptações sucessivas ao longo do caminho. A migração mais recente é o de L. infantum de países da bacia mediterrânica América Latina (lá chamada de L. chagasi), desde a colonização européia da Novo mundo Formas clínicas da Leishmaniose do Novo Mundo A Leishmaniose cutânea é a forma mais comum da leishmaniose. É uma infecção de pele causada por um parasito unicelular. Há aproximadamente 20 espécies de Leishmania que podem causar leishmanioses cutâneas. A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença de caráter zoonótico que acomete o homem e diversas espécies de animais silvestres e domésticos, podendo se manifestar através de diferentes formas clínicas. E considerada uma enfermidade polimórfica e espectral da pele e das mucosas. As principais manifestações observadas nos pacientes com LTA podem ser classificadas de acordo com seus aspectos clínicos, patológicos e imunológicos. A forma cutânea localizada é caracterizada por lesões ulcerosas, indolores, únicas ou múltiplas; a forma cutaneomucosa é caracterizada por lesões mucosas agressivas que afetam as regiões nasofaríngeas; a forma disseminada apresenta múltiplas úlceras cutâneas por disseminação hematogênica ou linfática e, finalmente, a forma difusa com lesões nodulares não-ulceradas. Leishmaniose mucocutânea é a mais temida forma de leishmaniose cutânea porque produz lesões destrutivas. É causada freqüentemente por Leishmania (Viannia) braziliensis, mas são descritos raramente casos provocados por L. aethiopica (espécie não encontrada no Brasil e sim no Velho Mundo). Também já foram notificadas formas mucosas ocasionadas por L. (V.) guyanensis. 10

11 Além destas ainda é encontrada a forma de Leishmaniose visceral Agente etiológico Há cerca de 30 espécies patogênicas para o ser humano (CDC). As mais importantes são: As espécies L. donovani, L. infantum infantum (espécies que não existem no Brasil) e L. infantum chagasi que podem produzir a leishmaniose visceral, mas, em casos leves, apenas manifestações cutâneas. As espécies L. major, L. tropica, L. aethiopica, L. mexicana, L. braziliensis (apenas esta espécie ocorre no Brasil) e L. peruviana que produzem a leishmaniose cutânea ou a mais grave, mucocutânea. Espécies do Gênero Leishmania, Parasitos de Humanos e de Animais de acordo com a Classificação, proposta por Lainson e Shaw, 1987 (adaptado) Espécie Espécie Subgênero Leishmania Subgênero Viannia L. (Leishmania) donovani L. (Viannia) braziliensis L. (L.) infantum L. (V.) guyanensis L. (L.) chagasi (Syn. L. infantum) L. (V.) panamensis L. archibaldi L. (V.) peruviana L. (L.) tropica L. (V.) lainsoni L. (L.) aethiopica L. (V.) naiffi L. (L.) major L. (V.) shawi L. (L.) gerbilli L. (V.) colombiensis L. (L.) mexicana* L. (V) lindenbergi L. (L.) amazonensis L. (V.) equatorensis L. (L.) venezuelensis L. (V.) pifanoi L. (L.) enriettii L. (L.) aristidesi 11

12 L. (L.) pifanoi L. turanica L. (L.) hertigi L. (L.) deanei L.arabica L. tropica L. forattinii L garnhami L. herreri L. killicki L.tarentolae L. turanica Espécies encontradas parasitando humanos no Brasil. Espécies exclusivamente de animais. Posição taxonômica do agente etiológico Reino: Protista Sub-Reino: Protozoa Filo: Sarcomastigophora Sub-Filo: Mastigophora Classe: Zoomastigophorea Ordem: Kinetoplastida Família: Trypanosomatidae Gênero: Leishmania 1.4. Morfologia 12

13 A morfologia dos parasitos deste gênero guarda de certa forma, semelhança entre as diferentes espécies. FORMAS AMASTIGOTAS: As amastigotas, no interior das células fagocitárias ou livres, dependendo da preparação, quando fixadas e coradas pelos métodos Giemsa, Leishrnan ou pelo aparecem a microscopia óptica como organismos ovais, esféricos ou fusiformes. No citoplasma, corado em azul-claro, são encontrados: núcleo grande e arredondado, ocupando as vezes um terço do corpo do parasito, e cinetoplasto em forma de um pequeno bastonete, ambos corados em vermelho- -púrpura, além de vacúolos que podem ou não ser visualizados. Não há flagelo livre, e a sua porção intracitoplasmática raramente é observada. Os limites micrométricos de seus diâmetros são de aproximadamente 1,0 µm a 3,0 x 3,0 a 6,o µms. Quando examinadas ao microscópio eletrônico de transmissão o envoltório é formado por uma unidade de membrana. Nas diferentes espécies de Leishmania, a membrana apresenta uma invaginação na região anterior do corpo do parasito formando a bolsa flagelar, onde se localiza o flagelo. O flagelo, nesta forma não se exterioriza para além do corpo do parasito, O cinetoplasto se mostra como uma estrutura mitocondrial ligado a única mitocôndria existente na célula. No seu interior encontram-se estruturas filamentosas, circulares, formadas por ácido desoxirribonucléico, denominadas k-dna. O blefaroplasto ou corpúsculo basal aparece como a continuação do flagelo. Forma amastigota intracelular FORMAS PROMASTIGOTAS: As formas flageladas, promastigotas são 13

14 encontradas no trato digestivo do hospedeiro invertebrado. São alongadas, com um flagelo livre e longo, emergindo do corpo do parasito na sua porção anterior. O núcleo é arredondado ou oval, e está situado na região mediana ou ligeiramente na porção anterior do corpo. O cinetoplasto, em forma de bastão localiza- se na posição mediana entre a extremidade anterior e o núcleo. As promastigotas apresentam uma variabilidade muito grande nas medidas do corpo, cujos diâmetros podem ser observados entre 10,0-40,0 x 1,5-3,0 µm. O flagelo apresenta sempre medidas iguais ou superiores ao maior diâmetro do corpo. Forma promastigota FORMAS PARAMASTIGOTAS: As paramastígotas são pequenas e arredondadas ou ovais. O flagelo é curto, exterioriza se na região anterior do corpo e sua extremidade pode estar aderida a superfície cuticular da porção anterior do trato digestivo do vetor através de hemidesmossomos. O núcleo mantém-se na posição mediana do parasito e o cinetoplasto é paralelo ou ligeiramente posterior ao núcleo.os diâmetros das paramastígotas variam de 5,0 a 10,0 x 4,0 a 6,0 µm. As promastigotas metacíclicos são as formas infectantes para os hospedeiros vertebrados, possuem os diâmetros do corpo nos menores limites apresentados pelos promastigotas e o flagelo muito longo, cerca de duas vezes o comprimento do corpo. Possuem mobilidade intensa e são encontrados livres nas porções anteriores do trato digestivo do inseto. Nunca foram encontradas em divisão. Já foram descritas outras formas como, haptomonas e nectomonas, assim como promastigotas metacíclicas que podem ser encontradas 14

15 no tubo digestivo do inseto vetor Reprodução A multiplicação, por divisão binária simples, é iniciada pela duplicação do cinetoplasto, um dos quais mantém o flagelo remanescente, enquanto o outro promove a reprodução da estrutura flagelar. A seguir, o núcleo se divide e em seqüência, o corpo do parasito se fende no sentido antero posterior. Em ambas as formas. A reprodução de Leishmania é clonal e, apesar de algumas provas circunstanciais, não houve nenhuma prova real de que eles podem trocar genes através do sexo e produzindo formas híbridas. Pode-se dizer que a prova circunstancial é forte porque são observados híbridos na natureza, mas esse não é o mesmo que dizer que alguém tem ou pode realizar uma prova genética populacional. No entanto, estudos do pesquisador D. Sacks tem demonstrado que é possível. Sexo entre os parasitos podem possibilitar uma nova forma de compreender a Leishmaniose Demorou um ano de trabalho e exigiu no laboratório a maior colônia de criação de flebotomíneos da América do Norte, o pesquisador David Sacks e seus colegas finalmente provaram algo que há muito suspeitavam: os parasitas que causam a leishmaniose podem fazer trocas genéticas. A descoberta é importante porque os cientistas podem agora usar parasitos híbridos para identificar genes responsáveis por uma forma grave de leishmaniose ou outras características de interesse. Leishmania passa parte do seu ciclo de vida nos flebotomíneos sendo transmitida aos seres humanos e outros mamíferos através da picada deste inseto infectado. As leishmanias multiplicam principalmente através de divisão assexuada. No entanto, indícios sugerem que eles podem se reproduzir sexualmente também. Sexo se for o caso, que provavelmente iria acontecer dentro do inseto, quando os parasitos estão no espaço extracelular fora das células do inseto (em humanos e outros mamíferos, os parasitos residem dentro de compartimentos individuais dentro das 15

16 células do hospedeiro e, portanto, podem ter oportunidade limitada para recombinar sexualmente). Mas, uma vez que é difícil a manutenção de infecção por leishmanias em flebótomos no laboratório este foi um estudo de difícil realização. 1.6 Insetos Vetores A leishmaniose é transmitida por insetos hematófagos (que se alimentam de sangue) conhecidos como flebótomos ou flebotomíneos. Os flebótomos medem de 2 a 3 milímetros de comprimento e devido ao seu pequeno tamanho são capazes de atravessar as malhas dos mosquiteiros e telas. Apresentam cor amarelada ou acinzentada e suas asas permanecem abertas quando estão em repouso. Seus nomes variam de acordo com a localidade; os mais comuns são: mosquito palha, tatuquira, birigüi, cangalinha, asa branca, asa dura e palhinha. O mosquito palha ou asa branca é mais encontrado em lugares úmidos, escuros, onde existem muitas plantas. No Brasil, as principais espécies envolvidas na transmissão da LTA são Lutzomyia whitmani, L. intermedia, L. umbratilis, L. wellcomei, L. flaviscutellata, e L. migonei. Estas espécies de flebotomíneos foram definidas como vetoras por atenderem aos critérios que atribuem a uma espécie a competência vetorial. Cabe ressaltar que o papel vetorial de cada uma dessas espécies dependerá da espécie de Leishmania presente no intestino. Embora ainda não tenha sido comprovado o papel da L neivai e L. fisheri como vetores da Leishmaniose, estas espécies têm sido encontradas com freqüência em ambientes domiciliares em áreas de transmissão da doença. Fêmea de flebotomíneo ingurgitado 16

17 Vigilância Entomológica Considerando as peculiaridades das áreas com e sem transmissão de LTA e, ainda, a diversidade das espécies de flebotomíneos vetores, acredita-se que a implementação de estudos bioecológicos das espécies apontadas como vetoras comprovadas e/ou suspeitas, trarão informações úteis para subsidiar a elaboração de indicadores que venham contribuir com a avaliação de risco, e, deste modo, possam gerar medidas de prevenção e controle mais eficazes. A vigilância entomológica tem como objetivo levantar as informações de caráter quantitativo e qualitativo sobre os flebotomíneos em áreas de transmissão, bem como naquelas sem transmissão, de forma a obter novos conhecimentos da bioecologia das espécies de flebotomíneos de importância médico-sanitária. Sendo assim é importante: a.conhecer as espécies de flebotomíneos nas áreas novas de transmissão de LTA no ambiente antrópico; b.conhecer as espécies de flebotomíneos nas áreas endêmicas para LTA no ambiente antrópico, desde que não se tenha o conhecimento prévio das mesmas; c.estabelecer curvas de sazonalidade para as espécies de flebotomíneos de importância médico-sanitária; d.monitorar as alterações de comportamento das principais espécies de flebotomíneos em relação aos seus ecótopos naturais. Para tal, são propostas duas metodologias: a pesquisa entomológica em foco e o monitoramento entomológico. Pesquisa Entomológica em Foco A pesquisa entomológica em foco deverá ser realizada em áreas 17

18 novas de transmissão de LTA, a fim de verificar a presença e identificar as possíveis espécies de flebotomíneos vetores e, com isso, auxiliar na investigação epidemiológica, isto é, na definição da autoctonia e da ocorrência de transmissão no ambiente domiciliar, em que as medidas de controle químico poderão ser empregadas. Considerando-se que a transmissão da LTA pode envolver uma ou mais espécies de vetores, a pesquisa entomológica em foco deverá utilizar o maior número de métodos disponíveis (armadilha luminosa, armadilha de Shannon, capturas manuais em locais possíveis de criação e repouso do flebotomíneo, entre outras). As capturas entomológicas deverão ser realizadas nos locais prováveis de infecção do caso, desde que a investigação epidemiológica indique que a transmissão ocorra em ambiente domiciliar. As capturas deverão ser realizadas, em pelo menos três pontos de coleta: No intradomicílio; No peridomícilio (principalmente nos anexos); Na margem da mata, se esta estiver localizada, no máximo, até 500 metros do domicílio (local provável de infecção). Para a pesquisa entomológica, é recomendada a utilização de armadilha luminosa, armadilha de Shannon com isca luminosa e capturas manuais. 1. Armadilhas luminosas: deverão ser utilizadas no mínimo três armadilhas, uma em cada ponto de coleta. Estas deverão ser expostas por 12 horas, a partir do crepúsculo vespertino, por no mínimo uma noite. 2. Armadilha de Shannon com isca luminosa: deverá ser utilizada concomitante à noite da exposição da armadilha luminosa. A coleta deve ser realizada a partir do crepúsculo vespertino até as 22 horas ou 23 horas (no caso de horário de verão), preferencialmente no peridomicílio. 3. Coletas manuais com capturador motorizado ou com tubo de sucção tipo Castro: poderão ser realizadas nos mesmos pontos de coleta, por no mínimo uma noite, no período do crepúsculo vespertino até as 22 horas ou 23 horas (no caso de horário de 18

19 verão). Caso a pesquisa entomológica em foco tenha resultado negativo, esta deverá ser repetida, mensalmente, até três meses. Se o resultado permanecer negativo, a pesquisa entomológica em foco será considerada NE- GATIVA. Será considerada pesquisa entomológica em foco POSITIVA, quando do encontro de pelo menos uma espécie de importância médico- -sanitária em um ou mais método de coleta (Lutzomyia intermedia, L. wellcomei, L. migonei, L. whitmani, L. flaviscutellata, L. umbratilis, L. anduzei, L. reducta, L. olmeca nociva), quer seja para a confirmação da autoctonia como para confirmação de transmissão no ambiente domiciliar. Do ponto de vista operacional, outras metodologias poderão ser empregadas para a coleta de flebotomíneos como as armadilhas adesivas e as armadilhas com iscas animais ou com feromônios, que nada mais são que uma otimização das metodologias anteriores. Monitoramento Entomológico O monitoramento entomológico consistirá em capturas entomológicas sistemáticas em estações de monitoramento (EM). Considerando-se que a distribuição das espécies de flebotomíneos acompanha um padrão de distribuição em relação à cobertura vegetal natural e à região geomorfológica, a definição das EM deverá considerar esses parâmetros, de modo a obter áreas homogêneas, em que pelo menos uma EM deverá ser implantada. Portanto, cada município deverá ser classificado. quanto à sua cobertura vegetal natural predominante e agrupados segundo características semelhantes, considerando a sua localização topográfica, independente da região administrativa. Para cada conjunto de municípios, deverá ser selecionada, no mínimo, uma localidade que representará a EM. De preferência a localidade deverá ser aquela que tiver concentrado o maior número de casos humanos autóctones de LTA nos dois últimos anos. 19

20 Para cada EM deverão ser selecionados no mínimo três pontos de coletas: 1º ponto: intradomicílio; 2º ponto: peridomicílio (abrigos de animais ou local modificado por cultura de subsistência); 3º ponto: mata ou margem da mata. Para o monitoramento, são recomendadas a utilização de armadilha luminosa e armadilha de Shannon com isca luminosa, de modo a obter maior diversidade da fauna de flebotomíneos. O monitoramento deverá ser realizado mensalmente por no mínimo dois anos e as coletas de flebotomíneos deverão ser preferencialmente no mesmo período de cada mês. Do ponto de vista operacional, outras metodologias poderão ser empregadas para a coleta de flebotomíneos, tais como: manual com capturador motorizado; capturas manuais com tubo de sucção tipo Castro; armadilhas adesivas e as armadilhas com iscas animais ou com feromônios, que nada mais são que uma otimização das metodologias anteriores. Classificação de Flebotomíneos Ordem: Diptera Subordem Nematocera (antenas longas, mais de seis segmentos) Infraordens.Psychodomorpha Superfamília Psychodoidea Família Psychodidae Gênero Lutzomyia (Brasil) 20

21 Relação de alguns vetores Parasito reservatório (animais silvestres) reservatório urbano Vetor L. braziliensis Roedores (Akodon, Proechimys, Oryzomys) Cão, cavalo Lutzomyia intermedia L. pessoai L. wellcomei L. guyanensis Edentados (Choloepus didactylus, Tamanduá tetradactyla), marsupiais (Didelphis marsupialis) L. amazonensis Roedores (Proechimys, Oryzomys, Nectomys) marsupais (Metachirus, Didelphis, Marmosa) L. whitmani L. umbratilis, L.anduzei L. flaviscutellata L. olmeca nociva L. lainsoni Cuniculus paca L. ubiquitalis 21

22 Abrigos naturais dos flebotomineos 22

23 1.7.Ciclo biológico Ciclo biológico da Leishmaniose Formação de lesões cutâneas 23

24 Granulócitos neutrófilos - os cavalos de Tróia para os parasitos Leishmania A estratégia do cavalo de Tróia como um mecanismo de patogenicidade de um microorganismos intracelular é, para evitar que o sistema imunológico e sua função de memória inteligente, com a fagocitose dos amastigotas infectados e apoptóticos neutrófilos por macrófagos. Empregando os sinais de perigo não superfície de células apoptóticas. Transmitido pelo flebotomíneos, os protozoários parasitas do gênero Leishmania major podem mudar a estratégia da primeira defesa imunológica de comer - inflamação matando para comer, não inflamação de não matar seu hospedeiro o fagócito. E corrompê-lo para seu próprio benefício. Eles usam o mecanismo de fagocitando voluntariamente granulócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) rigorosamente como um esconderijo complicado, onde proliferarm despercebidamente pelo sistema imunológico e dão a vida longa para os macrófagos estabelecerem um escondido para a infecção. Absorção e sobrevivência Através de uma infecção microbiana dos PMN fazendo-os sair da corrente sanguínea e através da camada de células endoteliais, para o local do tecido infectado (tecido dérmico após a picada do inseto). Eles imediatamente iniciam os seus negócios lá como a primeira resposta imune e fagocitam o invasor, ativando a resposta. Dá se inicio ao processo de inflamação. Ativados os PMN secretam quimiocinas, IL-8 particularmente, para atrair mais granulócitos e estimulá-los a fagocitose. Além disso Leishmania major aumenta a secreção de IL- 8, do PMN. No caso de parasitos, que podem não parecer razoável à primeira vista. Podemos observar este mecanismo em outras parasitoses intracelulares obrigatórios. Para micróbios como estes, existem várias maneiras de sobreviver dentro das células. Surpreendentemente, a co-injeção de patógenos via apoptose é viável e de longe, faz um curso mais fulminante da doença do que a injeção de apenas parasitas viáveis. A exposição na superfície de parasitas mortos e o sinal 24

25 anti-inflamatório via fosfatidilserina, Geralmente encontradas em células apoptóticas, de Leishmania major o que faz desligar o burst oxidativo, para matar e degradar os patógenos co- injetados viáveis, não sendo assim é alcançados. Em caso de Leishmania descendência não é gerado no PMN, mas, desta forma, consegue sobreviver e persistir desembaraçado no local primário de infecção. Os promastigotas também liberam formas LCF (Leishmania fator quimiotático) para recrutar ativamente neutrófilos, mas não outros leucócitos. Por exemplo monócitos ou células NK. Além disso, a produção de interferon gama (IFNγ), proteína induzível pelo PMN é bloqueada na presença de Leishmania. O que envolve o fechamento de quadro inflamatório e protetor da resposta imune por células NK e o recrutamento de Th1 celular. Os patógenos permanecer viáveis durante a fagocitose desde seus hospedeiros primários, o PMN, expõe as celulas a apoptose associando padrão molecular (ACAMP) de sinalização como sendo nenhum patógeno. Persistência e atração A vida útil dos (granulócitos) neutrófilos é bastante curta. Eles circulam na corrente sanguínea por cerca de 6 ou 10 horas após a saída medula óssea, após então sofrerem apoptose espontânea. Muitos patógenos microbianos têm sido relatados como que influenciando a apoptose celular por diferentes estratégias. Existem alguns casos de atraso na apoptose por indução/ativação da mesma levando em média 2 a 3 dias. O fato do tempo poder ser prolongado é muito benéfico para o desenvolvimento de infecção, pois as células do hospedeiro final para estes parasitos são os macrófagos, que, normalmente, migram para os locais de infecção dentro de 2 ou 3 dias. fagocitose Silenciosa Para salvar a integridade do tecido circundado de componentes tóxico celulares e enzimas proteolíticas contidas nos neutrófilos, os PMN apop- 25

26 tóticos são silenciosamente fagocitados pelos macrófagos. A estratégia desta fagocitose silenciosa tem as seguintes vantagens para o parasita : Retomando a atividade de apoptose silenciosa das células mortas realizada pelos macrófagos levam a uma sobrevivência dos patógenos. Patógenos dentro do PMN não tem contato direto com a superfície de macrófagos receptores, porque eles não podem ver o parasita dentro da célula por apoptose. Assim, a ativação de fagócitos para a ativação imune não ocorre. Penetração de formas metaciclicas 1.8.Distribuição geográfica Distribuição da leishmaniose tegumentar causada pela Leishmania guyanensis (em preto) e L. braziliensis (rachurado) 26

27 Distribuição da leishmaniose tegumentar causada por espécies do subgênero Leishmania: Leishmania amazonensis 1.9. Espécies descritas no estado do Amazonas Leishmania guyanensis O ciclo epidemiológico desta espécie foi desvendado por Lainson & Shaw na Amazônia. Ocorre na cobertura da floresta amazônica, no topo das árvores, cujo ciclo de transmissão é mantido a noite entre animais arborícolas, particularmente a preguiça de dois dedos (Choloepus didactylus) e o tamanduá (Tamandua tetradactyla), e os flebotomíneos, Lu. umbratilis como vetor primário e Lu. anduzei como vetor secundário. As fêmeas grávidas destes flebotomíneos descem para a base das árvores para ovipor e migram de volta ao topo para posterior repasto sanguíneo sobre seus hospedeiros arborícolas. Estas migrações resultam usualmente em grandes concentrações de fêmeas sobre a base de árvores de grande porte, particularmente nas primeiras horas do dia, e muitas destas podem estar infectadas. Normalmente estes flebotomíneos não estão inclinados a picar o homem, mas quando são perturbados por sua atividade (derrubada de árvores ou simplesmente encostar-se nestas), atacam-no avidamente. Durante uma captura destes insetos sobre a casca de árvores (por cerca de 27

28 uma hora, às 8h) dois técnicos coletaram 72 exemplares de Lu. umbratilis atacando seus braços, dos quais 16 (22%) estavam infectados. Estes dois homens desenvolveram juntos 13 lesões devido à L. guyanensis. Há um relato também de um técnico que desenvolveu cerca de 100 lesões após ter passado uma noite fazendo capturas sobre uma plataforma instalada no topo de árvores na Amazônia. A taxa de infecção destes flebotomíneos é geralmente muito alta com relação as outras espécies, tendo sido encontrada na região de Manaus 8,1% para Lu. umbratilis e 3,4% para Lu. anduzei. A transmissão geralmente ocorre durante o dia quando a atividade do homem na floresta é maior. Uma interessante variação na epidemiologia da L. guyanensis foi observada por Arias & Naiff, em 1981, na área periurbana de Manaus (AM). Neste local, o homem entra e destrói a floresta, estabelecendo conjuntos habitacionais Leishmania amazonensis O ciclo epidemiológico desta espécie ocorre na Amazônia, no nível da base da floresta envolvendo o flebotomíneo Lu. flaviscutellata como vetor primário e Lu. olmeca nociva como vetor secundário. Estes são essencialmente noturnos, com pequena capacidade de vôo e habitam até cerca de um metro de altura nas árvores. Os reservatórios são também essencialmente terrestres ou semiterrestres. Os principais são os roedores: Proechimys guyanensis e Oryzomys capito; Neacomys, Dasyprocta, Marmosa, Metachirus e Cerdocyon thous, considerados reservatórios secundários. A L. amazonensis é relativamente rara no homem devido à atividade noturna de L. flaviscutellata e a pouca atratividade que o homem exerce sobre ela e está restrita a caçadores e pescadores que penetram na floresta a noite. A floresta de terrenos baixos (igapós e várzeas) é o local onde a infecção pode ser adquirida, desde que haja suficientes mamíferos reservatórios e uma grande população do vetor. Esta espécie tem se adaptado muito bem em florestas secundárias baixas (capoeiras), onde geralmente há grande número de roedores. Nas proximidades de Manaus (AM), a taxa de infecção de Lu. flaviscutellata foi de 0,5% e de Lu. olmeca nociva de 0,2%. 28

29 Leishmania naiffi Descrito também recentemente, o parasito tem sido isolado de edentados (Dasypus novemcictus) no Pará; os vetores são Lu. ayrozai e Lu. paraensis. Alguns casos humanos foram encontrados no Estado do Amazonas. Leishmania braziliensis A espécie L. braziliensis também tem sido isolada no Amazonas com menor taxa de incidência, seu vetor e hospedeiros naturais ainda são desconhecidos nesta região Diagnóstico O diagnóstico é feito pela observação direta microscópica dos parasitas em amostras de linfa, sanguíneas ou de biópsias de pele, mucosas, após cultura ou por detecção do seu DNA ou através de testes imunológicos, como a Reação de Montenegro. Também podem ser feitos isolamentos utilizando-se a inoculação do material biopsiado em animais de experimentação. Tem sido utilizado métodos histológicos que também possibiltam o diagnóstico Tratamento No início do século XX, o médico paraense de Belém do Pará, Gaspar Viana, iniciou estudos sobre a leishmaniose. Quando casualmente descobriu o antimonial pentavalente. Compostos antimoniais são os tratamentos tradicionais para leish- 29

30 maniose (estibogluconato de sódio, antimoniato de meglumina). O tratamento para a leishmaniose mucocutânea é a combinação de pentoxifilina e um antimônio pentavalente em dosagens altas durante 30 dias: isto alcança taxas de cura de 90%. Tratamento só com antimônio pentavalente não cura 42% dos pacientes, até mesmo naqueles que alcançam uma cura aparente, 19% recairá. Resistência à antimoniais é prevalente em algumas partes do mundo, e a alternativa mais comum é anfotericina B. Paromomicina É uma alternativa barata, com menos efeitos colaterais do que a anfotericina. O Institute for OneWorld Health financiou para a produção como um medicamentos órfãos para uso no tratamento da leishmaniose, a partir da Índia. Vacina terapêutica: Uma vacina está sendo testada nos municípios de Caratinga e Varzelândia, em Minas Gerais - Brasil, e também na Colômbia e no Equador, sob a coordenação da OMS. Os testes estão em fase final e, até agora, referem-se bons resultados quanto à vacina preventiva. A vacina terapêutica para leishmaniose, desenvolvida pelo Prof. Wilson Mayrink, pesquisador do Departamento de Parasitologia da UFMG (Universidade Federal de Minas Gerais), recebeu o registro do Ministério da Saúde. No cão ainda não existe uma vacina comercializada na Europa. Atualmente a forma mais eficaz de prevenção passa pela utilização de produtos especiais com efeito de repelência sobre os flebótomos. Estão comercializados vários produtos à base de piretróides sintéticos. O produto que tem demonstrado mais eficácia e que é mais recomendado e referenciado é a coleira impregnada com deltametrina. Em Maio de 2007, as autoridades sanitárias do Município de Campo Grande Mato Grosso do Sul, no Brasil, adquiriram vários milhares destas coleiras para fazer frente à leishmaniose canina. Atualmente diversas drogas tem sido utilizadas e testadas no entanto, no Brasil o glucantime (antimonial pentavalente) é a droga de primeira escolha. Outras possibilidades como a miltefosina estão em fase de teste no Brasil. 30

31 Parte II - Prática - Coleta de Vetores Consiste na captura de flebotomíneos, com o objetivo de identificar e verificar a dispersão das espécies no âmbito estadual. Montando uma armadilha luminosa Metodologia As coletas deverão ser realizadas mensalmente no peri e intradomicílio das áreas com ocorrência de casos humanos ou caninos de Leishmaniose Tegumentar Americana ou Leishmaniose Visceral Americana. Nestas serão aplicadas às metodologias de capturas com armadilhas luminosas do tipo CDC e manuais. No primeiro caso elas devem estar instaladas nos abrigos de animais domésticos (Galinheiro, Pocilgas, curral, canil e outros), nos intradomicílios e no interior da mata caso existir nas proximidades (adentrar 100 metros do ecótono) sendo expostas às 17 horas e recolhidas as 7 h da manhã seguinte, totalizando 12 h de coleta / mês / ecótopo. Na ausência de abrigos de animais domésticos nos peridomicílios, realizar buscas ativas do vetor entre as árvores, cercas, entre outros, para verificar a presença de flebotomíneos e introduzir a armadilha nos locais com maior freqüência do vetor. 31

32 Armadilha luminosa do tipo CDC Paralelamente serão realizadas capturas manuais (capturador de Castro ou aspiradores elétricos de 6 Volts) onde serão realizadas buscas ativas dos vetores nas paredes externa e interna dos domicílios com o auxilio de uma lanterna, essas coletas serão realizadas também mensalmente em cada área de risco, com inicio às 18h e encerradas às 22h, totalizando 4 h / homem/ parede externa ou interna. Identificação dos vetores coletados A identificação do material será realizada da seguinte forma: Pelos municípios ou regiões que possuírem núcleo de entomologia, equipado e com funcionários devidamente treinados pelos núcleos de referência. As amostras coletadas serão enviadas para os laboratórios referencias, durante o primeiro ano de trabalho em cada município. A partir do segundo ano, credenciar cada município para identificar 50 % das amostras coletadas. Pelos núcleos de referência, quando o município ou região não possuir equipe capacitada para identificação. 32

33 Metodologia Os flebótomos coletados podem ser sacrificados através de diversos meios: álcool 70 %, gelo seco, clorofórmio ou cianureto (morteiros) ou aquecendo em luz solar direta. Os exemplares sacrificados com morteiros e luz solar deverão ser armazenados entre capas de papel de seda em pequenos recipientes com tampa. Diversos métodos de montagens de flebótomos estão disponíveis em diversas referências relacionadas ao assunto (Forattini, 1974; Ryan e cols., 1986; Young e col. 1994). Descrevemos aqui o método de montagem em Berlese. Método de Berlese (Hoyer modificado): 1-3 h em Potassa 10 % (KOH) 2-20 minutos em ácido acético 10 % 3 3 séries de 20 minutos em água destilada 4-24 h em Lactofenol 5 - Montagem em Berlese (Lâmina e lamínula) Formulações: Lactofenol - Fenol cristalizado(100 mg), ácido lático (100 ml), Glicerina (100 ml) e água destilada (100 ml). 33

34 Berlese - Goma arábica (08g), hidrato de cloral (74g), xarope de glicose (5 ml) e água destilada (10 ml), acido acético (3ml). Todos estes ingredientes são misturados e aquecidos sem deixar a solução ferver. Manter o Berlese em frasco âmbar. Metodologia de Dissecação: Introduzir o tubo contendo fêmeas de flebótomos vivas no congelador, por um período de 10 minutos, para imobilização dos exemplares.a seguir, colocar um exemplar sobre uma lâmina de microscopia, ao lado de uma gota de salina estéril, e o conjunto visualizado em lupa estereoscópica. Com o auxílio de um estilete de ponta recurvada (ângulo de 90º), fixar a cabeça do inseto contra a lâmina e com outro estilete pressionar levemente o penúltimo segmento do abdômen, retesando em direção ao centro da gota de salina, de modo a extrair o estomago anterior e posterior, intestino e túbulos de Malpighi. O conjunto é arrumado sobre a lâmina, de modo que, do pró-ventriculo à ampola retal sejam claramente visíveis. Por último, cobrir o conjunto com lamínula e examinar sob microscopia comum (aumento de 400 vezes). Também pode ser realizado da seguinte forma: Para examinar Lutzomyia suspeitos de estar com Leishmania, pode- 34

35 mos ter mais dois procedimentos: a. dissecação: o inseto vivo deve ser imobilizado em salina ou no frio (colocando-o por alguns minutos no congelador) logo antes do exame; colocá-lo em uma Iâmina com salina, sob uma lupa e, com o auxílio de estilete, decapitar o inseto, puxando pelo pescoço as glândulas salivares e o conteúdo intestinal; ao microscópio (40x) pode - se ver as promastígotas movimentando-se; com o material pode-se fazer um esfregaço, fixar pelo álcool metílico e corar pelo Giemsa; b.trituração: imobilizar os insetos como citado antes e colocar alguns (três a cinco) no buraquinho de placa de ELISA contendo um pouco de salina; com um bastão de vidro, triturar o material, que poderá ser examinado em microscópio a fresco, fixado e corado pelo Giemsa ou inoculado em focinho ou cavidade peritoneal de hamster. PRÁTICA DE DISSECÇÃO DE FLEBOTOMÍNEOS 1. FINALIDADE Preparo de Lâminas de abdomem e intestino de fêmea de flabotomíneos para identificação da espécie de inseto e procura de promastigotas de Leishmania. 2. AMOSTRA As amostras usadas serão coletadas em base de árvore com armadilha de luz do tipo CDC modificada para aspiração. 35

36 3. MATERIAIS NECESSÁRIOS Lâmina de vidro. Lamínulas. Salina Estiletes. Recipiente pequeno com água e detergente Estereoscópio 4. PROCEDIMENTO TÉCNICO 1. Coloca-se os insetos coletados dentro do recipiente com detergente para a retirada do excesso de cerdas; 2. Transfere-se o inseto individualmente para o centro da lâmina contendo uma gota de salina; 3. Observa-se o material em estereoscópio e com o estilete retira-se o final do abdômen da fêmea ou do macho e transfere-se para outra lâmina colocando-se uma gota de xilol para clarificar o material para a observação do aparelho genital; 4. Do restante do abdômen com muito cuidado retira-se o intestino utilizando-se o estilete e transfere-se o material para outra lâmina contendo uma gota de salina; 5. Coloca-se uma lamínula sobre o material e observa-se em microscópio de luz em aumento de 100X e 400X para a pesquisa de flagelados. 36

37 Ciclo biológico de um flebótomo. A) ovo; b) larva de primeiro instar; c) larva de quarto instar; d)pupa. Aspectos morfológicos de Lutzomyia longipalpis: a) cabeça do macho; b) cabeça da fêmea; c) asa; d) armadura cibarial e faringe da fêmea; e) espermateca da fêmea; f) genitália do macho 37

38 Doença Clínica Espécies de Leishmania Posição Geográfica Leishmaniose cutânea Leishmaniose Complexo L. tropica L. tropica L. aethiopica L. major Complexo L. mexicana L. mexicana L. pifanoi L. amazonensis L. garnhami L. venezuelensis Complexo L. braziliensis * L. peruviana L. guyanensis L. panamensis L. lainsoni L. colombiensis L. infantum L.chagasi Complexo L. braziliensis * L. braziliensis L. guyanensis L. panamensis L. mexicana L. tropica L. major Velho Mundo Novo Mundo Velho Mundo Novo Mundo Novo Mundo Novo Mundo Novo Mundo Velho Mundo Leishmaniose visceral Complexo L. donovani L. donovani L. infantum L. chagasi L. tropica L.amazonensis Velho Mundo Velho Mundo Novo Mundo Velho Mundo Novo Mundo * Os membros do complexo L. braziliensis são considerados como um subgênero, Viannia, separado de todas as outras Leishmania, que pertencem ao subgênero Leishmania. Os organismos do complexo L. braziliensis desenvolvem-se no intestino posterior do flebotomíneo (peripilária). Os do sub-gênero Leishmania desenvolvem-se na região anterior do flebotomíneo (suprapilária). 38

39 COLETA DE MATERIAL PARA DEMONSTRAÇÃO DI- RETA DO PARASITO: Visando obter uma amostra viável para um diagnóstico confiável, alguns cuidados são necessários: o primeiro deles é o preparo do local de onde será coletado o material (úlceras recentes são mais ricas em parasitos). Deve ser feita uma limpeza vigorosa do local da lesão com água e sabão, retirando-se resíduos de medicamentos ou outras substâncias, seguida de antissepsia com álcool a 70%. Quando necessário, pode-se fazer um pequeno botão anestésico com lidocaína 1 ou 2%. PROCEDIMENTO TÉCNICO O esfregaço é realizado por escarificação da borda interna da úlcera ou da superfície de lesão fechada, utilizando-se lâminas de bisturi estéreis ou estilete. A punção aspirativa pode ser realizada após injeção de 3mL de solução salina estéril na borda da lesão ou linfonodo, utilizando-se uma seringa de 5mL e agulha 25x8. Após a excisão cirúrgica, a técnica de aposição em lâmina (também denominada imprint ou touch preparation) pode ser realizada por meio da delicada compressão de fragmento de tecido, obtido por biópsia, sobre uma lâmina de vidro. Uma boa execução da técnica requer que o fragmento seja previamente banhado em solução salina estéril e o excesso de sangue e líquidos absorvidos em gaze ou papel de filtro. O material obtido por qualquer das técnicas deve ser distendido em lâminas de microscopia previamente limpas, desengorduradas e secas. Se possível, empregar lâminas de borda fosca para melhor identificação do material. 39

40 Após a confecção do esfregaço, as lâminas serão coradas com derivados do Romanowsky: Giemsa, Leishman ou corantes rápidos (este último ainda visto com algumas restrições por alguns cientistas) e Escarificação da borda de lesão cutânea, localizada no membro superior, com lâmina de bisturi e confecção do esfregaço em lâmina de vidro. PRÁTICA DE COLORAÇAO DE LÂMINA PARA O DIAG- NÓTICO DE LEISHMANIOSE PANÓTICO RÁPIDO LB 1. FINALIDADE Coloração de material de lesão para a visualização de amastigotas 2. INTRODUÇÃO O Panótico Rápido LB baseia-se no princípio de coloração hematológica estabelecida por Romanowsky, atuando em 15 segundos. 3. AMOSTRA A amostra usada consiste em lâminas com extensões de material retirado da borda das lesões. O material é submetida a ação de um fixador e duas soluções corantes, por meio de imersões de 5 segundos em cada, e ao final da última 40

41 imersão encontra-se pronta para leitura. 4. REAGENTES - Panótico rápido n n 1: compõe-se por uma solução de triarilmeta- no a 0,1%. - Panótico rápido n 2: compõe-se por uma solução de xantenos a 0,1% - Panótico rápido n 3: compõe-se por uma solução de tiazinas a 0,1% 5. PROCEDIMENTO TÉCNICO a) Preparar as extensões sangüíneas e deixar secar em temperatura ambiente; b) Preencher 3 recipientes com as soluções número 1, 2 e 3 respectivamente; c) Submergir as lâminas na solução número 1 mantendo-se um movimento contínuo de cima para baixo ou para os lados durante 5 segundos (5 imersões de 1 segundo cada) e deixar escorrer bem; d) Submergir as lâminas na solução número 2 mantendo-se um movimento contínuo de cima para baixo ou para os lados durante 5 segundos (5 imersões de 1 segundo cada) e deixar escorrer; e) Submergir as lâminas na solução número 3 mantendo-se um movimento contínuo de cima para baixo ou para os lados durante 5 segundos (5 imersões de 1 segundo cada) e deixar escorrer bem; f) Lavar com água deionizada recente (de preferência tamponada a ph 7,0), secar ao ar na posição vertical e com o final da extensão voltado para cima. 41

42 COLORAÇÃO GIEMSA 1. FINALIDADE Coloração de material de lesão para a visualização de amastigotas 2. PRINCÍPIO Os corantes para esfregaços sanguíneos, também chamados de pancrômicos, são uma mistura de corantes de características neutras, dependentes do ph da solução corante, que em condições apropriadas coram os componentes nucleares e citoplasmáticos dos leucócitos, com predominância de tons vermelhos (quando ácidos) e azulados diversos (quando básicos). 3. AMOSTRA A amostra usada consiste em lâminas com extensões de material retirado da borda das lesões. 4. REAGENTES Corante Giemsa, em pó Glicerol Metanol (tamponado ph 6,8) q.s.p. 8g 500mL 1000mL 42

43 5. MATERIAIS NECESSÁRIOS Suporte para coloração. Cronômetro. Lâminas. Água tamponada. Metanol. 5. PROCEDIMENTO TÉCNICO a) Fixar o esfregaço, cobrindo-o com 15 a 20 gotas de metanol por 5 minutos. b) Escorrer o álcool metílico e, sem lavar ou deixar secar. c) Cobrir a lâmina com solução de uso de Giemsa diluído (2 gotas de solução mãe para 1mL de água tamponada). d) Proceder à coloração por 10 minutos. e) Lavar a lâmina em água corrente e deixá-la secar em posição vertical. ISOLAMENTO DE PARASITAS EM MEIO DE CULTURA NNN AGAR SANGUE 1. FINALIDADE Isolar parasitas de insetos em meio específico para estudo e diagnóstico 43

44 2. AMOSTRA A amostra usada será retirada de fêmeas de flebotomíneos infectados 3. MATERIAIS NECESSÁRIOS Meio de cultura NNN Agar sangue Estilete estéril. 4. PROCEDIMENTO TÉCNICO a) Após a leitura da lâmina positiva o intestino é retirado com um estilete e transferido para tubo de ensaio com meio NNN. b) O tubo é então fechado e colocado em estufa de BOD a temperatura de 24 o C. 44

45 SUGESTÃO DE REFERÊNCIAS Ryan KJ; Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. pp ISBN Myler P; Fasel N (editors). (2008). Leishmania: After The Genome. Caister Academic Press. ISBN Momen H, Cupolillo E (2000). Speculations on the origin and evolution of the genus Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95 (4): doi: /s PMID Noyes HA, Morrison DA, Chance ML, Ellis JT (2000). «Evidence for a neotropical origin of Leishmania». Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95 (4): doi: /s PMID Kerr SF (2000). Palaearctic origin of Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95 (1): doi: /s PMID Leishmania mexicana / Leishmania major Laskay T. et al.. (2003). Neutrophil granulocytes Trojan horses for Leishmania major and other intracellular microbes?. Trends in Microbiology 11 (5): doi: /s x(03) PMID acesso em 9/07/ Akopyants, N. et al. Science 324, (2009). Panton, L. J., Tesh, R. B., Nadeau, K. C. & Beverley, S. M. J. Protozool. 38, (1991) Miles, M. A., Yeo, M. & Mauricio, I. L. Science 324, (2009) Akopyants NA et al. Demonstração de troca de material genético durante o desenvolvimento cíclico de Leishmania em flebotomíneos. Ci 45

46 Apoio Financeiro: Universal proc. No Laboratório de Leishmaniose e Doença de Chagas/INPA Secretaria de Saúde do Estado do Amazonas (SUSAM) Fundação Nacional de Saúde Escola Agrotécnica de São Gabriel da Cachoeira Exército Brasileiro 46

47 47