ANÁLISE CARIOTÍPICA, HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FREQUÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS RONs EM DUAS ESPÉCIES DE MELANOPLINAE (ORTHOPTERA: ACRIDIDAE)

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ANÁLISE CARIOTÍPICA, HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FREQUÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS RONs EM DUAS ESPÉCIES DE MELANOPLINAE (ORTHOPTERA: ACRIDIDAE) JÉSSICA MIRANDA DO NASCIMENTO RECIFE 2009

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ANÁLISE CARIOTÍPICA, HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FREQUÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS RONs EM DUAS ESPÉCIES DE MELANOPLINAE (ORTHOPTERA: ACRIDIDAE) JÉSSICA MIRANDA DO NASCIMENTO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE. Orientador: Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes Co-orientador: Profª. Drª. Marília de França Rocha RECIFE 2009

3 Nascimento, Jéssica Miranda do Análise cariotípica, heterocromatina constitutiva e frequência de expressão das RONs em duas espécies de Melanoplinae (Orthoptera: Acrididae). / Jéssica Miranda do Nascimento. Recife: A Autora, folhas: il., fig., tab. Dissertação (mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Genética, Inclui bibliografia. 1. Gafanhotos - Citogenética 2. Orthoptera 3. Acrididae. I Título CDU (2.ed.) UFPE CDD (22.ed.) CCB

4

5 À minha família e às minhas orientadoras, Maria José e Marília, com amor dedico.

6 E um dia os homens descobrirão que esses discos voadores estavam apenas estudando a vida dos insetos... Mário Quintana

7 Agradecimentos Em primeiro lugar a Deus pelo dom da vida, por sempre estar guiando meu caminho, proporcionando alegrias e conforto nos momentos difíceis e por permitir a concretização de mais uma etapa da minha vida profissional. À minha família pelo amor, confiança, apoio, dedicação e pela torcida. Em especial, às pessoas mais importantes da minha vida: meus avós, Maria e José Miranda; minha mãe, Letícia; meus irmãos, Jonatha e Rebecca; meus tios, Betânia, Júlio, Otoniel (Tano), Kelly e Socorro; meus primos Gabriel, Túlio, Maurício e Otoniel (Taninho) e minha cunhada Diene. À Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes pela orientação, dedicação, disponibilidade, ensinamentos e pela confiança que me fez seguir para conclusão deste objetivo. À Profª. Drª. Marília de França da Rocha pela co-orientação, amizade, carinho, paciência, disponibilidade, incentivo e por sempre ter acreditado em mim, estimulando-me nos momentos mais difíceis. Ao CNPq pelo apoio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho (Processo /2004-7). Ao professor Dr. Carlos Salvador Carbonell da Universidade de Montevideo, Uruguai, pela identificação taxonômica das espécies analisadas e pela disponibilidade. Ao Professor Dr. Marcelo Guerra e à Drª. Ana Emília pela disponibilização do sistema de captura de imagens do Laboratório de Citogenética Vegetal (Departamento de Genética/ CCB/ UFPE) e por viabilizar a realização da técnica de FISH. A Ituza e a Diogo pela ajuda com a captura das imagens de fluorescência deste trabalho. A Cirlene Maria da Silva pelo auxílio técnico, disponibilidade e, acima de tudo, pela amizade depositada nestes dois anos. A Camilla Vila Nova pela tradução e correção do texto em inglês. Aos amigos, colegas e ex-colegas do Laboratório de Genética e Citogenética Animal (UFPE): Adriana, Amanda, Angélica, Bárbara, Carolina (Carol), Cibele, Cybelle, Danielle, Diogo, Evillis, Graciela, Guilherme, Iane, Jefferson, Marcela, Martin, Myrella, Nara, Nayara, Pollyanna, Sárah, Thatiana e Tyago, minha sincera gratidão pela amizade, disponibilidade, incentivo, pelas ajudas ao decorrer do trabalho e pelas divertidas conversas no Laboratório. A Ituza Celeste pela amizade, incentivo, companheirismo e cumplicidade desde os tempos de graduação.

8 A Merilane Calixto pela amizade, estímulo, pelas longas conversas e confidências, pelos momentos de lazer e, principalmente, por me incentivar nos momentos difíceis. Às professoras Neide Santos e Vilma Loreto pela disponibilidade, conselhos e ensinamentos. Aos amigos e ex-colegas do Laboratório de Biodiversidade e Genética de Insetos (UPE): Celso, Cristiane (Cris), Fernando, Maria Clara, Mônica, Nathália e Professora Rita Moura. Aos colegas de turma do curso de Mestrado: Betânia, Diego, Felipe, Gabriela, Geyner, Ituza, Júlia, Marília, Nara, Petra, Rodrigo, Thatiana e Will. A coordenação e secretaria do Programa de Pós-graduação em Genética (PPGG) pelo auxílio prestado durante o mestrado. Aos professores do PPGG, pela contribuição para a minha formação. Aos funcionários do Departamento de Genética, em especial, Francisca (Fran), Gilzinete (Dona Zizi) e Romildo pela atenção, disponibilidade e respeito. A Aliny Costa e a Flávia Arruda pela amizade, companheirismo, estímulo, conversas, farras e acima de tudo por nunca ter me negado ajuda nos momentos em que mais precisei. Aos amigos Camilla, Débora, Érika (Érikinha), Manuela (Manú), Márcia, Naara, Raul e a família Tiné, Maria Juliana, Fernando e Fernandinho pela amizade, paciência, incentivo, apoio e pelos maravilhosos momentos de lazer. As minhas eternas amigas Andréa, Bruna, Érica, Francimary (Mary), Leila, Ligia e Marilian pelo carinho, apoio, incentivo, confidências, farras, risadas... Amo vocês! A todos que de alguma forma contribuíram para conclusão deste trabalho.

9 SUMÁRIO Lista de Abreviaturas Lista de Figuras Lista de Tabelas Introdução Resumo Abstract i ii iii iv vi viii 1. Revisão da Literatura Considerações Gerais sobre a Família Acrididae Caracterização Cariotípica em Acridoidea Citogenética Convencional Cromossomo Megamérico Variabilidade Cariotípica Heterocromatina Constitutiva (HC) Considerações Gerais Padrão de Distribuição e Qualificação da Heterocromatina Constitutiva em Acridoidea Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) Considerações Gerais Regiões Organizadoras de Nucléolos em Gafanhotos Objetivos Objetivo Geral Objetivo Específicos Materiais e Métodos Materiais Métodos Processamento dos Espécimes Preparações Citológicas Coloração Convencional Bandeamento C Coloração CMA 3 /DA/DAPI Impregnação com Nitrato de Prata (AgNO 3 ) 42

10 Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) Documentação Fotográfica Resultados 4.1. Baeacris punctulatus 4.2. Dichroplus fuscus Discussão Conclusões Referências Bibliográficas Anexo Fotografias das Espécies Estudadas 75

11 Lista de Abreviaturas AgNO 3 AT Ba(OH) 2 CCB Nitrato de prata Pares de bases Adenina e Timina Hidróxido de bário Centro de Ciências Biológicas CMA 3 Cromomicina A 3 - CMA 3 Marcação CMA 3 negativa + CMA 3 Marcação CMA 3 positiva DAPI 4-6-diamidino-2-fenil-indol DAPI - Marcação DAPI negativa DAPI + Marcação DAPI positiva DNA Ácido desoxirribonucleico DNAr DNA ribossômico ER Enzimas de Restrição FISH Hibridização in situ fluorescente G Cromossomo de tamanho grande GC Pares de base Guanina e Citosina HC Heterocromatina constitutiva HCl Ácido clorídrico HF Heterocromatina facultativa M Cromossomo de tamanho médio MM Mitramicina P Cromossomo de tamanho pequeno Pb Pares de bases PEV Variegação por efeito de posição RNA Ácido ribonucleico RNAr RNA ribossômico RON Região organizadora de nucléolo SSC Solução salina citrato UFPE Universidade Federal de Pernambuco UFRPE Universidade Federal Rural de Pernambuco UPE Universidade de Pernambuco X Cromossomo X i

12 Lista de Figuras Figura 1. Células meióticas de Baeacris punctulatus coradas convencionalmente. (a) Paquíteno; (b) diplóteno; (c) metáfase I; (d) metáfase II. Barra = 5 µm. 49 Figura 2. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração CMA 3 /DA/DAPI (c, d) em cromossomos meióticos de Baeacris punctulatus. (a, b) Diplótenos; (c, d) + paquítenos. As cabeças de seta em c apontam os diminutos blocos CMA 3 pericentroméricos. A seta indica o bloco intersticial adicional. Barra = 5 µm. 50 Figura 3. Diferentes marcações das RONs ativas detectada pela impregnação com AgNO 3 em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, c, d) Zigótenos; (b) diplóteno; (e, f) paquítenos iniciais. Barra = 5 µm. 51 Figura 4. Comparação entre as frequências de atividade das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) localizadas apenas em autossomos e em autossomos e no cromossomo X em Baeacris punctulatus. 52 Figura 5. FISH com sonda de DNAr 45S em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, b) Paquíteno; (c, d) metáfase II. Em a e c coloração com DAPI. Barra = 5 µm. 53 Figura 6. Coloração convencional em células meióticas de Dichroplus fuscus. (a) Paquíteno; (b) diacinese; (c) metáfase I; (d) anáfase I. Barra = 5 µm. 54 Figura 7. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração (CMA 3 /DA/DAPI) (c, d) em células paquitênicas de Dichroplus fuscus. Em c paquíteno corado com CMA 3 e em d paquíteno corado com DAPI. As setas indicam os diminutos blocos pericentroméricos de HC no bivalente G 2. Barra = 5 µm. 55 Figura 8. Cromossomos meióticos de Dichroplus fuscus após impregnação com AgNO 3 (a, b) e FISH com sonda de DNAr 45S (c, d). (a) Zigóteno; (b, c, d) paquíteno. Em c célula corada com DAPI. As setas indicam os sítios de DNAr 45S. Barra = 5 µm. 56 ii

13 Lista de Tabelas Tabela 1. Número de espécies analisadas, tipos de cariótipos e mecanismos sexuais em Melanoplinae. 15 Tabela 2. Número de espécimes estudados de Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus, locais de coleta e coordenadas geográficas. 40 Tabela 3. Comparação entre as freqüências de atividade das RONs em Baeacris punctulatus. 46 iii

14 INTRODUÇÃO

15 Introdução Acridoidea representa uma superfamília de gafanhotos com ampla distribuição mundial. Estudos citogenéticos são amplamente realizados neste grupo, especialmente, em acridomorfos das regiões Paleártica e Neotropical. Entretanto, para essa última, a maioria destes estudos está restrita a análise convencional, revelando apenas número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de determinação sexual. Análises com colorações diferenciais e técnicas moleculares têm sido realizadas em poucas famílias, sendo Acrididae e Romaleidae as mais estudadas. O cariótipo modal (2n=23,X0:24,XX) é considerado primitivo para Acrididae. Apesar da conservação cariotípica deste grupo, variações em relação tanto ao número diplóide quanto ao mecanismo sexual foram observadas. Melanoplinae merece destaque por ser a subfamília com maior diversidade cariotípica dentro desta família. O gênero Dichroplus, por exemplo, apresenta variação do número diplóide de 2n=23, como encontrado em D. elongatus, até 2n=8, sendo este o menor número cromossômico para Acridoidea e encontrado, exclusivamente, em D. silveiraguidoi. Quanto ao padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) e de regiões organizadores de nucléolos (RONs), os acridídeos exibem uma grande variabilidade e heterogeneidade. Contudo, a distribuição de HC pericentromérica e a presença de duas RONs localizadas, geralmente, em cromossomos de tamanho médio e pequeno, são considerados os padrões mais comuns para este grupo. Apesar da grande variabilidade cariotípica encontrada nos melanoplíneos, poucos estudos têm sido desenvolvidos neste grupo. A análise cariotípica em Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus com técnicas mais refinadas, as quais permitem caracterizar a distribuição e composição da HC, bem como a localização das RONs e dos sítios de DNAr, permitirá uma melhor caracterização cromossômica dessas espécies. Estes dados poderão contribuir para uma melhor compreensão dos padrões cromossômico-evolutivos dentro da subfamília Melanoplinae. v

16 RESUMO

17 Resumo A subfamília Melanoplinae constitui um grupo de gafanhotos com a maior diversidade cariotípica dentro de Acrididae. O objetivo principal deste trabalho foi estudar cromossomos meióticos dos melanoplíneos Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus através de diferentes técnicas citogenéticas. Baeacris punctulatus e D. fuscus apresentaram os cariótipos 2n=23,X0 e 2n=19,X0, respectivamente. Em D. fuscus, o bivalente P 9 apresentou comportamento megamérico durante o ciclo meiótico. A localização da heterocromatina constitutiva (HC) foi preferencialmente pericentromérica, embora ocorram blocos adicionais nas duas espécies. A coloração CMA 3 /DA/DAPI evidenciou blocos CMA 3 positivos, correspondendo a HC detectada pelo bandeamento C de todos os cromossomos, com exceção dos blocos terminais de alguns cromossomos nas duas espécies e de um bloco CMA 3 positivo intersticial sem marcação para o bandeamento C em B. punctulatus. A coloração com DAPI foi uniforme em B. punctulatus, enquanto que em D. fuscus, os blocos CMA 3 positivos foram DAPI negativos. A impregnação com AgNO 3 e a FISH mostraram seis regiões organizadoras de nucléolos (RONs) em B. punctulatus e duas, em D. fuscus. Na primeira espécie foi observada expressiva variação na atividade das RONs. Os dados obtidos neste trabalho revelaram a existência de uma grande variabilidade cariotípica, tanto em relação ao número diplóide quanto aos padrões de localização e composição da HC e de distribuição das RONs, incluindo um padrão inédito para Acridoidea referente ao número e frequência de atividade das RONs. Palavras-chave: Melanoplinae, cariótipo, HC, RONs. vii

18 ABSTRACT

19 Abstract The subfamily Melanoplinae constitutes a group of grasshoppers with the bigger karyotypic diversity inside Acrididae. The main objective of this work was to study meiotic chromosomes of the melanoplines Baeacris punctulatus and Dichroplus fuscus through different citogenetics techniques. Baeacris punctulatus and D. fuscus presented karyotypes 2n=23,X0 and 2n=19,X0, respectively. In D. fuscus, the bivalent P 9 presented megameric behavior during the meiotic cycle. The localization of the constitutive heterochromatin (CH) was preferentially pericentromeric, although additional blocks occur in both species. CMA 3 /DA/DAPI staining evidenced CMA 3 positive blocks, corresponding to CH detected by the C-banding of all chromosomes, except for the terminal blocks of some chromosomes in both species and one CMA 3 positive interstitial block without label for banding-c in B. punctulatus. Staining with DAPI was uniform in B. punctulatus, while in D. fuscus, the CMA 3 positive blocks were DAPI negative. The impregnation with AgNO 3 and FISH showed six nucleolar organizer regions (NORs) in B. punctulatus and two, in D. fuscus. In the first species a significant variation in the activity of NORs was observed. Data obtained in this work revealed the existence of a great karyotypic variability, as in relation to the diploid number as regarding to patterns of CH localization and composition and of NORs distribution, including a new pattern to Acridoidea referent to number and frequency of NORs activity. Key- words: Melanoplinae, karyotype, CH, NORs. ix

20 REVISÃO DA LITERATURA

21 1. Revisão da Literatura 1.1. Considerações Gerais sobre a Família Acrididae Acridoidea corresponde a uma superfamília de gafanhotos com ampla distribuição mundial. Esta superfamília está agrupada em seis famílias: Tristiridae, Pauliniidae, Ommexechidae, Romaleidae, Pyrgomorphidae e Acrididae, sendo as duas últimas distribuídas em todo mundo e as demais, Neotropicais. Acrididae é uma família bastante representativa, possuindo cerca de gêneros descritos em todo o mundo. Para região Neotropical, está constituída por mais de 270 gêneros. Isso decorre provavelmente de sua ampla radiação adaptativa em diversos habitats, desde florestas tropicais até condições semi-áridas (Amedegnato, 1974; Carbonell, 1977; Kevan, 1982). Acrididae possui dez subfamílias, as quais têm sido divididas em dois grupos. O primeiro compreende Acridinae, Cyrtacanthacridinae, Gomphocerinae, Melanoplinae e Oedipodinae, e apresenta distribuição mundial. O segundo, por sua vez, é composto por Copiocerinae, Leptysminae, Ommatolampinae, Rhytidochrotinae e Proctolabinae, sendo exclusivamente Neotropical (Carbonell, 1977). A subfamília Melanoplinae compreende mais de 100 gêneros e 900 espécies, distribuídas por todo o Novo Mundo e partes da Eurásia (Otte, 1995). Para região Neotropical, está representada por 43 gêneros e 232 espécies (Cigliano, 2007). Melanoplinae inclui os gêneros de maior diversidade e distribuição geográfica da acridinofauna das Américas, com numerosas espécies de importância econômica (Michel e Terán, 2005a). Amedegnato et al. (2003) sugeriram, através de uma análise filogenética molecular, que esses gafanhotos tiveram origem na América do Sul e se dispersaram para a América do Norte e, posteriormente, para a Eurásia. O gênero Baeacris (Dichroplini) compreende nove espécies descritas: B. bogotensis (Carbonell & Ronderos, 1973), B. descampsi (Carbonell & Ronderos, 1973), B. maquiritare (Carbonell & Ronderos, 1973), B. morosus (Rehn, J.A.G., 1905), B. penianus (Ronderos, 1992), B. pseudopunctulatus (Ronderos, 1964) B. punctulatus (Thunberg, 1824), B. talamancensis Rowell & Carbonell, 1977 e B. tarijensis (Ronderos, 1979). No entanto, apenas B. pseudopunctulatus e B. punctulatus tem sido encontradas na região Nordeste do Brasil (Carbonell, comunicação pessoal). A última espécie é aquela com mais ampla distribuição geográfica dentro do gênero (Ronderos e Cigliano, 1991; Michel e Terán, 2005b). 11

22 Assim como a maioria das espécies de Melanoplinae, B. punctulatus é de difícil identificação dentro do gênero, e encontra-se incluída no grupo punctulatus, um conjunto de espécies com aspectos morfológicos uniformes, sendo separado pelas características do complexo fálico (Michel e Terán, 2005b; Colombo et al., 2005). Devido a essa uniformidade, B. punctulatus foi inicialmente descrita como pertencente ao gênero Dichroplus (Ronderos, 1964; Carbonell e Ronderos, 1973). Posteriormente, as espécies do grupo punctulatus foram transferidas para o gênero Baeacris (Ronderos e Cigliano, 1991; Michel e Terán, 2005b). Dichroplus, também percente à tribo Dichroplini, está constituído por 23 espécies. O gênero é caracterizado por uma considerável uniformidade morfológica externa. Entretanto, as espécies podem ser separadas por uma notável divergência na genitália masculina. Devido à grande semelhança entre os espécimes, o status taxonômico deste grupo também é de difícil interpretação. Consequentemente, muitas espécies designadas inicialmente como Dichroplus têm sido recentemente transferidas para outros gêneros (Colombo et al., 2005; Carbonell e Mesa, 2006). Ronderos e Cigliano (1991), por exemplo, descreveram o novo gênero Ponderacris, incluindo as espécies Dichroplus auriventris (Bruner, 1913), D. bolivianus (Ronderos e Carbonell, 1971), D. cuzcoensis (Ronderos e Carbonell, 1971), D. inca (Ronderos e Carbonell, 1971) e D. peruvianus (Stal, 1878). Posteriormente, Cigliano (1997) transferiu de Dichroplus para Ronderosia as espécies D. bergi (Stal, 1978), D. cinctipes Bruner, 1906, D. dubius Bruner, 1906, D. paraguayensis Bruner, 1906, D. robustus Bruner, 1906, D. forcipatus Rehn, 1918, D. gracilis Bruner, 1911, D. malloi Liebermann, 1966 e D. piceomaculatus Carbonell, Por esta razão, Dichroplus ainda não é satisfatoriamente distinguido dos outros gêneros de Dichroplini (Colombo et al., 2005). Os representantes do gênero Dichroplus são usualmente dominantes, tanto em número de espécies quanto de indivíduos, em muitas comunidades de gafanhotos da Argentina, Uruguai, partes da Bolívia, Paraguai, Chile e do sul do Brasil. Algumas espécies são de grande importância econômica por serem consideradas pragas agrícolas. Dentre estas podem ser destacadas D. elongatus e D. pratensis, as quais são consideradas grandes devastadoras de diversas culturas (Cigliano et al., 2000; 2002). 12

23 1.2. Caracterização Cariotípica em Acridoidea Citogenética Convencional Estudos cromossômicos em representantes de Acridoidea da região Neotropical são bastante numerosos. Estes estudos tiveram início com Saéz (1930) e, posteriormente, vários trabalhos foram importantes para a análise da acridofauna desta região. Mesa et al. (1982) reuniram dados cariológicos de 289 espécies desta superfamília, distribuídas em seis famílias: 214 espécies pertencentes à família Acrididae, 45 Romaleidae, 19 Ommexechidae, 8 Tristiridae, 2 Pauliniidae e apenas 1 Pyrgomorphidae. Segundo Mesa et al. (1982) o cariótipo modal para os acridoideos Neotropicais é do tipo 2n=23,X0( ):24,XX( ), com cromossomos de morfologia acrotelocêntrica. Apesar da conservação cariotípica dos acridoideos, algumas espécies apresentam cariótipos derivados devido a vários rearranjos estruturais. O número cromossômico dos representantes da superfamília Acridoidea pode variar de 2n=8 em Dichroplus silveiraguidoi (Acrididae) até 2n=25 em Conometopus sulcaticollis (Ommexechidae). Quanto ao mecanismo de determinação do sexo, além da predominância do mecanismo X0, a ocorrência dos sistemas XY e X 1 X 2 Y também foi observada entre as espécies Neotropicais (Mesa et al., 1982). A família Acrididae é a mais estudada citogeneticamente dentro de Acridoidea e exibe, em geral, grande conservação cariotípica. A subfamília Leptysminae, por exemplo, apresenta em sua maioria 2n=23,X0 e cromossomos acrocêntricos (Mesa et al., 1982). Este cariótipo padrão também foi observado em Stenacris megacephala, Eumastusia koebelei (Mesa e Fontanetti, 1983) e Belosacris coccineipes (Loreto e Souza, 2000). Rocha et al. (2004) analisaram os cariótipos de Cornops aquaticum, C. frenatum frenatum, Stenopola dorsalis, Stenacris xanthochlora e Tucayaca parvula. Todas as espécies mostraram 2n=23,X0:24,XX e cromossomos acrotelocêntricos, demonstrando a preservação cariotípica dentro desta subfamília. No entanto, apesar desta conservação, algumas espécies mostram redução do número diplóide, como foi descrito para Leptysma argentina com 2n=21,X0 (Bidau e Hasson, 1984), Stenopola pallida e Tetrataenia surinama com 2n=21,X0 e 2n=19,X0, respectivamente (Mesa et al., 1982). Gomphocerinae é uma subfamília com ampla distribuição mundial. Para região Neotropical, a maioria das espécies analisadas apresentaram cariótipo 2n=23,X0:24,XX e cromossomos com morfologia acrotelocêntrica (Mesa et al., 1982; Vilardi, 1986; Remis, 1993). Uma exceção é o gafanhoto Scyllina signatipennis, o qual apresentou 13

24 2n=22,XY:22,XX, resultado de uma translocação X-autossomo (Mesa et al., 1982; Bidau, 1984). Recentemente, Loreto et al. (2008a) analisaram Rhammatocerus brasiliensis, R. palustris, R. bruneri, R. pictus e Amblytropidia sp., todas com cariótipos similares 2n=23,X0:24,XX e cromossomos acrotelocêntricos. A maioria dos gonfoceríneos da Região Paleártica e Neártica, no entanto, apresenta cariótipos derivados, principalmente do tipo 2n=17,X0:18,XX e com três pares cromossômicos com dois braços. Euchorthippus chopardi, E. pulvinatus, Stenobothrus grammiaes, Omocestus panteli e O. raymondi são alguns exemplos de gonfoceríneos com cariótipos 2n=17,X0, e que apresentam cromossomos metacêntricos (Santos et al., 1983; Cabrero e Camacho, 1986a,b). Eclipophleps glacialis apresentou o cariótipo 2n=17,X0 e cromossomos submetacêntricos (L 1, L 2 e M 6 ), metacêntrico (L 3 ), subacrocêntrico (M 4 ) e acrocêntricos (M 5, P 7 e P 8 ). Rearranjos cromossômicos, tais como fusões e inversões, foram responsáveis pela modificação do cariótipo modal nesta espécie (Bugrov, 1994). Mudanças do cariótipo modal, também, têm sido observadas no gênero Chorthippus. A maioria de suas espécies apresentou redução do número diplóide 2n=23 para 2n=17. São exemplos as espécies Chorthippus paralellus, C. dorsatus, C. jucundus, C. apicalis, C. nevadensis, C. binotatus e C. vagans (Santos et al., 1983; Cabrero e Camacho, 1986a,b). Chorthippus brunneus e C. jacobsi também mostraram o cariótipo similar 2n=17,X0, consistindo de três pares metacêntricos grandes, quatro acrocêntricos médios e um acrocêntrico pequeno. O cromossomo X foi o maior acrocêntrico do complemento (Bridle et al., 2002). A redução do número diplóide no gênero Chortippus pode ser considerada um marcador cariotípico para suas espécies. Apenas C. hammarstroemi e C. schamidti foram descritas com 2n=21,X0:22,XX e 2n=23,X0:24,XX, respectivamente, diferindo do cariótipo padrão para este grupo (Bugrov, 1996). O gênero Schistocerca, pertencente à subfamília Cyrtacanthacridinae, embora apresente um grande número de espécies e uma ampla distribuição, principalmente nas Américas, tem sido pouco estudado em nível cromossômico. Entre as espécies americanas, apenas quatro foram estudadas citologicamente: S. cancellata, S. flavofasciata, S. pallens e S. paranensis. Todas mostraram número diplóide 2n=23,24, mecanismo sexual X0:XX e cromossomos acrocêntricos (Mesa et al., 1982; Souza e Melo, 2007). A subfamília Melanoplinae merece destaque por apresentar grande diversidade cariotípica. Dentre as espécies de Acrididae listadas por Mesa et al. (1982), cerca de 32% apresentaram cariótipos derivados sendo concentrados em poucos gêneros pertencentes principalmente a Melanoplinae. Esta subfamília apresentou 45 de suas 93 espécies descritas com cariótipos derivados, incluindo espécies que apresentaram variação do número diplóide e 14

25 mecanismo sexual como, por exemplo, em Leiotettix sanguineus (2n=23,X0 e 2n=22,XY). Na Tabela 1 estão representadas as espécies de Melanoplinae distribuídas por gêneros listadas por Mesa et al. (1982), bem como os tipos de cariótipos (modal ou derivado) e mecanismos sexuais. Dichroplus é um gênero caracterizado por uma extrema diversidade cariotípica, variando desde o cariótipo básico com 2n=23:24 encontrado, por exemplo, em D. elongatus até o número extremamente reduzido 2n=8 em D. silveiraguidoi (Mesa et al., 1982; Colombo et al., 2005). Além dos números diplóides limites para o gênero, têm sido descritas espécies com 2n=18 (D. obscurus), 2n=19 (D. vittatus), 2n=21 (D. patruellis) e 2n=22 (D. posteri). O mecanismo sexual X0 é o mais comum dentro do gênero. Contudo, os mecanismos XY e X 1 X 2 Y também têm sido observados (Mesa et al., 1982). Tabela 1. Número de espécies analisadas, tipos de cariótipos e mecanismos sexuais em Melanoplinae. Gêneros Números de Cariótipo Mecanismo sexual espécies Modal (2n=23) Derivado X0 XY X 1 X 2 Y Apacris Atrachelacris Bogotacris Chlorus Dichroplus * Eurotettix Leiotettix * Nahuelia Neopedies Parascopas Pedies Propedies Pseudoscopas Scotussa TOTAL * Algumas espécies possuem polimorfismos para número diplóide e mecanismo sexual. Fonte: Mesa et al. (1982) Cromossomo Megamérico O cromossomo megamérico é um marcador cariotípico frequentemente encontrado no genoma de gafanhotos. Ele é caracterizado por sua natureza heterocromática e por sofrer condensação precoce na prófase meiótica, sendo facilmente identificado durante o paquíteno e diplóteno devido a sua heteropicnose positiva durante estas fases (White, 1973; Hewitt, 1979). 15

26 Geralmente, o megamérico é o terceiro menor cromossomo do complemento (ou seja, o número 9 em um cariótipo básico com 2n=23,X0 ou o número 6 em cariótipo com 2n=17,X0) (Hewitt, 1979). Arcyptera microptera, A. tornasi, Callephorus compressicornis, Sphingonotus azurescens são exemplos de espécies com o cariótipo 2n=23,X0 que possuem um cromossomo megamérico correspondendo ao par P 9. Myrmeleotettix maculatus, Chorthippus parallelus, C. binotatus e Euchorthippus pulvinatus, por sua vez, possuem 2n=17,X0 e o megamérico corresponde ao par M 6 (Santos e Giráldez, 1982; Santos et al., 1983; Bella et al., 1990a). A presença de cromossomo megamérico tem sido relatada em muitas espécies de Acrididae, sendo considerada, em muitos casos, uma característica marcante de alguns clados (Hewitt, 1979). Loreto et al. (2008a) observaram a presença de um megamérico no gonfoceríneo Amblytropidia sp, correspondendo ao cromossomo M 8. Anteriormente, Remis (1989) também relatou a ocorrência deste tipo de cromossomo em Amblytropidia australis, sendo este correspondente provavelmente ao par M 8 ou M 9. Acrotylus insubricus e A. patruelis, ambas pertencentes à subfamília Oedipodinae, exibem o cariótipo 2n=23,X0. Estas espécies apresentam um cromossomo megamérico, o qual foi identificado pela condensação precoce durante a prófase I. Entretanto, foram observadas diferenças em relação ao tamanho do par correspondente ao marcador, sendo em A. insubricus o bivalente M 9 e em A. patruelis, o P 9 (Camacho e Cabrero, 1983). Oedipoda charpentieri também possui o cariótipo básico 2n=23,X0. Nesta espécie, o bivalente M 6 é um megamérico. Contudo, o par correspondente a este marcador difere em outras espécies do gênero (O. fuscocincta, O. coerulescens e O. germânica), nas quais o bivalente megamérico é o par M 9 (Santos et al., 1983; Camacho et al., 1986; Navas-Castillo et al., 1987). O bivalente M 9 de Valanga nigrocornis (Cyrtacanthacridinae) também exibe comportamento megamérico. Este cromossomo está envolvido em uma fusão cêntrica com o bivalente M 8, resultando na formação de um trivalente durante a meiose I. Devido à similaridade em tamanho e morfologia (ambos são telocêntricos), os pares envolvidos neste rearranjo só podem ser distinguidos por seu comportamento durante a prófase meiótica, na qual é observado que o M 9 se condensa precocemente. Como resultado da fusão ocorre a formação de um cromossomo difásico (um cromossomo que possui um braço heterocromático e o outro, eucromático) (Teoh e Yong, 1983). No melanoplíneo Dichroplus vitattus, por sua vez, foi relatado que um cromossomo megamérico está envolvido no rearranjo cromossômico que deu origem ao sistema neo-xy da espécie. Bidau e Martí (2001) observaram que em células meióticas de machos, o bivalente 16

27 sexual neo-xy forma uma massa heteropicnótica positiva até o final da diacinese, onde esta começa a ser descondensada. Na metáfase I, estes cromossomos apresentam heteropicnose negativa, ao contrário do que ocorre em indivíduos neo-xy padrão. Os autores sugeriram que a origem do mecanismo sexual de D. vitattus ocorreu a partir de uma fusão em tandem de dois cromossomos X telocêntricos originais, seguida por uma outra fusão em tandem com um pequeno bivalente megamérico e uma inversão pericêntrica, resultando em um neo-x metacêntrico grande e um neo-y telocêntrico pequeno. Cromossomos megaméricos também são comuns em outras famílias de Acridoidea. Em Atractomorpha, gênero pertencente à Pyrgomorphidae, a presença deste cromossomo foi considerada como um marcador cariótipo para o grupo. Nankivell (1976) analisando espécies do grupo crenaticeps de Atractomorpha (A. crenaticeps, A. similis, A. australis) observou o comportamento megamérico do menor bivalente autossômico do complemento, o P 9, em todas as espécies. Rocha et al. (1997) também observaram a presença de cromossomo megamérico nos romaleídeos Radacridium nordestinum e R. mariajoseae, correspondendo ao par M 9 nas duas espécies Variabilidade Cariotípica Durante a evolução do genoma de gafanhotos diversas alterações cromossômicas tem sido observadas. Dentre estas, as mais frequentes são inversões, translocações, fusões e fissões cêntricas e presença de heterocromatina extra, sob a forma de cromossomo B e segmentos supernumerários. Cada um desses tipos de variações pode ter um efeito peculiar sobre vários fatores, tais como frequência e distribuição de quiasmas, fertilidade, tamanho do corpo e sucesso no cruzamento; podendo se fixar na população e substituir a forma original ou assumir uma forma polimórfica (Hewitt, 1979). Inversões pericêntricas são bastante comuns em algumas populações naturais de gafanhotos, as quais convertem a morfologia cromossômica de acrocêntrica para metasubmetacêntrica, ou vice-versa. Inversões paracêntricas, em geral, têm sido descritas neste grupo de insetos (White, 1973). Camnula pellucida (Nur, 1968), Boonacris alticola (Haines et al., 1978) e Chorthippus jacobsi (Díez e Santos, 1993) são exemplos das poucas espécies que apresentam polimorfismo para inversão paracêntrica. Representantes do gênero Trimerotropis merecem destaque por apresentarem uma alta frequência de inversões pericêntricas. Populações naturais de T. pallidipennis encontradas na América do Sul, por exemplo, exibiram um alto grau de polimorfismo para este tipo de 17

28 inversão nos pares 4, 6, 7 e 8. A frequência de inversão pericêntrica nesta espécie pode ser correlacionada a vários fatores, tais como altitude, latitude, longitude, temperatura e umidade, e tem apresentado uma grande influência na frequência e distribuição de quiasmas (Vaio et al., 1979; Confalonieri, 1994; Colombo e Confalonieri, 1996). Abracris flavolineata (Ommatolampinae) apresenta morfologia cromossômica diferente daquela comumente encontrada em representantes de Acridoidea. Esta espécie apesar de possuir número diplóide de 2n=23,X0 mostrou cromossomos metasubmetacêntricos e subtelocêntricos em todo complemento cariotípico. Esse padrão atípico foi atribuído à adição de heterocromatina constitutiva e inversão pericêntrica (Cella e Ferreira, 1991). O romaleídeo Xestotrachelus robustus também apresentou polimorfismo para inversão pericêntrica. A espécie possui cariótipo 2n=23,X0 e seus cromossomos são divididos em três pares grandes, cinco médios e três pequenos, onde dois bivalentes pequenos são metasubmetacêntricos e os demais, acrocêntricos. Alguns espécimes da população da Chapada Diamantina (Bahia) foram heterozigotos para inversão pericêntrica no par M 8, sendo um cromossomo acrocêntrico e o outro submetacêntrico. Na população de Buíque (Pernambuco), alguns espécimes foram homozigotos para esse rearranjo (Souza et al., 2003). Dichroplus pratensis, um gafanhoto com ampla distribuição na América do Sul, apresenta cariótipo 2n=18,X0:18,XX e cromossomos acrocêntricos. Translocações Robertsonianas são responsáveis por polimorfismos envolvendo os seis autossomos de tamanho grande (G 1 -G 6 ) nessa espécie. Heterozigotos e homozigotos para estas translocações apresentaram uma diminuição na frequência média de quiasma por células, além da redistribuição desses quiasmas (Martí e Bidau, 1995; 2001; Bidau e Martí, 2002). Em Dichroplus silveiraguidoi, o número cromossômico extremamente reduzido é resultante de uma série de fusões cêntricas e em tandem, além de inversões pericêntricas, a partir de um possível ancestral com 2n=23. Apesar da redução brusca do número diplóide nesta espécie, o conteúdo de DNA aparentemente não foi alterado (Cardoso et al., 1974; Saéz e Pérez-Mosquera, 1977). Fusões cêntricas também foram descritas para Dichroplus elongatus em duas diferentes populações da Argentina. A presença destas fusões espontâneas teve influência na frequência e distribuição de quiasmas. As fusões foram consideradas mutações espontâneas, porque a frequência das mesmas foi menor que 5% (Clemente et al., 1996). Um amplo polimorfismo cariotípico, envolvendo fusão cêntrica entre os autossomos 3 e 6, foi descrito para Leptysma argentina. Esse rearranjo acarretou alterações nas características morfométricas, tamanho do corpo e sucesso de cruzamento em machos e 18

29 fêmeas. Leptysma argentina possui ainda polimorfismo para ocorrência de segmentos supernumerários e de cromossomos B (Bidau e Hasson, 1984; Colombo et al., 2003). Por outro lado, fissões cêntricas são responsáveis pela mudança do cariótipo básico 2n=23,X0 para 2n=25,X0 em Conometopus sulcaticollis e Oedipoda schochi schochi. Este número diplóide (2n=25) é considerado o maior número cromossômico para família Acrididae. Adicionalmente, O. s. schochi apresentou mudanças na morfologia cromossômica de acrocêntrica para meta-submetacêntrica e subacrocêntrica, decorrentes de inversões pericêntricas (Mesa et al., 1982; Türkoglu e Koca, 2002). A grande maioria das espécies de gafanhotos apresenta o mecanismo sexual X0:XX, cuja origem proposta foi a partir da perda do cromossomo Y do sistema XY:XX. Entretanto, durante a evolução deste grupo diferentes rearranjos deram origem a outros sistemas simples e múltiplos de determinação do sexo. Fusões cêntricas entre o X original e um autossomo, deram origem ao mecanismo neo-xy e fusões sucessivas entre o neo-y e um outro autossomo originaram o sistema múltiplo X 1 X 2 Y (White 1973; Hewitt, 1979; Mesa et al., 1982). Bugrov (1995) analisando duas populações de Podisma sapporensis, provenientes da Rússia, observou que o complemento cromossômico de P. sapporensis da população de Sakhalin consiste de 2n=23,X0:24,XX, sendo todos os autossomos acrocêntricos e o X submetacêntrico devido a uma inversão pericêntrica. Indivíduos da população de Kunashir, por sua vez, apresentaram número diplóide 2n=20 e mecanismo sexual neo-xy, resultado de uma translocação entre o X e um autossomo. Sinipta dalmani, por sua vez, apresenta um polimorfismo para fusão cêntrica entre o X e o M 5, determinando a formação de um sistema neo-xy. Nesta espécie, tanto nos indivíduos X0 como neo-xy, há formação de macroespermátides. Porém, foi observado que em portadores da fusão a frequência média de produção de macroespermátides aumenta significantemente, além da ocorrência da formação de microespermátides. Adicionalmente, S. dalmani apresentou polimorfismo para inversão pericêntrica envolvendo o par M 4. Este polimorfismo também acarretou a produção de macroespermátides e afetou os caracteres morfológicos dos espécimes, levando à diminuição do tamanho do corpo na condição homozigota (Remis 1993; 1997). Uma análise comparativa do comportamento meiótico dos bivalentes sexuais (neo-xy e neo-xx) em D. vittatus, cuja origem foi a partir de fusões entre autossomo e cromossomo X, revelou que a frequência média de quiasmas foi baixa em ambos os sexos, porém foi ligeiramente mais alta em machos que em fêmeas. A distribuição de quiasmas foi basicamente distal em ambos os sexos. Durante a meiose, a orientação do neo-xy mostrou-se bastante 19

30 irregular, tendo apenas 21% das metáfases I mostrando orientação padrão. Nas fêmeas, por sua vez, o neo-xx apresentou um comportamento mais regular, mostrando apenas 17% das células com orientação atípica (Bidau e Martí, 2001) Heterocromatina Constitutiva (HC) Considerações Gerais Nas células eucarióticas, o material genético está organizado dentro de uma estrutura complexa denominada cromatina. Esta pode ser diferenciada em dois tipos: eucromatina, a qual apresenta um ciclo de condensação-descondensação em diferentes estágios do ciclo celular e heterocromatina, que se mantém condensada durante todo ciclo celular (Wallrath, 1998; Dillon, 2004). Brown (1966) classificou a heterocromatina baseado em seu comportamento em heterocromatina facultativa (HF) e heterocromatina constitutiva (HC). A HF se refere às regiões reversíveis do genoma, que podem mudar do estado heterocromático para eucromatina, dependendo do estágio de desenvolvimento ou do tipo de célula. Difere da HC por envolver cromossomos inteiros e por possuir composição de DNA semelhante à eucromatina, não sendo nem rica em DNA satélite nem carente de genes (Brown, 1966; Mattei e Luciani, 2003; Dillon, 2004). Exemplos de HF são o corpúsculo de Barr, o qual é formado pela inativação de um ou mais cromossomos X em fêmeas de mamíferos, e a inativação do conjunto cromossômico de origem paterna em alguns insetos fitófagos da ordem Homoptera (Lyon, 1999; Sumner, 2003). A HC, por sua vez, caracteriza-se pela condensação durante todo o ciclo celular, por apresentar replicação tardia, baixa frequência de recombinação, pequeno acesso a nucleases, alto grau de metilação e baixo de acetilação (Wallrath, 1998; Henikoff, 2000; Mattei e Luciani, 2003; Grewal e Jia, 2007). Sua distribuição dentro do cariótipo não acontece por acaso, sendo localizada em sítios e cromossomos específicos. Em geral, ocorre preferencialmente nas regiões pericentroméricas, porém pode ocupar áreas terminais e menos frequentemente, intersticiais (John et al., 1985; Sumner, 2003). Outra característica distintiva da HC é a sua composição de DNA. Os segmentos de HC nos cromossomos dos eucariotas contêm grande concentração de DNA altamente repetitivo, também chamado de DNA satélite (Mattei e Luciani, 2003; Sumner, 2003). Essas 20

31 sequências podem variar em relação ao conteúdo (podendo ser rico em pares de bases AT ou GC) e ao comprimento (podendo variar de 2pb a milhares de repetições de pares de base). Embora exista essa correlação entre a HC e a presença de DNA satélite, nem toda heterocromatina é composta por DNA altamente repetitivo (Sumner, 1990; 2003). Embora a HC tenha sido considerada durante muitos anos como inativa ou mesmo pobre em genes, atualmente tem sido comprovado que a mesma pode conter genes e outras sequências funcionais do DNA (Sumner, 2003; Dillon, 2004). O cromossomo Y heterocromático de Drosophila melanogaster, por exemplo, contém pelo menos nove genes, dos quais seis são fatores de fertilidade (Carvalho et al., 2001). Esta evidência de funcionabilidade da HC tem levado a importantes funções e efeitos na linhagem germinativa e, com menor frequência, na linhagem somática; além de proteger as regiões eucromáticas do genoma contra mutações, crossing-over e elementos parasitas como os retransposons; estabilizar as sequências de DNA repetitivo dos telômeros; afetar a segregação cromossômica e causar variegação por efeito de posição (Wallrath, 1998; Henikoff, 2000; Sumner, 2003). Estudos realizados em vários organismos, especialmente em parasitas nematóides, têm mostrado que quebras cromossômicas são bastante comuns em células somáticas, sendo responsáveis pela perda e desintegração da maior parte da HC. Esta heterocromatina eliminada é composta por segmentos de DNA satélite, os quais estão ausentes nas novas células somáticas, porém conservadas nas células germinativas. Isto sugere que não somente sequências repetitivas, mas também genes específicos imersos na HC são requeridos para função da linhagem germinativa (Müller et al., 1996; Sumner, 2003). A presença da HC pode também influenciar na ocorrência e localização de quiasmas, alterando o número de quiasmas por bivalente, bem como ter um efeito negativo no pareamento cromossômico e crossing-over. Em geral, a recombinação é ausente em regiões de heterocromatina e isto é, frequentemente, associado à falta ou impedimento da formação do complexo sinaptonêmico em tais regiões ou à diferenças na estrutura do complexo sinaptonêmico nas regiões de HC (John, 1990; Sumner, 2003). Adicionalmente, a HC parece ter um importante papel na função do centrômero. As proteínas da heterocromatina estão associadas com repetições de DNA que envolve o centrômero e são requeridas para promover a coesão das cromátides-irmãs e segregação cromossômica. Essas funções são mediadas pela ação de proteínas especiais de ligação à HC, tais como a proteína HP1 (Dernburg et al., 1996; Grewal e Moazed, 2003; Grewal e Jia, 2007). O fenômeno denominado variegação por efeito de posição (PEV), o qual é causado pela mudança de posição de sequências gênicas para as proximidades das regiões de HC, tem sido descrito em vários organismos, desde leveduras até mamíferos. Este fenômeno foi 21

32 observado primeiramente em Drosophila, quando o gene white, requerido para pigmentação vermelha do olho, foi colocado próximo da heterocromatina centromérica por inversão cromossômica, produzindo um mosaicismo vermelho e branco dentro do olho dos indivíduos mutados (Wallrath, 1998; Huisinga et al., 2006). Outro exemplo de PEV é a trans-inativação, também observada em Drosophila, na qual a HC silencia genes no cromossomo homólogo via pareamento somático (Dorer e Henikiff, 1997; Henikoff, 2000). Em leveduras, a PEV nos centrômeros e telômeros está associada a mudanças na acetilação de histonas e à organização dos nucleossomos. Na levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe, por sua vez, o silenciamento está associado ao espalhamento da proteína Swi6 dentro da região silenciada (Partridge et al., 2000). As sequências de DNA repetitivo que compõem a HC podem ser diferenciadas em duas formas: compacta (αhc) ou dispersa (βhc). Esta última representa o estado mais raro da HC, que possui uma estrutura com unidades de repetições variadas, sendo rica em retrotransposons. A β heterocromatina consiste de fibras de cromatina relativamente desorganizadas que se replicam tardiamente e formam uma barreira entre a -heterocromatina cêntrica e a eucromatina. A αhc, por sua vez, está relacionada com as regiões detectadas pelo bandeamento C, sendo constituída por repetições em tandem de sequências simples (Holmquist et al., 1998). Além da heterocromatina constitutiva associada aos cromossomos do cariótipo normal, ditos cromossomos A, tais como a HC localizada pelo bandeamento C e a HC associadas às regiões organizadoras de nucléolos (RONs), existe também a heterocromatina supernumerária ou extra-cromossômica (Jones e Rees, 1982; Camacho et al., 2000). Este tipo de heterocromatina pode ser observado sob a forma de segmentos supernumerários ou cromossomos B. Os segmentos supernumerários, também chamados de segmentos extras, são encontrados em plantas e animais, particularmente em insetos, e podem apresentar variações quanto à natureza (heterocromáticos ou excepcionalmente eucromáticos), quantidade, localização, distribuição e tamanho dos segmentos. Podem estar presentes em populações sob forma polimórfica, caracterizando-se em indivíduos heterozigotos e homozigotos com e sem segmentos. Dependendo da posição ao longo dos cromossomos, podem ser designados como distal, intersticial, proximal ou extrínseco. Quanto ao número, pode apresentar variabilidade entre as populações de uma mesma espécie ou entre indivíduos de uma mesma população (Hewitt, 1979; Camacho et al., 1984; 2000). A presença de cromossomos portadores de segmentos extras pode afetar a frequência de quiasmas no cromossomo portador ou nos demais cromossomos do complemento, podendo também induzir a redistribuição dos 22

33 quiasmas nos pares que os possuem, além de influenciar na atividade das RONs (Jones e Rees, 1982). Os cromossomos B, também chamados de cromossomos supernumerários ou acessórios, são cromossomos extras, geralmente pequenos e heterocromáticos, presentes no cariótipo de algumas espécies. Ocorrem no genoma de vários taxa de animais e plantas, podendo variar em diferentes células de um mesmo indivíduo. Nos animais, grande parte dos exemplos conhecidos de cromossomos B tem sido relatada em insetos, principalmente em coleópteros, dípteros e ortópteros. Este tipo de cromossomo pode variar quanto à morfologia, tamanho, comportamento, frequência e padrão de bandeamento C. Estes cromossomos são ditos estáveis, se todas as células dos indivíduos, que os possuem, apresentam o mesmo número, e instáveis, se o número de cromossomos acessórios variar em diferentes células do mesmo indivíduo. Por outro lado, também são caracterizados por não apresentarem um padrão Mendeliano de herança e, geralmente, não pareiam com nenhum membro do complemento A (Jones e Rees, 1982; Camacho et al., 2000). Nos indivíduos que apresentam estes cromossomos acessórios, a frequência e distribuição de quiasmas pode ser aumentada ou diminuídas, além de ocorrer a possibilidade de produção de micro e macroespermátides (Bidau, 1987; Camacho et al., 2000). Várias técnicas especiais de identificação cromossômica têm sido utilizadas para a análise de regiões específicas de heterocromatina constitutiva. Dentre estas, o bandeamento C é a mais utilizada por ser rápida e precisa para o estudo do padrão de distribuição da heterocromatina em plantas e animais (Sumner, 1972). O uso desta técnica envolve exposição do material biológico a uma solução ácida, depois a uma básica e, em seguida, a uma solução salina em temperatura elevada. Esse material quando submetido à coloração com Giemsa, marca regiões heterocromáticas mais fortemente, formando blocos escuros denominados bandas C (C = constitutiva), porém não fornece dados a respeito da natureza da HC quanto à sua composição de bases e também é inespecífica com relação ao DNA satélite (Sumner, 1990; 2003). A coloração com fluorocromos base-específicos, por sua vez, permite a qualificação da HC quanto à composição de bases. Esta técnica, além de diferenciar a HC, permite verificar a sua variabilidade e heterogeneidade através do uso de corantes fluorescentes específicos para os pares de bases AT ou GC (Schweizer, 1976; 1980). Estes corantes fluorescentes associados a outras substâncias não fluorescentes, como Distamicina A, que funcionam como contracorantes, permitem a qualificação da heterocromatina quanto à composição de bases e podem ser divididos em dois grupos principais: 1) fluorocromos específicos para sítios de DNA ricos em AT (Adenina e Timina) como, por exemplo, a 23

34 Quinacrina, Hoecht e o 4 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e 2) fluorocromos específicos para sítios de DNA ricos em GC (Guanina e Citosina), tais como a Cromomicina A 3 (CMA 3 ) e a Mitramicina (MM) (Schweizer, 1981). A técnica de bandeamento por enzimas de restrição (ER) também tem sido utilizada na caracterização da HC. Certas ER induzem a diferenciação linear similar ao bandeamento C, enquanto outras são capazes de detectar classes de HC que não são detectadas por esta técnica. O bandeamento por ER consiste no tratamento de preparações cromossômicas fixadas com uma solução de endonucleases de restrição, seguidas por coloração, normalmente com Giemsa, mas às vezes com um fluorocromo base-específico. O tamanho das bandas positivas após digestão in situ dos cromossomos metafásicos podem variar de uma ER para outra. Isto ocorre devido à existência de subclasses específicas do DNA repetitivo. Diferentes fatores podem afetar a clivagem da heterocromatina por estas enzimas, sendo a compactação da HC e o tamanho do sítio de restrição os mais importantes na determinação da quantidade de DNA removível (López-Fernández et al., 1991; Rodríguez Iñigo et al., 1993). A hibridização in situ fluorescente (FISH) permite localizar genes e sequências de DNA ao longo dos cromossomos, podendo ser utilizadas diferentes sondas, tais como sondas de sequências únicas e sondas de DNA repetitivo, incluindo o DNA ribossomal e DNA satélite. A técnica fundamenta-se basicamente no pareamento de um determinado segmento de DNA ou RNA (sonda) com uma sequência de nucleotídeos complementar do DNA de interesse, com o intuito de visualizar a seqüência em sua posição exata. A FISH tem sido utilizada na criação de novos tipos de marcadores cromossômicos para análise cariotípica comparada, na construção de mapas físicos para diferentes espécies e na análise de estruturas e rearranjos cromossômicos (Sumner, 2003; Guerra, 2004) Padrão de Distribuição e Qualificação da Heterocromatina Constitutiva em Acridoidea A heterocromatina constitutiva é o mais dinâmico de todos os componentes cromossômicos, podendo sofrer mudanças dentro de uma espécie ou entre espécies diferentes. Estudos sobre a distribuição, variabilidade e heterogeneidade da HC têm sido realizados em várias espécies de gafanhotos, demonstrando diferenças tanto em nível quantitativo quanto qualitativo. A maior parte desses estudos é realizada através do bandeamento C. No entanto, quanto ao uso de ER, FISH e coloração fluorocromos base-específicos, ainda são poucos os 24

35 estudos realizados (King e John, 1980; Cabrero e Camacho, 1986a; Rodríguez Iñigo et al., 1996; Loreto et al., 2005). Na família Ommexechidae, apenas Spathalium helios foi estudada através do bandeamento C. A espécie apresentou blocos de HC na região pericentromérica dos onze bivalentes autossômicos presentes no seu cariótipo. Nos pares 7 e 8 também foram observados pequenos blocos terminais. Nenhuma marcação foi observada no bivalente sexual neo-xy desta espécie (Mesa et al., 1990). Atractomorpha similis, Monistria concinna e Pyrgomorpha conica, espécies pertencentes à família Pyrgomorphidae, apresentaram padrão pericentromérico de HC em todos os cromossomos. No entanto, A. similis exibiu vários blocos intersticiais e/ou terminais adicionais em todo o complemento, sendo muitos destes, polimórficos em relação ao tamanho e à ocorrência. O cromossomo megamérico desta espécie apresentou vários blocos intersticiais, além do padrão pericentromérico. Neste bivalente há evidências de heterogozidade no padrão de bandeamento C. Em M. concinna, por sua vez, foi observado blocos intersticiais no cromossomo X e no bivalente 6, sendo este heterozigoto, e terminais nos bivalentes 4 e 5 (King e John, 1980; Santos et al., 1983). Para família Romaleidae, apenas nove espécies foram estudadas quanto à distribuição e variabilidade da HC, até o momento. A maioria das espécies apresentou blocos pericentroméricos em todos os cromossomos do complemento. Entretanto, blocos intersticiais, terminais, proximais e distais também foram observados. Xyleus angulatus exibiu blocos pericentroméricos em todos os cromossomos e intersticiais nos pares 1, 2, 3. Adicionalmente, a espécie apresentou um cromossomo B instável, predominantemente heterocromático, além de segmentos supernumerários heterocromáticos nos pares 5, 6, 7 e 11 e eucromático no par 10 (Souza e Silva Filha, 1993; Souza e Kido, 1995). Brasilacris gigas, Phaeoparia megacephala e Xestotrachelus robustus também apresentaram HC pericentromérica. No entanto, diferenças de tamanho dos blocos foram observadas entre os cromossomos de P. megacephala. Os bivalentes 9 e 10 de X. robustus foram quase totalmente heterocromáticos (Souza e Kido, 1995; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003). Zoniopoda tarsata exibiu apenas blocos intersticiais nos bivalentes 1, 2, 3 e no cromossomo X. Esta espécie também é polimórfica para presença de segmento supernumerário na porção proximal do P 11 e apresenta dois cromossomos B estáveis (Vilardi, 1986). Rocha et al. (1997) identificaram diferenças na distribuição da HC entre Radacridium mariajoseae e R. nordestinum. Em R. mariajoseae, foram observados blocos pericentroméricos nos bivalentes 1, 10 e 11 e um bloco proximal no bivalente 2. O cromossomo X apresentou blocos pericentromérico, proximal e distal, enquanto o bivalente 9, 25

36 o qual corresponde ao megamérico, exibiu bloco proximal, distal e instersticial. Em R. nordestinum, o bandeamento C detectou pequenos blocos pericentroméricos em todos os cromossomos e instersticial nos bivalentes 2 e 5. Segmentos supernumerários nos bivalentes 3, 4, 6, 7 e 10 foram encontrados nesta espécie. Em representantes do gênero Chromacris, diferenças também foram identificadas. Chromacris nuptialis apresentou blocos de HC em regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos. Os bivalentes 2 e 10 mostraram blocos teloméricos e o par 9, intersticial. Chromacris speciosa, por sua vez, exibiu HC pericentromérica em todos os cromossomos. Adicionalmente, foram observados blocos proximais nos pares 3, 4, 5 e 6, teloméricos nos pares 1 e 2 e intersticiais nos pares 5, 7, 8 e no cromossomo X (Loreto et al., 2005). Apenas cinco espécies de Romaleidae foram analisadas através da coloração com fluorocromos base-específicos. Em Xyleus angulatus, Phaeoparia megacephala e Xestotrachelus robustus, os blocos positivos para o bandeamento C também foram CMA + 3. Entretanto, em P. megacephala o tamanho dos blocos CMA + 3 foi menor nos cromossomos 1, 2, 3 e X, os quais apresentaram grandes blocos de HC detectados pelo bandeamento C (Souza et al., 1998; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003). A espécie Chromacris nuptialis apresentou apenas o bivalente M 6 com bloco CMA + 3 na região pericentromérica. Enquanto, em C. speciosa foi observado dois blocos CMA + 3, sendo um localizado na região proximal do M 6 e o outro na região telomérica do G 2 (Loreto et al., 2005). A coloração com DAPI foi homogênea em todas as cinco espécies estudadas (Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003; Loreto et al., 2005). Acrididae representa a família mais estudada através da técnica de bandeamento C, especialmente para as espécies da região Paleártica (King e John, 1980; Santos et al., 1983; Cabrero e Camacho, 1986a). King e John (1980) analisaram 21 espécies de acridídeos, provenientes da Austrália, revelando a presença de blocos centroméricos em todos os cromossomos do complemento e intersticiais em alguns cromossomos de todas as espécies. Blocos de HC teloméricos foram menos frequentes entre as espécies estudadas. A presença de cromossomo megamérico foi relatada para Aiolopus thalassinus, Calephorops viridis, Perala niridis e Stenacatantops angustifrons. Estes cromossomos apresentaram, em adição aos blocos de HC intersticiais fortes, blocos positivos menos intensos, dando uma aparência mais escura quando comparado com outros elementos do complemento. Santos et al. (1983), por sua vez, analisando 36 espécies de Acrididae da Espanha, observaram que a localização da HC ocorre preferencialmente nas regiões centroméricas e teloméricas, sendo rara a presença de HC intersticial. 26

37 O padrão de distribuição da HC também foi descrito para 20 espécies de Gomphocerinae oriundos da Península Ibérica. Os cromossomos de todas as espécies analisadas exibiram HC pericentromérica. No entanto, estes blocos foram pequenos, restringindo-se apenas a HC centromérica (Omocestus raymondi e Chorthippus dorsatus), ou grandes, estendendo-se do centrômero a região proximal (Stauroderus scalaris, C. binotatus e C. brunneus). A maioria das espécies, entretanto, mostrou blocos pericentroméricos intermediários (como, por exemplo, em Euchorthippus chopardi e C. jucundus). A presença de HC intersticial ou distal também tem sido identificada, na maioria das vezes, em dois pares cromossômicos diferentes dentro do mesmo complemento. Os cromossomos megaméricos de Truxalis nasuta (bivalente 9) e E. pulvinatus (bivalente 6) apresentaram um bloco pericentromérico médio e um intersticial (Cabrero e Camacho, 1986a). Bridle et al. (2002), em uma análise comparativa entre Chorthippus brunneus e C. jacobsi, observaram um padrão similar de distribuição nas duas espécies. Estas apresentaram blocos de HC associados às regiões centroméricas de todos os cromossomos e intersticiais localizados nos braços curtos dos bivalentes G 2 e G 3. Um polimorfismo, para presença de segmentos supernumerários na região distal dos bivalentes M 7 e P 8, foi detectado nas duas espécies. Todos os blocos identificados pelo bandeamento C responderam positivamente aos fluorocromos CMA 3 e Acridina-Orange. Estes revelaram, adicionalmente, uma marcação distal no cromossomo X de C. brunneus. A coloração com o DAPI também corou as regiões banda C positivas, com exceção dos blocos intersticiais dos bivalentes G 2 e G 3 e do bloco distal do cromossomo X de C. brunneus. Acrotylus insubricus, A. patruelis, Oedipoda charpentieri e O. schochi schochi, todos representantes da subfamília Oedipodinae, exibiram blocos de HC na região pericentromérica de todos os cromossomos e blocos adicionais em alguns elementos do complemento. Acrotylus insubricus apresentou HC telomérica nos bivalentes M 6, M 7, M 8 e M 9. Oedipoda charpentieri mostrou um bloco distal no bivalente M 9. O cromossomo megamérico desta espécie, o bivalente M 6, exibiu um bloco distal e um intersticial pequeno. Oedipoda schochi schochi, por sua vez, apresentou blocos distais nos bivalentes 5, 7 e 8, intersticiais nos bivalentes 7 e 8 e o braço curto do bivalente 9 mostrou-se totalmente heterocromático. A espécie A. pratruelis apresentou apenas polimorfismo para ocorrência de segmento supernumerário no par 11. (Camacho e Cabrero, 1983; Navas-Castillo et al., 1987; Türkoglu e Koca, 2002). Estudos com diferentes técnicas para a caracterização da HC em Dociostaurus jagoi e D. genei revelaram grande diferença no conteúdo da heterocromatina entre as duas espécies. O bandeamento C evidenciou HC pericentromérica em todos os cromossomos de ambas as 27

38 espécies. Entretanto, os blocos foram considerados maiores em D. genei. Adicionalmente, D. jagoi apresentou um bloco intersticial no cromossomo G 1 e D. genei exibiu grandes blocos distais em sete cromossomos, sendo cinco desses polimórficos para presença de segmentos supernumerários. O uso de fluorocromos base-específicos revelou uma marcação na região intersticial de G 1 e na região centromérica de um bivalente pequeno em D. jagoi, enquanto em D. genei foi observado um padrão complexo. Nesta espécie, a região proximal apresentou blocos DAPI + e a região pericentromérica da maioria dos cromossomos, blocos CMA + 3. Os segmentos supernumerários foram DAPI + e CMA - 3. O uso de enzimas de restrição nas duas espécies, revelou que a porção centromérica foi extensivamente digerida pelas endonucleases MboI e Sal3A, enquanto os segmentos supernumerários, pela AluI (Rodríguez Iñigo et al., 1993). Em D. genei, a técnica de FISH evidenciou a presença de duas famílias de DNA repetitivo, a DgT2 e DgA3, sendo a primeira representativa da família de sequências que formam principalmente os blocos de HC pericentroméricos e a segunda, os blocos distais, os quais correspondem aos segmentos supernumerários (Rodríguez Iñigo et al., 1996). Eyprepocnemis plorans é a espécie mais estudada em relação à ocorrência e variabilidade de heterocromatina extra em gafanhotos. Esta espécie apresenta ampla distribuição ao longo da Península Ibérica, norte da África, Cáucaso, Turquia, Turcomenistão, Irã e sudoeste da Arábia (Bakkali et al., 1999; Camacho et al., 2003). Mais de 50 tipos de Bs tem sido descritos nas populações analisadas. Essa diferenciação tem sido caracterizada com base no tamanho, morfologia, comportamento, frequência e padrão de bandeamento C (Henriques-Gil et al., 1984; López-Léon et al., 1993; Bakkali e Camacho, 2004). O tipo B 1 é o mais comum nas populações da Espanha e Marrocos, sendo considerado o B original nestas populações. No entanto, nas populações de Melilla, a forma mais frequente é a variante B 16 (Henriques-Gil et al., 1984; Bakkali et al., 1999; Henriques-Gil e Arana, 1990; Bakkali e Camacho, 2004). Eyprepocnemis plorans também apresenta polimorfismo para segmentos supernumarários em populações naturais da Espanha. O segmento mais frequente está presente na região proximal do bivalente P 11 (Perfectti et al., 2000). Quanto aos acridídeos Neotropicais, alguns gêneros foram analisados através do bandeamento C e da coloração com fluorocromos base-específicos. As espécies Schistocerca pallens e S. flavofasciata apresentaram um padrão similar de distribuição da heterocromatina. Em ambas, o bandeamento evidenciou HC pericentromérica em todos os cromossomos. Schistocerca flavofasciata exibiu ainda um grande bloco distal no bivalente 9. Em células mitóticas de embrião de S. pallens, foram vistos blocos de HC intersticiais em dois bivalentes autossômicos. Nesta espécie, a tríplice coloração CMA 3 /DA/DAPI revelou blocos CMA + 3 na 28

39 região intersticial dos bivalentes M 4, M 5 e M 6. Todos os cromossomos foram uniformemente corados pelo DAPI (Souza e Melo, 2007). Na subfamília Leptysminae, sete espécies foram caracterizadas em relação à HC. Belosacris coccineipes, Stenacris xanthochlora e Tucayaca parvula apresentaram apenas HC pericentromérica em todos os cromossomos do complemento (Loreto e Souza, 2000, Rocha et al., 2004). Em adição aos blocos pericentroméricos, blocos distais foram observados em dois cromossomos de tamanho médio em Cornops aquaticum e C. frenatum frenatum, e em dois cromossomos, um de tamanho médio e outro pequeno, em Stenopola dorsalis (Rocha et al., 2004). Leptysma argentina exibiu blocos pericentroméricos em todos os cromossomos, intersticiais em três bivalentes médios e um bloco C negativo no bivalente 10. Adicionalmente, a espécie foi polimorfica para segmentos heterocromáticos nos cromossomos pequenos e para presença de um cromossomo B (Bidau e Hasson, 1984). A coloração com fluorocromos base-específicos revelou marcação CMA + 3 na região pericentromérica nos bivalentes M 6, P 9 e P 11 de Belosacris coccineipes (Loreto e Souza, 2000). Cornops f. frenatum apresentou blocos CMA + 3 em todos os cromossomos. Cornops + aquaticum, por sua vez, mostrou blocos CMA 3 nos bivalentes M 3, M 5 e P 9. Em Stenopola dorsalis, a marcação foi identificada em cinco bivalentes médios. Stenacris xanthochlora e + Tucayaca parvula apresentaram blocos CMA 3 na região proximal do M 8 e nas regiões pericentroméricas dos bivalentes P 9 e P 10. Adicionalmente, T. parvula também apresentou marcação na região proximal do M 7. O DAPI corou uniformemente todos os cromossomos dos leptysmíneos analisados (Loreto e Souza, 2000; Rocha et al., 2004). Loreto et al. (2008b) observaram em Rhammatocerus brasiliensis (Gomphocerinae) blocos pericentroméricos em todos os cromossomos, incluindo o polimórfico cromossomo B. Contudo, as demais regiões deste cromossomo mostraram coloração intermediária entre a eucromatina dos cromossomos A e a HC observada pelo bandeamento C. As regiões pericentroméricas de todos os cromossomos, incluindo aquelas observadas no cromossomo B, exibiram blocos CMA + 3. O ommatolampíneo Abracris flavolineata, por sua vez, apresentou blocos pericentroméricos de HC estendendo-se por todo o braço curto de todos os cromossomos, exceto no bivalente M 7, o qual apresentou apenas HC pericentromérica (Cella e Ferreira, 1991). Na região Neotropical, o gênero Dichroplus merece destaque pelo amplo polimorfismo tanto para presença de cromossomos B como para segmentos supernumerários. Bidau (1987) observou a ocorrência de Bs mitoticamente instáveis em D. pratensis. Nesta espécie, o cromossomo B é um pequeno telocêntrico, parcialmente eucromático. O número de Bs variou de 0 a 4, e esta variação foi inter e intrafolicular. A presença de Bs apesar de não 29

40 afetar o comportamento meiótico normal de D. pratensis, acarretou no aumento da produção de macroespermátides, além de influenciar na frequência de quiasmas. Em D. elongatus, por sua vez, foi observado polimorfismo para cromossomos B e segmentos supernumerários nos bivalentes M 6, P 9 e P 10 em populações naturais da Argentina. O cromossomo B nesta espécie foi mitoticamente instável, podendo variar de 0 a 6 entre folículos testiculares. A ocorrência dessa heterocromatina extra afetou a frequência e distribuição de quiasmas e, adicionalmente, os cromossomos B tiveram influência sobre a fertilidade dos machos (Clemente et al., 1994; Remis e Vilardi, 2004; Remis et al., 2004; Rosetti et al., 2007). Em várias populações argentinas de Metaleptea brevicornis adspersa, a presença de um isocromossomo B estável foi observada (Bidau, 1986; Pastori e Bidau, 1994, Grieco e Bidau, 2000). No entanto, Grieco e Bidau (2000) identificaram a presença de dois cinetócoros separados por um material axial de comprimento considerável neste cromossomo. Foram propostas duas hipóteses alternativas para explicar a natureza dicêntrica do isocromossomo B: 1) a ocorrência de uma translocação de um braço inteiro entre dois cromossomos B acrocêntricos ancestrais e 2) produção de uma permuta tipo U entre as cromátides de um cromossomo B acrocêntrico, resultando em um isocromossomo B dicêntrico e um pequeno fragmento acrocêntrico Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) Considerações Gerais O nucléolo é uma estrutura presente nas células eucarióticas, responsável pela síntese de RNA ribossomal (RNAr) e biogênese dos ribossomos (Hadjiolov, 1985; Raska et al., 2004). Esta organela consiste de três partes principais: os centros fibrilares, o componente fibrilar denso e o componente granular. Os primeiros são áreas que contêm o DNAr e a RNA polimerase I; o segundo localiza-se ao redor do centros fibrilares; e o terceiro forma a camada mais externa do nucléolo e consiste de partículas pré-ribossomais (Olson et al., 2000; Sumner, 2003). A função primária da região nucleolar é, claramente, a síntese dos diferentes tipos de RNAr e o processamento destes em pré-ribossomos. Contudo, outras funções podem ser atribuídas a esta organela, tais como a inibição do pareamento de cromossomos homólogos e formação do complexo sinaptonêmico (John, 1990). Um importante papel do nucléolo 30

41 também tem sido descrito na regulação do ciclo celular. Três reguladores do ciclo, cuja atividade é regulada pelo sequestro no nucléolo, foram identificados: a Cdc 14, uma proteína fosfatase necessária para promoção da saída da mitose; a Mdm2, um inibidor da proteína supressora de tumor p53; e Pch2, uma proteína requerida para progressão do ciclo celular meiótico em resposta a defeitos na recombinação e sinapse cromossômica (Visintin e Amon, 2000; Sumner, 2003). As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) são segmentos específicos do cromossomo que contêm cópias dos principais genes de DNAr que codificam RNA ribossômico (Schwarzacher e Wachtler, 1983). Estes genes estão separados por espaçadores transcritos internos e externos. Os primeiros são compostos por unidades de repetição ricas em GC, motivo pelo qual as RONs, geralmente, apresentam marcações positivas quando submetidas a coloração com o fluorocromo Cromomicina A 3 (Torres et al., 1990; King, 1991). Quatro tipos de RNAr são conhecidos em eucariotas, o 5S; 5,8S; 18S e 28S. O produto desses genes associados a proteínas específicas é necessário na formação dos ribossomos. Os RNAs 5,8S; 18S e 28S ribossômicos são sintetizados pelos genes presentes nas RONs e estão organizados em tandem, dando origem a unidades que formam o RNAr 45S. O RNAr 5S, por sua vez, é codificado por genes, que normalmente estão localizados em sítios distintos das RONs, podendo ser encontrados em vários locos distribuídos em um ou mais cromossomos (Sumner, 2003; Raska et al., 2004). A análise das RONs pode proporcionar importantes informações sobre a organização cromossômica e função gênica, além de ser um bom marcador cromossômico para diferenciar espécies e até mesmo raças (Sumner, 1990). O estudo citológico das RONs teve um grande avanço, a partir da década de 70, com o surgimento da técnica de impregnação com nitrato de prata (AgNO 3 ) desenvolvida por Goodpasture e Bloom (1975). A alta eficiência desta técnica para identificação de RONs ativas é devido a grande afinidade dos sais de prata pelas proteínas não-histônicas associadas aos sítios de DNAr (Sumner, 1990; Trerè, 2000). A impregnação pelo nitrato de prata consiste em expor o material biológico a uma solução salina a 60ºC e, em seguida, submetê-lo a uma solução de nitrato de prata e incubá-lo em câmara úmida a C (Rufas et al., 1987). Essa técnica permite uma diferenciação entre os nucléolos ou remanescentes nucleolares, que se marcam em negro ou marrom escuro e a cromatina dos cromossomos que, por sua vez, se diferencia em amarelo (Sumner, 1990). Cada ponto marcado pela prata corresponde, ultraestruturalmente, ao centro fibrilar intimamente associado ao componente fibrilar denso (Derenzini et al., 1990; Trerè, 2000). 31

42 O uso da impregnação com AgNO 3 tem permitido identificar outros componentes cromossômicos, além dos nucléolos, em insetos. Em gafanhotos, esta técnica tem revelado diferentes estruturas, tais como cinetócoros, complexo sinaptonêmico, cores (esqueleto de proteínas não-histônicas) e centríolos adjuntos das espermátides (estrutura protéica que está unida ao núcleo e em volta do único centríolo presente em espermátides haplóides normais) (Rufas et al.,1983; 1987). A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda ribossômica combinada com a impregnação com nitrato de prata, tem permitido o estudo mais preciso das RONs quanto à variabilidade e atividade dos genes ribossomais. Apesar da correlação entre a marcação dos remanescentes nucleolares corados pelo AgNO 3 e a identificação dos mesmos com sondas de DNAr, os resultados obtidos entre as duas técnicas podem diferir. Isto ocorre porque a FISH localiza os sítios de DNAr independentes do seu estado de ativação, enquanto a impregnação com AgNO 3 permite localizar apenas as RONs com atividade transcricional na intérfase anterior (Sumner, 1990; Moscone et al., 1996) Regiões Organizadoras de Nucléolos em Gafanhotos Em gafanhotos, as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) apresentam grande variabilidade quanto à distribuição e número, podendo variar de um a cinco, embora a presença de duas RONs por células seja a condição mais frequente. Geralmente, os remanescentes nucleolares são facilmente localizados, através da impregnação com AgNO 3, durante o início da prófase meiótica (Rufas et al., 1985; Esponda et al., 1985). As RONs ainda podem ser classificadas de acordo com sua expressão em primárias, as quais estão ativas em todos os espermatócitos primários, e secundárias, apresentando atividade ocasional em algumas células do indivíduo (Fernández-Piqueras et al., 1983; Santos et al., 1990). Quanto à distribuição dentro do complemento cariotípico, três padrões básicos têm sido observados: 1) restritas ao cromossomo X, 2) restritas aos autossomos e 3) presentes tanto no cromossomo X quanto nos autossomos (Cabrero e Camacho, 1986b; Rocha et al., 1997; Souza et al., 1998; Loreto e Souza, 2000; Bridle et al., 2002; Rocha et al., 2004; Souza e Melo, 2007). Rufas et al. (1985) descreveram o padrão de distribuição de RONs em espermatócitos de 21 espécies de gafanhotos acridoideos provenientes da Espanha. Neste estudo foi observado uma grande variabilidade, tanto em relação ao número quanto à localização das RONs. Todavia, a maioria das espécies apresentou dois remanescentes nucleolares por células, localizados, preferencialmente, em autossomos de tamanho médio e pequeno. Apenas 32

43 Melanoplus frigidus, Eyprepocnemis plorans, Ramburiella hispanica, Chorthippus apicallis e Gomphocerus sibiricus apresentaram RONs localizadas tanto em autossomos como no cromossomo X. A presença de RONs localizadas em cromossomos megaméricos, também, pôde ser observada, como por exemplo, nas espécies Arcyptera microptera e A. tornosi. A espécie Eyprepocnemis plorans apresentou quatro RONs ativas, localizadas na região proximal dos bivalentes P 9, P 10 e P 11 e do univalente X (Cabrero et al., 1987). No entanto, o emprego da FISH com sonda de DNAr revelou a presença de sítios ribossomais na região pericentromérica de todos os cromossomos do complemento A e na metade distal do cromossomo B em diferentes populações da Espanha (López-Léon et al., 1994) e Marrocos (Bakkali et al., 2001). O maior número de sequências foi encontrado no cromossomo B, seguido pelos cromossomos X, P 9, P 10 e P 11, os quais correspondem as RONs primárias. Os demais exibiram pequenas marcações, correspondendo a um baixo número de cópias de DNAr. Os genes de RNAr presentes no cromossomo B foram inativos nas populações das duas localidades. Por outro lado, apenas RONs primárias foram ativas nos espécimes da Espanha, enquanto nas populações do Marrocos uma alta frequência de RONs secundárias ativas foram observadas. Esta ativação pode ser devida a diferenças genéticas e/ou ambientais, determinando as mudanças nos indivíduos do Marrocos (López-Léon et al., 1994; Bakkali et al., 2001). Uma análise comparativa através da técnica de FISH identificou diferenças no número de RONs em cinco espécies da subfamília Eyprepocnemidinae. A espécie Eyprepocnemis plorans, oriunda do Norte do Cáucaso, mostrou sítios de DNAr apenas nos pares P 9 e P 11. As demais apresentaram um número variável de bivalentes com sequências ribossomais: um em Thisoicetrinus pterostichus (P 9 ), dois em E. unicolor (P 9 e P 10 ) e Hetracris adspersa (M 8 e P 11 ) e três em Shirakiacris shirakii (P 9, P 10 e P 11 ). A impregnação com AgNO 3 detectou atividade em todos os sítios de DNAr nas cinco espécies analisadas (Cabrero et al., 2003). Cabrero e Camacho (1986b) realizaram uma análise do padrão de distribuição de RONs em 20 espécies de gonfoceríneos da região Paleártica. Cerca de dez espécies apresentaram RONs restritas aos autossomos, quatro restritas ao X e seis presentes tanto nos autossomos como no cromossomo X. Em 17 espécies com 2n=17, as RONs primárias foram identificadas preferencialmente nos cromossomos G 2, G 3 e no X, sendo a maioria localizada em região intersticial. RONs secundárias foram encontradas em nove espécies, localizando-se principalmente na região paracentromérica dos pares M 4, M 5, M 6 e P 8. Os cromossomos megaméricos de Truxalis nasuta (M 9 ) e Chorthippus apicalis (M 6 ) mostraram RONs ativas primárias, enquanto que nas espécies Euchorthippus pulvinatus, Omocestus bolivari, O. 33

44 llorenteae, Chorthippus binotatus e C. vagans, estes cromossomos exibiram RONs secundárias. O uso da FISH em Chorthippus brunneus e C. jacobsi revelou sítios de DNAr associados a HC dos pares G 2 e G 3 nas duas espécies. Adicionalmente, C. brunneus apresentou um sítio de DNAr extra na extremidade distal do cromossomo X. A análise destes sítios ribossomais, através da impregnação com AgNO 3, mostrou RONs ativas apenas na região proximal dos bivalentes G 2 e G 3. Duas hipóteses foram levantadas para explicar a inatividade das sequências de DNAr no cromossomo X de C. brunneus: 1) a ocorrência de silenciamento de uma RON ancestral no cromossomo X e 2) a transposição de genes ribossomais não funcionais de autossomos para o cromossomo X. Todos os sítios de DNAr (ativos ou não) foram CMA + 3 positivos (Bridle et al., 2002). Estudos semelhantes também detectaram a presença de remanescentes nucleolares nos pares G 2 e G 3 em Chorthippus parallelus e C. erythropus, tanto pela impregnação com AgNO 3 quanto pela técnica de FISH. Contudo, C. parallelus, assim como C. brunneus, exibiu sítios de DNAr na região distal do cromossomo X (Gosálvez et al., 1988; Bella et al., 1990b; 2007). Loreto et al. (2008a) descreveram o padrão de distribuição de RONs em cinco espécies de gonfoceríneos Neotropicais. Em Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R. pictus e Amblytropidia sp. foram detectadas RONs ativas na região pericentromérica do bivalente P 9. Rhammatocerus brasiliensis, por sua vez, exibiu adicionalmente RONs ativas nos autossomos M 4 e M 6. A técnica de FISH confirmou as RONs ativas visualizadas pelo AgNO 3 em todas as espécies, não identificando nenhum sítio ribossomal adicional. A presença de RONs em cromossomo megamérico também tem sido detectada em algumas espécies. Em Oedipoda fuscocincta, o megamérico M 9 apresentou uma constrição secundária, na qual foi identificada a única RON presente em indivíduos padrões. No entanto, em heterozigotos para ocorrência de segmentos supernumerários no cromossomo P 10, a impregnação com AgNO 3 revelou a presença de uma RON extra neste segmento. Acredita-se que esta heterocromatina extra tenha sido originada a partir da translocação de um segmento do par P 9 para região distal do P 10, uma vez que só existe uma RON ativa nesta espécie (Camacho et al., 1986). Oedipoda charpentieri, por sua vez, apresentou dois remanescentes nucleolares associados à HC intersticial e distal do cromossomo megamérico M 6 (Navas- Castillo et al., 1987). Arcyptera tornosi exibiu duas RONs, uma localizada na HC pericêntrica do par M 3 e a outra, na HC distal do bivalente megamérico M 9. O uso de fluorocromos baseespecíficos identificou blocos CMA + 3 e DAPI + nas duas RONs presentes nesta espécie (Gosálvez et al., 1987). Metaleptea brevicornis adspersa também apresentou uma RON ativa no cromossomo megamérico M 9 (Pastori e Bidau, 1994). 34

45 Rocha et al. (2004) identificaram a presença de três RONs nos leptysmíneos Cornops aquaticum (M 3, M 5 e P 9 ), C. frenatum frenatum (M 3, M 5 e P 9 ), Stenacris xanthochlora (M 8, P 9 e P 10 ) e Tucayaca parvula (M 8, P 9 e P 10 ), e apenas duas RONs em Stenopola dorsalis (M 5 e M 6 ). Os remanescentes nucleolares de todas as espécies foram CMA + 3. Belosacris coccineipes, por sua vez, apresentou três RONs localizadas nos bivalentes P 9, P 10 e P 11, as quais também apresentaram riqueza em pares de bases GC (Loreto e Souza, 2000). Em Schistocerca gregaria, uma espécie com ampla distribuição no Velho Mundo, a impregnação com AgNO 3 revelou RONs localizadas distalmente no cromossomo M 6 e proximalmente, no P 9 (Rufas e Gosálvez, 1982). Contudo, as espécies americanas S. flavofasciata e S. pallens apresentaram uma RON no bivalente M 5 e duas nos bivalentes M 5 e M 6, respectivamente, sendo todas localizadas nas regiões intersticiais. A coloração sequencial AgNO 3 /CMA 3 /DA/DAPI mostrou que HC associada a RON foi CMA + 3 em S. pallens. Adicionalmente, a FISH com sonda de DNAr 45S confirmou a presença de sítios de DNAr nos bivalentes M 5 e M 6 nesta espécie (Souza e Melo, 2007). Em Stauroderus scalaris, a impregnação com AgNO 3 identificou a presença de uma única RON ativa na região pericentromérica do autossomo G 3 (Cabrero e Camacho, 1986b; López-Léon et al., 1999). Todavia, a análise com FISH, utilizando sonda de DNAr de Triticum, revelou um caso extremo nesta espécie. S. scalaris apresentou sítios de DNAr na heterocromatina associada à região pericentromérica de todos os cromossomos do complemento. Embora, a marcação mais intensa tenha correspondido à única RON localizada no bivalente G 3. A inatividade da maioria das sequências ribossomais sugere a presença de um alto número de cópias de genes de RNAr inativas nos blocos de HC pericentroméricos. Foi proposto que esta inatividade baseia-se na hipótese que a ativação das RONs é realizada sequencialmente em ordem de tamanho. Neste caso, o cromossomo G 3 teria a capacidade de fornecer RNAr suficientes para demanda celular nesta espécie (López-Léon et al., 1999). A análise de distribuição das RONs em representantes da família Romaleidae está restrita a poucos gêneros. Radacridium nordestinum e R. mariajoseae apresentaram apenas uma RON, mas diferiram quanto aos cromossomos portadores. Na primeira espécie o remanescente nucleolar está localizado na região intersticial do par G 2, e na segunda, na região proximal do cromossomo X. Os centríolos adjuntos, cores e os cinetócoros também foram marcados através da impregnação com AgNO 3 nas duas espécies (Rocha et al., 1997). Xyleus angulatus apresentou três RONs localizadas na região proximal dos cromossomos G 3, M 4 e X. As RONs nesta espécie correspondem a áreas de heterocromatina CMA + 3. A utilização da técnica de FISH com sonda pta71 de trigo (Triticum aestivum) revelou marcações nas regiões proximais dos pares G 3 e M 4 e no cromossomo X, coincidindo com as 35

46 RONs identificadas pelo AgNO 3 (Souza et al., 1998). Phaeoparia megacephala apresentou uma RON na região proximal do bivalente M 6, a qual foi CMA + 3 (Pereira e Souza, 2000). Em Xestotrachelus robustus, o uso da impregnação com AgNO 3 e FISH com sonda de DNAr 45S de Arabidopsis thaliana detectaram a presença de apenas uma RON na região pericentromérica do bivalente M 5. Um bloco CMA + 3 também foi identificado nesta região (Souza et al., 2003). As espécies Chromacris nuptialis e C. speciosa, por sua vez, apresentaram uma RON localizada no bivalente M 6. A FISH confirmou a presença de sítios ribossomais apenas no M 6 e revelou localização exata dos mesmos, sendo localizado na região pericentromérica em C. nuptialis e na região proximal em C. speciosa (Loreto et al., 2005). 36

47 OBJETIVOS

48 2. Objetivos 2.1. Objetivo Geral Realizar uma análise citogenética-comparativa nas espécies de gafanhotos Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus (Acrididae: Melanoplinae) por meio de diferentes técnicas citogenéticas Objetivos Específicos 1. Descrever o número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de determinação sexual de Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus; 2. Analisar comparativamente os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) e sua variabilidade; 3. Caracterizar a HC quanto à composição de pares de bases através do uso dos fluorocromos base-específicos Cromomicina A 3 (CMA 3 ) e 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI); 4. Identificar as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) através da impregnação com nitrato de prata (AgNO 3 ) e por hibridização in situ fluorescente (FISH). 38

49 MATERIAIS E MÉTODOS

50 3. Materiais e Métodos 3.1. Materiais Neste trabalho foram estudados cromossomos meióticos obtidos de 76 espécimes machos de melanoplíneos: 45 indivíduos de Baeacris punctulatus (Thunberg, 1824) e 31 de Dichroplus fuscus (Thunberg, 1815). Os gafanhotos foram coletados com auxílio de rede entomológica em diferentes localidades dos Estados de Pernambuco e da Bahia (Tabela 2). A identificação taxonômica das espécies analisadas foi realizada pelo professor e entomólogo Carlos Salvador Carbonell, da Universidade de La Republica, Montevidéu, Uruguai. Todos os exemplares foram depositados na coleção entomológica do Laboratório de Genética e Citogenética Animal, do Departamento de Genética, CCB, UFPE. Tabela 2. Número de espécimes estudados de Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus, locais de coleta e coordenadas geográficas. Número de espécimes Locais de coleta Coordenadas B. punctulatus D. fuscus 3 10 Bezerros/PE 8º14 0 S: 35º47 49 W 1 0 Bonito/PE 8º28 13 S: 35º43 43 W 5 11 Caruaru/PE 8º17 0 S: 35º58 34 W 6 0 Goiana/PE 7º33 38 S: 35º0 9 W 3 0 Igarassu/PE 7º50 31 S: 34º54 23 W 1 0 Itamaracá/PE 7º44 52 S: 34º49 32 W 11 2 Mucugê/BA 13º0 19 S: 41º22 15 W 5 2 Rio de Contas/BA 13º34 44 S: 41º48 41 W 10 4 Saloá/PE 8º58 33 S: 36º41 15 W 0 2 Vitória de Santo Antão/PE 8º7 5 S: 35º17 29 W 3.2. Métodos Processamento dos Espécimes Os exemplares machos de B. punctulatus e D. fuscus foram sacrificados com éter para retirada dos testículos. Este material foi fixado em solução Carnoy (etanol: ácido acético 3:1), identificado e acondicionado em freezer. 40

51 Preparações Citológicas As preparações citológicas foram realizadas empregando a técnica clássica de esmagamento de folículos testiculares, que consiste em fragmentar folículos em uma gota de ácido acético a 45% e esmagá-los entre a lâmina e lamínula. As lâminas a serem utilizadas nas diferentes técnicas de análise citogenética, com exceção da coloração convencional, foram mergulhadas em nitrogênio líquido para retirada das lamínulas e envelhecidas três dias à temperatura ambiente antes de serem submetidas às técnicas de bandeamento Coloração Convencional Para coloração convencional foi usado o corante orceína lacto-acética a 2%. Neste caso, o corante foi adicionado à lâmina antes do esmagamento dos folículos testiculares. As lâminas foram vedadas com esmalte para evitar a evaporação do corante. Este método foi usado para determinar o número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de determinação do sexo de cada espécie estudada Bandeamento C O bandeamento C foi realizado segundo Sumner (1972), com algumas modificações em relação ao tempo de exposição às diferentes soluções. As lâminas foram pré-tratadas com uma solução ácida (HCl 0,2 N) por 30 minutos em temperatura ambiente e depois lavadas com água destilada. Em seguida, mergulhadas em solução saturada de hidróxido de bário (Ba(OH) 2 ) a 60 C por um minuto. Após lavagem em HCl (0,2 N) e em água destilada para a retirada de todo resíduo de Ba(OH) 2, as lâminas foram mergulhadas em solução salina (2 x SSC) a 60 C por 45 minutos e novamente lavadas com água destilada. A coloração foi realizada com solução de Giemsa a 5% diluída em tampão fosfato ph 6,8 por 5 minutos. Na seqüência, as lâminas foram lavadas com água destilada e montadas com bálsamo do Canadá Coloração CMA 3 /DA/DAPI A coloração com fluorocromos base-específicos foi realizada segundo o método descrito por Schweizer (1976), com pequenas modificações. Duas gotas da solução de CMA 3 (0,5 mg/ml) foram colocadas sobre cada lâmina. O material foi coberto com uma lamínula e incubado em uma caixa fechada por 40 minutos. Após este período a lâmina foi lavada com 41

52 água destilada. Em seguida, foram adicionadas duas gotas da solução de Distamicina A (0,1 mg/ml) e o material foi coberto com lamínula. A lâmina ficou incubada por 30 minutos e depois foi lavada. Por fim, foram adicionadas duas gotas da solução de DAPI (2 µg/ml) e novamente a lâmina foi coberta com lamínula, incubada por 20 minutos e depois lavada. Após as colorações, a lâmina foi montada com meio de montagem com glicerol/tampão Macllvaine/MgCl 2. Todo o procedimento foi realizado no escuro e as lâminas acondicionadas em caixa fechada, até o momento de serem analisadas em microscópio de fluorescência Impregnação com Nitrato de Prata (AgNO 3 ) Para impregnação com nitrato de prata (AgNO 3 ) foi utilizado o método desenvolvido por Rufas et al (1987), com pequenas modificações. As lâminas foram pré-tratadas com solução salina (2 x SSC) a 60 C por 10 minutos. Em seguida, foram submetidas a uma solução de nitrato de prata (1 g/ml) com ph 3,0 ajustado com ácido fórmico e incubadas a 70 em câmara úmida pré-aquecida por três minutos. Depois de lavadas com água destilatada, as lâminas foram montadas com bálsamo do Canadá Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia de Moscone et al. (1996), com pequenas modificações. Os sítios de DNAr 45S foram localizados usando a sonda R2, um fragmento de 6.5 kb da unidade repetitiva do DNAr 18S- 5,8S-25S de Arabidopsis thaliana. A sonda foi marcada por nick translation (Invitrogen) com digoxigenina-11-dutp (Roche). As lâminas, previamente preparadas e armazenadas no freezer, foram fixadas em Carnoy 3:1 por 15 minutos, desidratadas em etanol 70% e 100%, por 5 minutos cada e secas na estufa a 60 ºC por 30 minutos. Em seguida, foram pré-tratadas com RNAse a 37 ºC por 1 hora, lavadas em 2 x SSC, tratadas com proteinase K por 20 minutos, fixadas em paraformaldeído por 10 minutos, desidratadas em etanol 70% e 100% por 5 minutos cada e deixadas para secar por pelo menos 90 minutos. A mistura de hibridização continha 50% de formamida (v/v), 5% de dextran sulfato (w/v), 2 x SSC de 2 5 ng/µl de cada sonda. Cada lâmina recebeu 10 µl da mistura de hibridização e foi coberta com uma lamínula. O conjunto sonda-cromossomo foi desnaturado a 75 ºC por 5 minutos e colocado para hibridizar a 37 ºC por 18 horas. Os banhos pós-hibridização foram realizados em 2 x SSC (2 vezes de 5 minutos cada) e 0,1 x SSC (2 vezes de 5 minutos cada). A sonda foi detectada com anti-digoxigenina conjugada com FITC produzido em ovelha (Roche) e o sinal 42

53 amplificado com anticorpo contra anticorpos de ovelha, produzido em coelho, conjugado com FITC (Dako). Todas as preparações foram contra-coradas e montadas com 2 µg/ml de DAPI em Vectashield (Vector) Documentação Fotográfica A captura de imagens das células meióticas foi realizada com uma câmera digital Olympus D-535 ZOOM acoplada a ocular do microscópio Leica WILD MPS 52. Para a coloração com fluorocromos, foi utilizado o microscópio Leica DMRB. As imagens foram capturadas com o uso do programa IM50. Para a FISH, por sua vez, foi utilizado um fotomicroscópio de epifluorescência Leica DMLB, acoplado com uma câmera de vídeo Cohu. As imagens das melhores células foram capturadas usando programa QFISH da Leica. Todas as pranchas foram montadas com o auxílio do programa Corel Photo-Paint

54 RESULTADOS

55 4. Resultados 4.1. Baeacris punctulatus A espécie Baeacris punctulatus apresentou número diplóide 2n=23 e mecanismo sexual do tipo X0. Todos os cromossomos do complemento exibiram morfologia acrocêntrica e foram agrupados em três pares grandes (G 1 G 3 ), cinco médios (M 4 M 8 ) e três pequenos (P 9 P 11 ). O cromossomo X apresentou tamanho médio (Figura 1). Este cromossomo mostrou heteropicnose positiva durante o início da meiose (Figura 1a, b), heteropicnose negativa em metáfase I (Figura 1c) e isopicnose em metáfase II (Figura 1d). O bivalente P 10 também apresentou blocos heteropicnóticos positivos durante a prófase (Figura 1b). A análise da heterocromatina constitutiva (HC), através do bandeamento C, revelou pequenos blocos pericentroméricos em todos os autossomos do complemento, com exceção do bivalente 10, o qual apresentou um grande bloco de HC nesta região. Este padrão encontrado no P 10 corresponde ao bloco heteropicnótico positivo observado durante o início da prófase I. O cromossomo X também apresentou um pequeno bloco na região pericentromérica e adicionalmente, assim como o bivalente M 4, apresentou um pequeno bloco terminal. O bivalente G 2 exibiu um bloco proximal (Figura 2a, b). A tríplice-coloração CMA 3 /DA/DAPI identificou diminutos blocos CMA 3 positivos (CMA + 3 ) na região pericentromérica de todos os autossomos e na região proximal do bivalente G 2, os quais corresponderam aos blocos visualizados pelo bandeamento C. O bloco de HC pericentromérico presente no cromossomo X também foi CMA + 3. (Figura 2c). Por outro lado, os blocos terminais de HC dos cromossomos M 4 e X foram neutros para o CMA 3. O tamanho das marcações fluorescentes de todos os cromossomos foi bem menor quando comparados aos blocos de HC. Adicionalmente, um cromossomo de tamanho médio apresentou um bloco intersticial CMA + 3, o qual não coincidiu com nenhum bloco detectado pelo bandeamento C (Figura 2c). A coloração com DAPI mostrou-se homogênea em todos os cromossomos do complemento (Figura 2d). Baeacris punctulatus apresentou um padrão de distribuição de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) bastante diferenciado. Os remanescentes nucleolares foram observados em cinco bivalentes autossômicos e no cromossomo X. A impregnação com AgNO 3 permitiu detectar, em diferentes subfases da prófase meiótica (leptóteno diplóteno), uma variação na atividade das RONs (uma a seis) nesta espécie (Figura 3). Para avaliar a frequência de atividade das RONs foram analisadas 568 células, marcadas pelo AgNO 3, de diferentes 45

56 indivíduos. Para esta contagem foi levada em consideração a presença visível do cromossomo X. A Tabela 3 mostra as frequências total e parcial de atividade das RONs. O número mais frequente observado foi de três RONs por célula (34,33%), seguido por duas e quatro RONs (25,35%). A presença de uma ou seis RONs ativas foi bastante baixa, compreendendo 1,76 e 1,59%, respectivamente. A identificação exata dos autossomos portadores das RONs não foi possível através da análise com impregnação com AgNO 3, uma vez que a maioria das células analisadas estavam em estágios meióticos bastante iniciais. No entanto, nos diplótenos analisados foi visto que os remanescentes nucleolares estavam presentes em cromossomos de tamanho grandes e/ou médios. O cromossomo X pode ou não estar envolvido no conjunto de RONs ativas (Figuras 3 e 4; Tabela 3). Das 568 células analisadas, 365 mostraram atividade do cromossomo X, o que correspondeu à cerca de 64%. Foi observado que em 100% das células com apenas um remanescente nucleolar, este sempre correspondia a um bivalente autossômico. Das 144 células com 2 RONs 59,03% apresentaram RONs ativas apenas em autossomos e 40,97% em autossomos e no cromossomo X. A partir de três RONs ativas, a frequência de atividade apenas em autossomos diminui (33,85%) e aumenta de forma significativa a atividade do X (66,15%), chegando a atingir 100% das células com seis RONs ativas (Figura 4; Tabela 3). A técnica de FISH permitiu a identificação de seis sítios de DNAr, sendo localizados nas regiões pericentroméricas dos três bivalentes grandes (G 1 G 3 ), em dois bivalentes de tamanho médio e no cromossomo X. Os sinais de hibridização apresentaram pequenas diferenças em relação ao tamanho, sendo maiores nos cromossomos grandes e menores nos bivalentes médios e no X (Figura 5). O número de sítios ribossômicos identificados pela FISH coincidiu com os remanescentes nucleolares marcados pela impregnação com AgNO 3. Tabela 3. Comparação entre as frequências de atividade das RONs em Baeacris punctulatus. Nº de Nº de cél. RONs analisadas ativas Freq. de (%) total RONs N de cel. com o X ativo Freq. de RONs apenas autossomos (%) para cada conjunto de RONs ativas , , , , , , , , , , Total

57 4.2. Dichroplus fuscus A espécie Dichroplus fuscus apresentou número diplóide 2n=19 e mecanismo sexual do tipo X0. Os cromossomos foram agrupados em dois pares grandes (G 1 G 2 ), quatro médios (M 3 M 6 ) e três pequenos (P 7 P 9 ). O cromossomo X foi considerado um dos menores médios. Os pares G 1 e G 2 mostraram morfologia meta-submetacêntrica e os demais, acrocêntrica (Figura 6). O cromossomo X apresentou heteropicnose positiva durante o início da meiose (Figura 6a), heteropicnose negativa em diacinese e metáfase I (Figura 6b, c) e isopicnose em fases adiantadas (Figura 6d). Adicionalmente, blocos heteropicnóticos positivos foram visualizados em alguns bivalentes autossômicos. Durante o ciclo meiótico, também foi observado comportamento megamérico do bivalente P 9 (Figura 6a). O bandeamento C revelou grandes blocos pericentroméricos de heterocromatina constitutiva (HC) nos bivalentes de tamanho médio e pequeno, sendo diminutos no bivalente G 2. Estes bivalentes também apresentaram pequenos blocos terminais adicionais, com exceção do bivalente G 2, o qual apresentou um grande bloco. O bivalente G 1, por sua vez, não apresentou nenhum bloco de HC detectável pelo bandeamento C. O cromossomo X apresentou um grande bloco na região pericentromérica e um pequeno na região terminal. O cromossomo megamérico P 9 foi quase inteiramente heterocromático, mostrando grandes blocos pericentromérico e terminal (Figura 7a, b). Este padrão, assim como o encontrado nos demais bivalentes, corresponde aos blocos heteropicnóticos observados durante a prófase I da meiose. A tríplice-coloração CMA 3 /DA/DAPI evidenciou blocos CMA 3 positivos (CMA + 3 ) na HC pericentromérica dos bivalentes médios e pequenos e do cromossomo X, coincidindo com o padrão detectado pelo bandeamento C. Os blocos terminais dos pares G 2, M 5, M 6 e P 7 foram CMA + 3, enquanto que os blocos dos pares M 3, M 4, P 8, P 9 e o do cromossomo X foram neutros (Figura 7c). Todos os blocos CMA + 3 foram DAPI negativo, indicando ausência de riqueza de pares de base AT nesta espécie (Figura 7d). O bivalente G 1 não exibiu nenhuma marcação fluorescente (Figura 7c, d). A impregnação com AgNO 3 evidenciou a presença de duas regiões organizadoras de nucléolos (RONs), localizadas nos bivalentes M 3 e P 7 (Figura 8a, b). Adicionalmente, o AgNO 3 marcou os cinetócoros e as regiões de HC em todos os cromossomos (Figura 8b). Entretanto, o tamanho dos blocos marcados pelo AgNO 3 foi menor quando comparado com aqueles marcados pelo bandeamento C. O uso da hibridização in situ fluorescente (FISH) permitiu detectar sítios de DNAr na região pericentromérica do bivalente M 3 e na região 47

58 proximal do bivalente P 7, coincidindo com a marcação observada através da impregnação com AgNO 3 (Figura 8c, d). 48

59 Figura 1. Células meióticas de Baeacris punctulatus coradas convencionalmente. (a) Paquíteno; (b) diplóteno; (c) metáfase I; (d) metáfase II. Barra = 5 µm. 49

60 Figura 2. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração CMA 3 /DA/DAPI (c, d) em cromossomos meióticos de Baeacris punctulatus. (a, b) Diplótenos; (c, d) paquítenos. As cabeças de seta em c apontam os diminutos blocos CMA 3 + pericentroméricos. A seta indica o bloco intersticial adicional. Barra = 5 µm. 50

61 Figura 3. Diferentes marcações das RONs ativas detectada pela impregnação com AgNO 3 em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, c, d) Zigótenos; (b) diplóteno; (e, f) paquítenos iniciais. Barra = 5 µm. 51

62 Autossomos Autossomos + X 120 Freqüência de atividade (%) Número de RONs ativas Figura 4. Comparação entre as frequências de atividade das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) localizadas apenas em autossomos e em autossomos e no cromossomo X em Baeacris punctulatus. 52

63 Figura 5. FISH com sonda de DNAr 45S em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, b) Paquíteno; (c, d) metáfase II. Em a e c coloração com DAPI. Barra = 5 µm. 53

64 Figura 6. Coloração convencional em células meióticas de Dichroplus fuscus. (a) Paquíteno; (b) diacinese; (c) metáfase I; (d) anáfase I. Barra = 5 µm. 54

65 Figura 7. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração (CMA 3 /DA/DAPI) (c, d) em células paquitênicas de Dichroplus fuscus. Em c paquíteno corado com CMA 3 e em d paquíteno corado com DAPI. As setas indicam os diminutos blocos pericentroméricos de HC no bivalente G 2. Barra = 5 µm. 55

66 Figura 8. Cromossomos meióticos de Dichroplus fuscus após impregnação com AgNO 3 (a, b) e FISH com sonda de DNAr 45S (c, d). (a) Zigóteno; (b, c, d) paquíteno. Em c célula corada com DAPI. As setas indicam os sítios de DNAr 45S. Barra = 5 µm. 56

67 DISCUSSÃO

68 5. Discussão De acordo com análise cromossômica convencional Baeacris punctulatus apresentou número diplóide de 2n=23,X0 e Dichroplus fuscus, 2n=19,X0. O padrão cariotípico observado em B. punctulatus está de acordo com o que tem sido descrito para a maioria das espécies de Acridoidea (Mesa et al., 1982). A redução do número cromossômico em D. fuscus decorre provavelmente de duas fusões cêntricas entre acrocêntricos ancestrais resultando em dois pares de cromossomos com dois braços (meta-submetacêntricos). Reduções do número diplóide também foram descritas para outras espécies do gênero Dichroplus, o qual tem sido caracterizado por ser o mais diverso cariotipicamente dentro da subfamília Melanoplinae. No entanto, apenas em D. pratensis foi descrito o cariótipo 2n=19,X0 (Mesa et al., 1982; Colombo et al., 2005). Dichroplus representa um gênero com ampla diversidade cariotípica variando de 2n=23, observado em D. elongatus, até 2n=8, em D. silveiraguidoi. Fusões cêntricas representam os principais mecanismos responsáveis pela redução do número diplóide neste grupo. Por outro lado, muitos cariótipos derivados conservam o número de braços cromossômicos, em decorrência da formação de cromossomos meta-submetacêntricos. (Bidau, 1990, 1991; Martí e Bidau, 2001; Bidau e Martí, 2004; Colombo et al., 2005). A espécie D. silveiraguidoi é uma exceção dentro do gênero, uma vez que o número diplóide e número de braços cromossômicos foram bastante reduzidos (Cardoso et al., 1974; Saéz e Pérez-Mosquera, 1977). O padrão pericentromérico, observado em B. punctulatus e D. fuscus, é considerado o mais comum entre as espécies de Acrididae. Blocos proximais e terminais foram observados em ambas as espécies estudadas, o que também ocorre com menor frequência em alguns acridídeos (King e John, 1980; Cabrero e Camacho, 1986a; Rocha et al., 2004; Loreto et al., 2005). Por outro lado, D. fuscus exibiu blocos de HC bem maiores quando comparados com aqueles observados em B. punctulatus. A ausência ou diminuição da HC pericentromérica nos cromossomos G 1 e G 2, respectivamente, de D. fuscus, pode estar associada à perda de heterocromatina, decorrente de rearranjos do tipo fusões cêntricas, entre os maiores cromossomos do complemento, envolvidas na origem desses cromossomos com dois braços. Rocha et al. (1997) também observaram a presença de cromossomos sem blocos de HC em Radacridium mariajoseae, que apresentou HC restrita apenas a seis cromossomos. Em D. fuscus, o bivalente P 9 correspondeu a um cromossomo megamérico. Esse tipo cromossômico tem sido descrito em diferentes espécies de gafanhotos (Camacho et al., 1986; Rocha et al., 1997; Loreto et al., 2008a). O padrão de bandeamento C em D. fuscus revelou 58

69 grandes blocos pericentromérico e terminal de HC no bivalente P 9. Esta grande quantidade de HC também tem sido observada em megaméricos de outras espécies, tais como Aiolopus thalassinus, Perala niridis, Oedipoda charpentieri e Radacridium mariajoseae (King e John, 1980; Navas-Castillo et al., 1987; Rocha et al., 1997). Apesar da presença do cromossomo megamérico ter sido relatada para vários acridoideos, ainda não se sabe qual o seu papel biológico. No entanto, devido à similaridade deste marcador com o cromossomo X (em relação à transcrição, replicação e alociclia), acredita-se que sua função seja similar a inativação do cromossomo X durante a espermatogênese, sendo o megamérico um portador de genes cuja inatividade durante a meiose seja necessária em algum processo particular (Hewitt, 1979). A coloração CMA 3 /DA/DAPI tem revelado uma ampla heterogeneidade na composição de pares de bases da HC entre os acridoideos. Vários padrões têm sido descritos para este grupo, contudo, o padrão CMA + 3 apresenta predominância entre as espécies (John et al., 1985; Souza et al., 2003; Rocha et al., 2004; Loreto et al., 2005; 2008b). As duas espécies analisadas neste trabalho mostraram diferenças quanto à composição da HC. Em B. + punctulatus, os blocos CMA 3 foram muito pequenos e com localização pericentromérica em todos os cromossomos e na região proximal do bivalente G 2, indicando riqueza de pares de bases GC na heterocromatina dessa espécie, diferente dos blocos terminais do M 4 e do X, que foram neutros para o CMA 3. Por outro lado, a presença de um grande bloco CMA + 3 na região intersticial de um bivalente médio, não coincidindo com nenhum bloco positivo para o bandeamento C, sugere a ocorrência de uma classe de DNA distinta nesta região. Diferente de B. punctulatus, D. fuscus mostrou um padrão de qualificação da HC no qual grandes blocos foram CMA + 3. Esse padrão correspondeu aos blocos visualizados pelo bandeamento C indicando ampla riqueza de pares de base GC na heterocromatina dessa espécie. Padrões semelhantes foram descritos para os romaleídeos Xyleus angulatus, Phaeoparia megacephala e Xestrotrachelus robustus (Souza et al., 1998; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003). A presença de HC neutra nas duas espécies estudadas também tem sido decrita para outros acridídeos, como por exemplo, em Belosacris coccineipes, Cornops aquaticum e Stenopola dorsalis e Schistocerca pallens (Loreto e Souza, 2000; Rocha et al., 2004; Souza e Melo, 2007). Em gafanhotos, especialmente em espécies representantes das famílias Romaleidae e Acrididae, as RONs estão frequentemente localizadas em um ou dois pares de autossomos de tamanho médio e pequeno (Rufas et al., 1985; Cabrero e Camacho, 1986b; Rocha et al., 2004; Loreto et al., 2005). Neste estudo, as espécies analisadas diferiram tanto em relação ao número quanto a distribuição e localização das RONs. Dichroplus fuscus mostrou duas RONs 59

70 com localização nos pares M 3 e P 7, padrão comum em diferentes espécies de Acridoidea. Em contraste, B. punctulatus apresentou RONs ativas em cinco pares de autossomos e no cromossomo X. Padrão de distribuição de RONs envolvendo mais de dois pares cromossômicos é menos frequente nessa superfamília. São exemplos de espécies com 5 RONs Eyprepocnemis plorans, com 4 RONs Gomphocerus sibiricus e Heteracris litoralis e com 3 RONs Rhammatocerus brasiliensis (Rufas et al., 1985; Loreto et al., 2008a). A impregnação com nitrato de prata (AgNO 3 ) tem revelado a ocorrência de variação na atividade de transcrição de sítios de DNAr em vários organismos. Em B. punctulatus ocorreu uma ampla variação na frequência de atividade das RONs, de uma até seis RONs ativas por célula. A frequência de atividade de três foi a condição mais comum dentre as células analisadas correspondendo a 34,33%. Contudo, o mecanismo exato pelo qual a atividade das RONs é reprimida não está totalmente esclarecido, embora a metilação pareça desempenhar um importante papel neste processo (Zurita et al., 1998; Bakkali et al., 2001; Guillén et al., 2004). A comparação em B. punctulatus entre a frequência da atividade das RONs localizadas apenas em autossomos com aquelas presentes tanto em autossomos como no cromossomo X, sugere que a atividade dos genes para DNAr do cromossomo X parece ter correlação com o aumento do número de RONs autossômicas ativas. A presença de atividade nucleolar do X foi observada em células com no mínimo duas RONs ativas, tendo um aumento significativo da frequência de atividade deste cromossomo a partir de três RONs ativas. Isto indica que em células com apenas uma ou duas RONs, a atividade do X não se faz tão necessária. Segundo Zurita et al. (1998), a variabilidade na atividade das RONs segue uma hierarquia de tamanho, ou seja, as RONs que possuem maior número de genes de RNAr teriam uma maior habilidade para recrutar os fatores de transcrição. Para estes autores, a partir do momento que os primeiros fatores de transcrição vão se ligando, eles vão ativando de maneira cooperativa os sítios adjacentes. Desta forma, a ativação de um determinado número de RONs depende da necessidade celular no dado momento, sugerindo a existência de um controle gênico para cada ciclo celular. Em B. punctulatus, a FISH permitiu identificar os sítios de DNAr nos bivalentes G 1, G 2 e G 3, em dois bivalentes médios e no cromossomo X. Este padrão coincidiu com o número máximo de RONs detectadas pelo AgNO 3 e representa um dado inédito dentro de Acridoidea da região Neotropical, tanto no que se refere a quantidade de cromossomos portadores de RONs como a frequência de atividade dessas RONs. As espécies parleárticas Stauroderus scalaris e Eyprepocnemis plorans (algumas populações da Espanha e do Marrocos) 60

71 apresentaram sítios de DNAr em todos os cromossomos do complemento. No entanto, a atividade das RONs nessas espécies encontraram-se restritas a apenas um par cromossômico (par 3) em S. scalaris e a quatro cromossomos (pares 9, 10, 11 e cromossomo X) em E. plorans (López-Léon et al., 1994; 1999; Bakkali et al., 2001). Esta situação difere da encontrada em B. punctulatus, uma vez que, todos os sítios mostraram-se ativos, mas com frequência de atividade variável. Por outro lado, o grande número de sítios de DNAr encontrado pode ser explicado pela presença de sequências repetitivas que compõem os genes de DNAr associados às regiões de heterocromatina, as quais são áreas mais suscetíveis a rearranjos (Sánchez-Gea et al., 2000). Em D. fuscus, por sua vez, a FISH também identificou os cromossomos portadores das RONs, correspondendo ao bivalente M 3 e ao bivalente P 7. Esse padrão é considerado comum dentro de Acridoidea (Cabrero et al., 2003; Rocha et al., 2004; Souza e Melo, 2007). A marcação dos cinetócoros pelo AgNO 3 em D. fuscus, também, é comum para algumas espécies de gafanhotos, tais como Chorthipus jucundus, Arcyptera microptera (Rufas et al., 1983), A. fusca (Suja et al., 1991), Radacridium nordestinum, R. mariajoseae (Rocha et al., 1997) e Xestotrachelus robustus (Souza et al., 2003). A afinidade do AgNO 3 por regiões de HC observada em D. fuscus, por sua vez, não tem sido descrita em gafanhotos. No entanto, esta característica foi amplamente observada em coleópteros da família Scarabaeidae (Colomba et al., 2000; Moura et al. 2003; Bione et al., 2005). A afinidade dos íons de prata pela HC ocorre devido à presença de proteínas argirofílicas distribuídas neste material. Contudo, os blocos de HC marcados pelo AgNO 3 em D. fuscus foram menores quando comparados aos blocos detectados pelo bandeamento C, o que indica que a HC desta espécie é heterogênea. Apesar das semelhanças morfológicas, as quais colocaram, anteriormente, B. punctulatus e D. fuscus dentro de um mesmo gênero (Dichroplus), as espécies podem ser distinguidas, seguramente, pelas suas características cromossômicas. Estas apresentaram diferenças em relação ao número diplóide, padrão de distribuição e qualificação da HC e ao padrão de distribuição das RONs e respectivos sítios de DNAr. Estes dados sugerem que em Melanoplinae, além de um alto nível de variabilidade cariotípica, podem ocorrer uma grande riqueza no que se refere à composição da HC e aos mecanismos que controlam as atividades das RONs. Estudos futuros usando técnicas moleculares nas espécies aqui analisadas e em outras espécies desta subfamília contribuirão para aumentar o entendimento de sua evolução cariotípica. 61

72 CONCLUSÕES

73 6. Conclusões 1. Os diferentes números diplóides 2n=23, X0 e 2n=19,X0 observados em B. punctulatus e D. fuscus, respectivamente, corroboram a variabilidade cariotípica encontrada na subfamília Melanoplinae. 2. A presença de cromossomos com dois braços decorrentes da redução do número cromossômico em D. fuscus indica a ocorrência de fusões cêntricas entre cromossomos acrocêntricos, sendo este tipo de rearranjo responsável pelas mudanças cariotípicas na maioria das espécies do gênero Dichroplus. 3. O padrão pericentromérico e a riqueza de pares de bases GC da heterocromatina detectada nas duas espécies têm sido considerado comum entre a maioria dos acridoideos. Contudo, a presença de blocos adicionais, bem como a diferença na quantidade de HC entre B. punctulatus e D. fuscus sugere a ocorrência de rearranjos envolvendo regiões heterocromáticas ao longo da evolução cromossômica dessas espécies, acarretando a redução e/ou amplificação destas regiões. 4. A ocorrência em B. punctulatus de seis sítios de DNAr ativos, localizados em três autossomos grande, dois médio e no cromossomo X, detectados pela impregnação com AgNO 3 e confirmado pela FISH, representa um padrão inédito para a superfamília Acridoidea. 5. A ampla variabilidade de atividade das RONs encontrada em B. punctulatus sugere que, provavelmente, diferentes mecanismos de controle gênico são utilizados para atender as necessidades celulares nessa espécie. 6. A presença de duas RONs ativas em D. fuscus, detectadas pela impregnação de AgNO 3 e pela FISH, localizadas em cromossomos de tamanho médio e pequeno, tem sido considerado comum para a maioria dos acridoideos. 7. As diferenças em relação ao número e localização das RONs entre B. punctulatus e D. fuscus indicam que a ocorrência de rearranjos cariotípicos envolvendo sítios de DNAr tem um papel fundamental na evolução cromossômica da subfamília Melanoplinae. 63

74 8. A afinidade do AgNO 3 por proteínas associadas às regiões de HC observadas em D. fuscus sugere a ocorrência de uma classe de heterocromatina diferenciada nessa espécie. 64

75 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

76 7. Referências Bibliográficas Amedegnato C (1974). Les genres d acridiens néotropicaux, leur classification par familles, sous-familles et tribus. Acrida 3: Amedegnato C, Chapco W e Litzenberger G (2003) Out of South America? Additional evidence for a southern origin of melanopline grasshoppers. Molec. Phylogenet. Evol. 29: Bakkali M e Camacho JPM (2004) The B chromosome polymorphism of the grasshopper Eyprepocnemis plorans in North Africa. III. Mutation rate of B chromosomes. Heredity 92: Bakkali M, Cabrero J, López-Léon MD, Perfectti F e Camacho JPM (1999) The B chromosome polymorphism of the grasshopper Eyprepocnemis plorans in North Africa. I. B variants and frequency. Heredity 83: Bakkali M, Cabrero J, López-León MD, Perfecti F e Camacho JPM (2001) Population differences in the expression of nucleolus organizer regions in the grasshopper Exprepocnemis plorans. Protoplasma 217: Bella JL, Gosálvez J e De la Torre J (1990a) Males vs. Female meiotic prophase in a grasshopper, Arcyptera microptera (Orthoptera: Acrididae). Genetica 82: Bella JL, Gosálvez J e Hewitt GM (1990b) Meiotic imbalance in laboratory produced hybrid males of Chorthippus parallelus parallelus and Chorthippus parallelus erythropus. Genet. Res. Camb. 56: Bella JL, Serrano L, Orellana J e Mason PL (2007) The origin of the Chorthippus parallelus hybrid zone: chromosomal evidence of multiple refugia for Iberian populations. Jour Evol Biol 20: Bidau CJ (1984) Meiotic pairing and chiasma localization in Scyllina signatipennis (Gomphocernae, Acrididae). Caryologia 37: Bidau CJ (1986) Effects on cytokinesis and sperm formation of a B-isochromosome in Metaleptea brevicornis adspersa (Acridinae, Acrididae). Caryologia 39(2): Bidau CJ (1987) Influence of a rare unstable B-chromosome on chiasma frequency and nonhaploid sperm production in Dichroplus pratensis (Melanoplinae, Acrididae). Genetica 73: Bidau CJ (1990) The complex Robertsonian system of Dichroplus pratensis (Melanoplinae, Acrididae). II Effects of the fusion polymorphisms on chiasma frequency and distribution. Heredity 64: Bidau CJ (1991) Multivalents resulting from monobranquial homologies within a hybrid zone in Dichroplus pratensis (Acrididae): Meiotic orientation and segregation. Heredity 66: Bidau CJ e Hasson ER (1984) Population cytology of Leptysma argentina Brunner (Leptysminae, Acrididae). Genetica 62: Bidau CJ e Martí DA (2001) Meiosis and the neo-xy systems of Dichroplus vittatus (Melanoplinae, Acrididae): a comparison between sexes. Genetica 110: Bidau CJ e Martí DA (2002) Geographic distribution of Robertsonian fusions in Dichroplus pratensis (Melanoplinae, Acrididae): the central-marginal hypothesis reanalyzed. Cytog. Gen. Res. 96: Bidau CJ e Martí DA (2004) B chromosomes and Robertsonian fusions of Dichroplus pratensis (Acrididae): intraspecific support for the centromeric drive theory. Cytog. Gen. Res. 106: Bione EG, Moura RC, Carvalho R e Souza MJ (2005) Karyotype, C-and fluorescence banding pattern, NOR location and FISH study of five Scarabaeidae (Coleoptera) species. Gen. Mol. Biol. 28(3):

77 Bridle JR, De la Torre J, Bella JL, Butlin RK e Golsalvez J (2002) Low levels of chromosomal differentiation between the grasshoppers Chorthippus brunneus and Chorthippus jacobsi (Orthoptera-Acrididae) in northern Spain. Genetica 114: Brown SW (1966) Heterochromatin. Science 151: Bugrov AG (1994) Karyotype of the grasshopper Eclipophleps glacialis B.-Bienko, 1933 (Orthoptera, Acrididae, Gomphocerinae, Hypernephiini) from south east Altai. Fol. Biol. (Kraków) 42: Bugrov AG (1995) Interpopulation sex-chromosomes polymorphism in the grasshopper Podisma sapporensis Shir from Sakhalin and the Kurile Islands. Folia Biologica (Kraków) 43: Bugrov AG (1996) Karyotypes of the short-horned orthopteran insects (Orthoptera, Caelifera) from Russia, Kazakhstan, central Asia, and the Caucasus. Folia Biologica (Kraków) 44: Cabrero J e Camacho JPM (1986a) Cytogenetic studies in gomphocerinae grasshoppers. I. comparative analysis of chromosome C-banding pattern. Heredity 56: Cabrero J e Camacho JPM (1986b) Cytogenetics studies in gomphocerine grasshoppers II. Chromosomal location of active nucleolar organizing regions. Can. J. Genet. Cytol. 28: Cabrero J, Aché JD e Camacho JPM (1987) Effects of B chromosomes on the activity od nucleolar organizer regions in the grasshopper Eypropocnemis plorans: activation of a latent nucleolar organizer region on a B chromosome fused to an autosome. Genome 29: Cabrero J, Bugrov A, Warchalowska-Sliwa E, López-Leóns MD e Camacho JPM (2003) Comparative FISH analysis in five species of Eyprepocnemidine grasshoppers. Heredity 90: Camacho JPM e Cabrero J (1983) Karyological differences between two species of grasshopper genus Acrotylus (Acrididae: Oedipodinae). Caryologia 36: Camacho JPM, Navas-Castillo e Cabrero J (1986) Extra nucleolar activity associated with presence of a supernumerary chromosome segment in the grasshopper Oedipoda fuscocincta. Heredity 56: Camacho JPM, Sharbel TEA e Beukeboom LW (2000). B-chromosome evolution. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 355: Camacho JPM, Viseras R, Navas J e Cabrero J (1984). C-heterochromatin content of supernumerary chromosome segments of grasshoppers: Detection of an euchromatic extra segment. Heredity 53(1): Camacho JPM, Cabrero J, López-León MD, Bakkali M e Perfectti F (2003) The B chromosomes of the grasshopper Eyprepocnemis plorans and the intragenomic conflict. Genetica 117: Carbonell CS (1977) Origin, evolution and distribution of the Neotropical acridomorph fauna (Orthoptera): A preliminary hypothesis. Rev Soc Ent Arg. 36(1-4): Carbonell CS e Mesa A (2006) Ronderosia ommexechoides: a New Species of Brazilian Dichroplini (Orthoptera: Acrididae, Melanoplinae). Neot. Entomol. 35(5): Carbonell CS e Ronderos RA (1973) Las especies del grupo Punctulatus del género Dichroplus Stal (Orthoptera, Acrididae). Rev. Mus. Plat. 11: Carbonell CS, Cigliano MM e Lange CE (2006) Especies de Acridomorfos (Orthoptera) de Argetina y Uruguay. Publicado por The Orthopterist s Society at the Museo de La Plata, CD-ROM. Cardoso H, Saez FA e Brum-Zorrilla N (1974) Location, structure and behaviour of C- heterochromatin during meiosis in Dichroplus silveiraguidoi (Acrididae-Orthoptera). Chromosoma 48:

78 Carvalho AB, Dobo BA, Vibranovski, MD e Clark AG (2001) Identification of five new genes on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Proc. Nat. Acad. Scien. USA 98: Cella MD e Ferreira A (1991).The cytogenetics of Abracris flavolineata (Orthoptera, Caelifera, Ommatolampinae, Abracrini). Rev. Brasil. Genet. 14(2): Cigliano MM (1997) Ronderosia, a New Genus of South American Melanoplinae (Orthoptera: Acrididae) Jour. Orthopt. Res. 6:1-19. Cigliano MM (2007) Review of the South American genus Eurotettix Bruner (Orthoptera, Acridoidea, Melanoplinae). Syst. Entomol. 32: Cigliano MM, de Wysiecki ML e Lange CE (2000) Grasshopper (Orthoptera, Acridoidea) species diversity in the Pampas, Argentina. Jour. Div. Dist. 6: Cigliano MM, Torrusio S e de Wysiecki ML (2002) Grasshopper (Orthoptera: Acridoidea) community composition and temporal variation in the Pampas, Argentina. Jour. Orthopt. Res. 11: Clemente M, Remis MI, Vilardi JC e Albert A. (1994) Supernumerary heterochromatin, chiasma conditions and abnormal sperm formation in Dichroplus elongatus (Orthoptera): intra and interpopulation analysis. Caryologia 47(3-4): Clemente M, Remis MI e Vilardi JC (1996) Spontaneous centric fusions affecting chiasma conditions in Dichroplus elongatus (Orthoptera). Cytologia 61: Colomba MS, Vitturi R e Zunino M (2000) Karyotype analyzes, banding, and fluorescent in situ hybridization in the Scarab beetle Gymnopleurus sturmi McLeady (Coleoptera, Scarabaeoidea, Scarabaeidae). The Jour. Heredity, 91: Colombo PC e Confalonieri V (1996) An adaptive pattern of inversion polymorphisms in Trimerotropis pallidipennis (Orthoptera). Hereditas 125: Colombo PC; Pense S e Eremis MI (2003) Chromosomal polymorphism, morphometric traits and mating success in Leptysma argentina Brunner (Orthoptera). Genetica 146:1-7. Colombo PC, Cigliano MM, Sequeira AS, Lange CE, Vilardi JC e Confalonieri VA (2005) Phylogenetic relationships in Dichroplus Stal (Orthoptera Acrididae: Melanoplinae) inferred from molecular and morphological data: testing karyotype diversification. Cladistics 21: Confalonieri VA (1994) Inversion polymorphisms and natural selection in Trimerotropis pallidipennis (Orthoptera): correlations with geographical variables. Hereditas 121: Derenzini M, Thiry M e Goessens, G (1990) Ultrastructural cytochemistry of the mammalian cell nucleolus. Jour. Histochem. Cytoc. 38: Dernburg AF, Sedat JW e Hawley RS (1996) Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell 86: Díez M e Santos JL (1993) Synapsis in a paracentric inversion heterozygote of Chorthippus jacobsi (grasshopper). Heredity 70: Dillon N (2004). Heterochromatin structure and function. Biol. Cell 96: Dorer DR e Henikoff S (1997) Transgene repeat arrays interact with distant heterochromatin and cause silencing in cis and trans. Genetics 147(3): Esponda P, Rufas JS e Fonzo S (1985) Ultrastructure and the relationship between the nucleolus and the nucleolar organizer region in Orthoptera male germ cells. Can J Genet Cytol 27: Fernández-Piqueras J, Campos AR, Sentis-Castaño C e Rojo-Garcia E (1983) Sex chromosome evolution in the polytipic species Pycnogaster cucullata. Heredity 50: Goodpasture C e Bloom SE (1975) Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma 53:

79 Gosálvez J, Bella JL, López- Fernandez C e Mezzanotte R (1987) Correlation between constitutive heterochromatin and restriction enzyme resistant chromatin in Arcyptera tornosi (Orthoptera). Heredity 59: Gosálvez J, López-Fernandez C, Bella JL, Butlin RK e Hewitt GM (1988). A hybrid zone between Chrorthippus parallelus parallelus and Chrorthippus parallelus erythopus (Orthoptera: Acrididae): chromosomal differentiation. Genome 30: Grewal SIS e Jia S (2007) Heterochromatin revisited. Genetics 8: Grewal SIS e Moazed D (2003) Heterochomatin and epigenetic control of gene expression. Science 8: Grieco ML e Bidau CJ (2000) The dicentric nature of the metacentric B chromosome of Metaleptea brevicornis adspersa (Acridinae, Acrididae). Heredity, 81: Guerra M (2004) FISH: Conceitos e aplicações na citogenética. Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto, 176pp. Guillén AKZ, Hirai Y, Tanque T e Hirai H (2004) Transcriptional repression mechanisms of nucleolus organizer regions (NORs) in humans and chimpanzees. Chrom. Res. 12: Hadjiolov AA (1985) The nucleolus and ribosome biogenesis. In: Beerman AM, Goldstein L, Portrer KR and Sitte P (Eds.). Cell Biol Mon pp New York. Haines RL, Roberts PA e Lattin JD (1978) Paracentric inversion polymorphism in the grasshoppper Boonacris alticola. Chromosoma 65: Henikoff S (2000). Heterochromatin function in complex genomes. Bioch. Bioph. Acta 1470:1-8. Henriques-Gil N e Arana P (1990) Origin and substitution of B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Evolution 44: Henriques-Gil N, Santos JL e Arana P (1984) Evolution of a complex B-chromosome polymorphism in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Chromosoma (Berl) 89: Hewitt GM (1979) Animal cytogenetics 3. Insecta 1. Orthoptera. Borntraeger. Berlin- Stuttgart. 169pp. Holmquist GP, Kapitonov VV e Jurkz J (1998) Mobile genetic elements, chiasmata, and the unique organization of beta-heterochromatin. Cytog. Cell Gen. 80: Huisinga KL, Brower-Toland B e Elgin SC (2006) The contradictory definitions of heterochromatin: transcription and silencing. Chromosoma 115: John B (1990) Meiosis. Cambridge University Press, Cambridge. John B, King M, Schweizer D e Mendelak M (1985). Equilocality of heterochromatin distribution and heterogeneity in acridid grasshoppers. Chromosoma 91: Jones RN e Rees H (1982). B-chromosomes. Acad. Press Lond. 266p. Kevan DKMcE (1982) Synopsis and classification of living organisms. S.P. Parker, ED. Mcgrow-Hill Book Co King M (1991) The evolution of the heterochromatin in the amphibian genome. In: D.M. Green and S.K. Amph. Cytog. Evol King M e John B (1980) Regularities and restrictions governing C-band variation in acridoid grasshoppers. Chromosoma 76: López-Fernández C, Gosálvez C, Ferrucci L e Mezzannotte R (1991). Restriction endonucleases in the study of eukaryotic chromosomes. Genetica 83: López-Léon MD, Cabrero J, Pardo MC, Viseras E, Camacho JPM e Santos JL (1993) Generatins high variability of chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Heredity 71: López-León MD, Neves N, Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS, Hewitt GM e Camacho JPM (1994) Possible origin of a B chromosome deduced from its DNA composition using double FISH technique. Chrom. Res. 7:

80 López-León MD, Cabrero J e Camacho JPM (1999) Unusually high amount of inactive ribosomal DNA in the grasshopper Stauroderus scalaris. Chrom. Res. 7: Loreto V e Souza MJ (2000) Karyotype, constitutive heterochromatin and nucleolar organizer regions (NORs) in Belosacris coccineipes (Acrididae-Leptysminae). Gen. Mol. Biol. 23: Loreto V, Stadtler E, Melo NF e Souza MJ (2005) A comparative cytogenetic analysis between the grasshopper species Chromacris nuptialis and C. speciosa (Romaleidae): constitutive heterochromatin variability and rdna sites. Genetica 125: Loreto V, Cabrero J, López-León MD, Camacho JPM e Souza MJ (2008a) Comparative analysis of rdna location in five Neotropical gomphocerine grasshopper species. Genetica 132: Loreto V, Cabrero J, López-León MD, Camacho JPM e Souza MJ (2008b) Possible autosomal origin of macro B chromosomes in two grasshopper species. Chrom. Res. 16: Lyon MF (1999) X-chromosome inactivation. Curr Biol 9: Martí DA e Bidau CJ (1995) Male and female meiosis in a natural population of Dichroplus pratensis (Acrididae) polymorphic for Robertsonian translocations: A study of chiasma frequency and distribution. Hereditas 123: Martí DA e Bidau CJ (2001) Synapsis in Robertsonian heterozygotes and homozygotes of Dichroplus pratensis (Melanoplinae, Acrididae) and its relationship with chiasma patterns. Hereditas 134: Mattei MG e Luciani J (2003) Heterochromatin, from Chromosome to protein. Atlas of Gen. Cytog. Oncol. Hematol. Mesa A e Fontanetti CS (1983) Karyotypes of nine brazilian species of acridids (Orthoptera, Acridoidea). Rev. Brasil. Genet. VI (2): Mesa A, Ferrreira A e Carbonell CS (1982) Cariologia de los Acridoideos Neotropicales: Estado actual de su conocimiento y nuevas contribuciones. Ann. Soc. Ent. Fr (N.S) 18 (4): Mesa A, Fontanetti CS e Costa H (1990) The karyotype of the grasshopper Spathalium helios Rehn (Orthopterra, Acridoidea, Ommexechidae). Rev. Brasil. Genet. 13 (4): Michel AA e Terán HR (2005a) Análisis morfológico del sistema reproductor femenino de Baeacris punctulatus (Orthoptera: Acrididae: Melanoplinae). Rev. Soc. Entomol. Argent. 64(3): Michel AA e Terán HR (2005b) Morfología del sistema reproductor masculino de Baeacris punctulatus (Thunberg) (Orthoptera: Acrididae) Rev. Mus. Plat. 17(169):1-12. Moscone EA, Matzke MA e Matzke AJM (1996) The use of combined FISH/GISH inconjunction with DAPI counterstaining to identify chromosomes containing transgene inserts in amphidiploid tobacco. Chromosoma 105: Moura RC, Souza MJ, Melo NF e Lira-Neto AC (2003) Karyotypic characterizacion of representatives from Melolonthinae (Coleoptera: Scarabaeidae): Karyotypic analysis, banding and fluorescent in situ hybridization (FISH). Hereditas, 138: Müller F, Bernard, V e Tobler H (1996) Chromatin diminution in nematodes. Biessays 18: Nankivell RN (1976) Karyotype differences in the crenaticeps-group of Atractomorpha (Orthoptera, Acridoidea, Pyrgomorphidae). Chromosoma 56: Navas-Castillo J, Cabrero J e Camacho JPM (1987) Paracentric inversion in the grasshopper Oedipoda charpentieri. Heredity 59: Nur U (1968) Synapsis and crossing over within a paracentric inversion in the grasshopper Camnula pellucida. Chromosoma 25: Olson MOJ, Dundr M e Szebeni A (2000) The nucleolus: an old factory with unexpected capabilities. Trends Cell Biol. 10:

81 Otte D (1995) Orthoptera Species File 4. The Orthopterists Society and The Acad. Nat. Scien. Phil., PA, 518p. Partridge JF, Borgstrøm B e Allshire RC (2000) Distinct protein interaction domains and protein spreading in a complex centromere. Genes and Develop. 14: Pastori MC e Bidau CJ (1994) The B-isochromosome of Metaleptea brevicornis adspersa (Acrididae) found in northern corrientes (Argentina). Revista Brasileira de Genetica 17(1): Pereira LG e Souza MJ (2000) Nature and distribution of constitutive heterochromatin and NOR location in the grasshopper Phaeoparia megacephala (Romaleidae, Orthoptera). Cytobios 103: Perfectti F, Cabrero J, López-León MD, Muñoz E, Pardo MC e Camacho JPM (2000) Fitness effect analysis of a heterochromatic supernumerary segment in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Chrom. Res. 8: Raska I, Koberna K, Malínský J, Fidlenorová H e Masata M (2004) The nucleolus and transcription of ribosomal genes. Biol. Cell 96: Remis MI (1989) Effects of supernumerary heterochromatin on chiasma condition in two species of Acrididae (Orthoptera). Genetica 79: Remis MI (1993) Effects of chromosome rearrangements on sperm formation in Sinipta dalmani (Orthoptera, Acrididae). Caryologia 46 (4): Remis MI (1997) Cytogenetic studies in Sinipta dalmani (Acrididae): III Pericentric M4 inversion affecting morphological traits. Jour. Gen. 76: Remis MI e Vilardi JC (2004) Mitotically unstable B chromosome polymorphism in the grasshopper Dichoplus elongatus. Cytog. Gen. Res. 106: Remis MI, Pensel S e Rosetti N (2004) Interaction among different heterocromatic variants in the grasshopper Dichroplus elongatus. Hereditas 141: Rocha MF, Souza MJ e Moura RC (2004) Karyotypic analysis, constitutive heterochromatin and NOR distribution in five grasshopper species of the subfamily Leptysminae (Acrididae). Caryologia, 57(1): Rocha MF, Souza MJ e Tashiro T (1997) Karyotype variability in the genus Radacridium (Orthoptera, Romaleidae, Romaleinae). Cytologia 62: Rodríguez Iñigo E, Bella JL e Garcia de la vega C (1993) Heterocromatin diferentiation between two species of the genus Dociostaurus (Orthoptera-Acrididae). Heredity 70: Rodríguez Iñigo E, Fernández-Calvín B, Capel J e Garcia de la Vega C (1996) Equilocality and heterogeneity of constitutive heterocromatin: in situ localization of two families of highly repetitive DNA in Dociostaurus genei (Orthoptera). Heredity 76: Ronderos RA (1964) Contribución al conocimiento del complejo fálico en especies de los género Aleuas Stal y Dichroplus Stal de la provincia de Buenos Aires (Orthoptera, Acrididae). Rev. Inv. Agro. 5(1): Ronderos RA (1979) Dichroplini de Colombia y Venezuela (Orthoptera, Acrididae, Melanoplinae). Obra Cent. Mus. Plat. 6: Ronderos RA e Cigliano MM (1991) The Andean Dichroplini: Cladistic analysis with description of Keyacris n. gen. and Ponderacris n. gen. (Orthoptera: Acrididae: Melanoplinae). Trans. Amer. Entomol. Soc. 117: Rosetti N; Vilardi JC e Remis MI (2007) Effects of B chromosomes and supernumerary segments on morphometric traits and adult fitness componentes in the grasshopper, Dichroplus elongatus (Acrididae). Jour. Comp. Eur. Soc. Evol. Biol. 20: Rowell CHF e Carbonell CS (1977) Baeacris talamancensis gen. and sp. nov. (Acrididae, Melanoplinae), a Neotropical montane grasshopper: its implications for the origin of the Dichroplini and the Costa Rican páramo. Acrida 6: Rufas JS e Gosálvez J (1982) Development of silver stained structures during spermatogenesis of Schistocerca gregaria (Forsk.) (Orthoptera: Acrididae). Caryologia 35(2):

82 Rufas JS, Esponda P e Gosálvez J (1985) NOR and nucleolus in the spermatogenesis of acridoid grasshoppers. Genetica 66: Rufas JS, Giménez-Abian J, Suja JA e Garcia De La Vega C (1987) Chromosome organization in meiosis revealed by light microscope analysis of silver-stained cores. Genome 29: Rufas JS, Gosálvez J, Gimenez-Martín e Esponda P (1983) Localization and development of kinetochores and a chromatid core during meiosis in grasshoppers. Genetica 61: Sáez FA (1930) Nota sobre los complejos de cromosomas em cuatro especies de ortopteros (Acrididae) del Rio de La Plata. Arch. Soc. Biol. Montev. 2: Saéz FA e Pérez-Mosquera G (1977) Structure, behaviour and evolution of the chromosomes of D. silveiraguidoi (Orthoptera, Acrididae). Genetica 47: Sánchez-Gea JF, Serrano J e Galián J (2000) Variability in rdna loci in Iberian species of the genus Zabrus (Coleoptera: Caribidae) detected by fluorescence in situ hybridization. Genome 43: Santos JL e Giráldez R (1982) C-heterochromatin polymorphism and variation in chiasma locatization in Euchorthippus pulvinatus gallicus (Acrididae, Orthoptera). Chromosoma 85: Santos JL, Arana P e Giraldez R (1983) Chromosome C-banding patterns in Spanish Acridoidea. Genetica 61: Santos JL, Sentis C, Garcia-Rodriguez J e Fernandez-Piqueiras J (1990) Latent NORs in the specie Pycnogaster cucullata (Orthoptera). Heredity 65:7-10. Schwarzacher HG e Wachtler F (1983). Nucleolus organizer regions and nucleoli. Hum. Genet. 63: Schweizer D (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with Chromomicin and DAPI. Chromosoma 58: Schweizer D (1980). Simultaneous fluorescent staining of R bands and specific heterocromatic regions (DA-DAPI bands) in human chromosomes. Cytog. Cell Genet. 27: Schweizer D (1981). Counterstain-enhanced chromosome banding. Human Genet. 57:1-14. Souza MJ e Kido HML (1995) Variability of constitutive heterochromatin in karyotypes of representatives of the family Romaleidae (Orthoptera). Braz. Jour. Gen.18(4): Souza MJ e Melo NF (2007) Chromosome study in Schistocerca (Orthoptera- Acrididae- Cyrtacanthacridinae): Karyotypes and distribution patterns of constitutive heterochromatin and nucleolus organizer regions (NORs). Gen. Mol. Biol. 30(1): Souza MJ e Silva Filha MHNL (1993) Effects of extra chromosome segments on chiasma distribution in Xyleus angulatus (Orthoptera: Romaleidae). Rev. Bras. Gen. 16(1): Souza MJ, Haver ORP e Melo NF (2003) Karyotype, C-and fluorescence banding patterns and, NOR location and FISH in the grasshopper Xestotrachelus robustus (Romaleidae). Caryologia 56(3): Souza MJ, Rufas JS e Orelana J (1998) Constitutive heterochromatin, NOR location and FISH in the grasshopper Xyleus angulatus (Romaleidae). Caryologia 51: Suja JA, de la Torre J, Giménez Abián JF, García de la Vega C e Rufas JS (1991) Meiotic chromosome structure. Kinetochores and chromatid cores in standard and B chromosomes of Arcyptera fusca (Orthoptera) revealed by silver staining. Genome 34: Sumner AT (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Exp. Cell Res. 75: Sumner AT (1990) Chromosome banding. First edition. Academic Division of Unwin Hyman Ltd., London, 434pp. 72

83 Sumner AT (2003). Chomosomes: Organization and Function. Blackwell Science Ltd., UK. 287pp. Teoh SB e Yong HS (1983) A spontaneous centric fusion heterozygote in the tropical grasshopper, Valanga nigrocornis (Burmeister). Caryologia 36 (2): Torres RA, Ganal M and Hemleben V (1990) GC balance in the internal transcibed spacer ITS1 and ITS2 of nuclear ribossomal RNA genes. Jour. Mol. Evol. 30: Trerè D (2000) AgNOR staining and quantification. Micron 31: Türkoglu S e Koca S (2002) Chromosomes of Oedipoda schochi schochi and Acrotylus insbricus (Orthoptera, Acrididae, Oedipodinae). Karyotypes and C- and G-band patterns. Turk. Jour. Zool. 26: Vaio ES, Goñi B e Rey C (1979) Chromosome polymorphism in populations of the grasshopper Trimerotropis pallidipennis from Southern Argentina. Chromosoma 71: Vilardi CJ (1986) Parallel polymorphisms for interstitial C-bands and B- chromosomes in Zoniopoda tarsata (Orthoptera: Romaleidae). Caryologia 39(3-4): Visintin R e Amon A (2000) The nucleolus: the magician s hat for cell cycle tricks. Cur. Opin. Cell Biol. 12: Wallrath LL (1998). Unfolding the mysteries of heterochromatin. Cur. Opin. Gen. Dev. 8: White MJD (1973) Animal cytology and evolution. Thrid edition. Cambridge University. Londom,961p. Zurita F, Jiménez R, Burgos M e Díaz de la Guardiã R (1998) Sequential silver staining and in situ hybridization reveal a direct association between rdna levels and the expression of homologous nucleolar organizing regions: a hypothesis for NOR structure and function. Jour. Cell Scien. 111:

84 ANEXO

85 8. Anexo 8.1. Fotografias das Espécies Estudadas Fotografias das espécies estudadas. (a) Baeacris punctulatus; (b) Dichroplus fuscus. FONTE: Carbonell et al.,