UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO Avaliação da Atividade Enzimática de Frutosiltransferase produzida por Aspergillus oryzae em Fermentação Semi-Sólida de Resíduos de Melão Cantaloupe Jéssica Anarellis Barbosa dos Santos NATAL/RN 2018

2 JÉSSICA ANARELLIS BARBOSA DOS SANTOS Avaliação da Atividade Enzimática de Frutosiltransferase produzida por Aspergillus oryzae em Fermentação Semi-Sólida de Resíduos de Melão Cantaloupe Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Departamento de Engenharia Química como requisito parcial para a obtenção do título de Engenheiro Químico. Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos UFRN, Departamento de Engenharia Química. Co-orientadora: Profª. Dr. Priscilla Moura Rolim Madeira UFRN, Departamento de Nutrição. NATAL/RN 2018

3 JÉSSICA ANARELLIS BARBOSA DOS SANTOS Avaliação da Atividade Enzimática de Frutosiltransferase por Aspergillus oryzae em Fermentação Semi-Sólida de Resíduos de Melão Cantaloupe Aprovado em: / / Banca Examinadora: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Departamento de Engenharia Química - UFRN (Orientador) Profª. Dr. Priscilla Moura Rolim Madeira Departamento de Nutrição UFRN (Co-orientadora) Dr. Sérgio Dantas de Oliveira Júnior Departamento de Engenharia Química UFRN (3º membro)

4 AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço à minha família, especialmente à minha mãe, Josélia, que sempre lutou sozinha para que nenhuma oportunidade nos fosse negada e nos ensinou que a educação e o trabalho são o caminho para realizar nossos sonhos. Às minha irmãs, Roberta e Maria Júlia, agradeço o companheirismo de toda uma vida. Vocês me dão propósito. Aos meus amigos de vida e de curso que me acompanharam durante toda essa trajetória, Fábio e Gabriel, obrigada por tudo. O mundo é nosso. Aos meus colegas de trabalho, professoras e alunos do Departamento de Nutrição, em especial às minhas chefes Nély e Renata, obrigada pelo apoio, paciência e compreensão que recebi de vocês durantes esses anos de graduação. Ao meu namorado e companheiro Diego Tardelle, que no último ano tem sido meu braço amigo, meu conforto e meu abrigo do mundo, lavou vidraria, me ajudou e me incentivou de diversas formas no final dessa jornada, sou muito grata a você. Este é o início do nosso futuro. À minha co-orientadora Profª Drª Priscilla Moura Rolim Madeira, pela oportunidade, toda ajuda, paciência e compreensão e ao meu orientador Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos pela confiança de desenvolver este trabalho no LEB. A Sérgio, Millena e todos que compõem a equipe do LEB, obrigada pela ajuda e apoio que recebi durante a execução deste trabalho. Desejo sucesso para todos. Obrigada a todos, que direta ou indiretamente, contribuíram para a conclusão deste trabalho e na trajetória da minha graduação.

5 RESUMO A geração de resíduos é inerente a qualquer setor produtivo e esses materiais representam uma alternativa economicamente viável a serem usados como substrato para bioprocessos para a produção de enzimas e outros produtos de valor agregado. Tendo em vista o reaproveitamento de resíduos alimentares, o presente estudo avaliou a produção de frutosiltransferase (FTase) por meio de Fermentação Semi-Sólida usando resíduos da casca e sementes de melão Cantaloupe como substrato e o Aspergillus oryzae como microrganismo produtor. Os meios de cultivo para fermentação continham 5g de farinhas de casca de melão, semente de melão integral, e semente de melão desengordurada. Os meios foram suplementados com soluções de frutose e sacarose e outros nutrientes. As fermentações ocorreram em erlenmeyers, incubados a 45 C por 7 dias. A umidade das amostras foi fixada em 60%, atividade de água 0,9, ph de 5,5 para o meio contendo casca de melão, e 6,0 para os meios contendo sementes de melão. A cada 24 horas, foram obtidos extrato enzimático de cada meio, e posteriormente avaliado a atividade hidrolítica pelo método do Ácido Dinitrossalicílico (ADNS) tendo sacarose como substrato. Os resultados mostraram que o valor máximo de atividade hidrolítica de FTase foi atingido em 144 horas de fermentação do meio que continha farinha de casca de melão como substrato (90,78 UI/g). O meio contendo farinha de semente de melão integral apresentou um valor máximo de atividade de 49,82 UI/g em 24 horas de fermentação. O meio contendo farinha de semente desengordurada apresentou um valor máximo de atividade de 0,635 UI/g. A análise em HPLC apontou que os maiores valores de atividade da FTase foram observados nos meios contendo farinha de casca de melão, com 1,14 UI/g no tempo de 72 h, O maior valor de atividade da FTase nos meios contendo farinha de semente foi de 0,76 UI/g em 48 h e a maior concentração de FOS (1,90 mg/ml) foi encontrada neste meio e no mesmo tempo de 48h, apesar da menor atividade enzimática. Os bons valores de atividade obtidos nos cultivos dos meios contendo casca e semente integral de melão mostrou o potencial do uso desses resíduos como substrato para isolamento e avaliação de tipos específicos de hidrolases, tais como as frutosiltransferases, classe de enzimas responsáveis por catalizar reações hidrolíticas e de transfrutosilação. Palavras-Chave: Reaproveitamento; fermentação semi-sólida; resíduos de melão; frutosiltransferase; atividade hidrolítica.

6 ABSTRACT Waste generation is inherent to any activity of the production sector, and these materials represent an economically viable alternative to be used as substrate for bioprocess for the production of enzymes and other value-added products. Having the aim of reusing food waste as substrate for enzyme production, this study evaluated the production of fructosyltransferase (FTase) by Solid-State Fermentation using melon peel, whole and defatted melon seeds residues as substrate and Aspergillus oryzae as producer strain. A kinetic study was carried out in BOD using cultivation medium containing 5g of dehydrated melon peel, whole melon seeds and defatted melon seeds supplemented with sucrose and fructose solutions and other nutrition factors. The fermentations were carried out in shake flasks during 7 days at 45 C. The moisture was kept at 60%, water activity was 0.9, ph was 5.5, for the media containing melon peels, and 6.0 for the media containing whole and defatted melon seeds. After each 24 hours, a sample was taken, the material was filtered and centrifuged to obtain an extract, which was further evaluated for its hydrolytic activity by Dinitrosalicylic acid method having sucrose as substrate. Results showed that maximum extracellular fructosyltransferase production by hydrolytic activity was reached at 144 hours of fermentation having melon peel as substrate (90.78 U/g). The media containing whole melon seeds showed values of activity 45.1% lower, reaching a maximum of U/g in 24 hours of fermentation. The media containing defatted melon seeds reached a maximum activity of 0,635 U/g. An HPLC run showed that the highest FTase activities were observed in the media that contained melon peel residue (1,14 UI/g in 72 h). The highest FTase activity observed for the media that contained melon seeds residues was reached at 48 h (0,76 UI/g) and the highest FOS concentration was 1,90 mg/ml, in this same media composition and at the time of 48 h. These results show the potential of using melon peels and whole melon seeds as substrate for isolation and evaluation of specific types of hydrolases such as fructosyltransferases, the class of enzymes responsible for catalyzing hydrolytic and transfructosylating reactions. Keywords: Reuse; solid-state fermentation; melon residues; fructosyltransferase; hydrolytic activity.

7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Aproveitamento de Resíduos Alimentares e Agroindústriais Utilização de sub-produtos alimentares em bioprocessos Fermentação Semi Sólida Aspergillus oryzae Frutooligossacarídeos e as Frutosiltransferases O melão (Cucumis melo L) como substrato para produção de enzimas microbianas MATERIAIS E MÉTODOS Material Métodos Produção de Frutosiltransferase (FTase) Microrganismo e sua ativação Proliferação dos esporos Fermentação semi-sólida (FSS) Exração da Enzima Determinação da atividade hidrolítica da enzima Frutosiltransferase (FTase) Determinação das Proteínas totais Determinação de FOS e atividade enzimática da FTase RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE A

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Hierarquia do gerenciamento de resíduos Figura 2 Principais características da FSS Figura 3 Estrutura química dos principais frutooligossacarídeos 1-kestose, nistose e 1-frutofuranosilnistose Figura 4 Da esquerda para a direita: farinha de casca de melão, farinha de semente de melão integral e farinha de semente de melão desengordurada Figura 5 Aspergillus oryzae ativado em meio Agar Dextrose Batata após 7 dias de incubação a 30º C Figura 6 Propagação do fungo Aspergillus oryzae em meio contendo sabugo de milho estéril após 5 dias de incubação a 30 ºC Figura 7 Meio para Fermentação Semi sólida contendo farinha de semente de melão integral e desengordurada Figura 8 Estratégia experimental utilizada na produção das enzimas FTase a partir dos resíduos de melão Figura 9 Atividade Hidrolítica FTase (UI/g) em função do tempo (h) para os meios contendo farinha da casca de melão (M1) e farinha da semente de melão (M2) e farinha de semente de melão desengordurada (M3) Figura 10 Concentração de FOS em termos de Nistose e de atividade Frutosiltransferase (FTase) em função do tempo de cultivo em fermentação semi-sólida, para os meios contendo Farinha de Casca (M1), Farinha de Semente Integral (M2) Figura 11 Cromatogramas obtidos pelas análises de HPLC para uma amostra contendo farinha de Casca no tempo de 24 horas (a) e farinha de semente integral no tempo de 48 h (b) Figura 12 Meio contendo farinha de casca de melão (esquerda) e meio contendo farinha de semente integral de melão (à direita)

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Composição centesimal físico-química, em base seca, das farinhas dos resíduos da casca e da semente do melão, variedade reticulatus, após secagem a 80 C/ 24h Tabela 2- Composição dos meios contendo farinha da casca de melão M1, farinha de semente de melão M2 e farinha de semente de melão desengordurada M Tabela 3- Valores de atividade hidrolítica da Frutosiltransferase (FTase) em função do tempo de cultivo em fermentação semi-sólida, para os meios contendo Farinha de Casca (M1), Farinha de Semente Integral (M2) e Farinha de Semente Desengordurada (M3) de melão Cantaloupe Tabela 4- Valores de concentração de Glicose em função do tempo de cultivo em fermentação semi-sólida, para os meios contendo Farinha de Casca (M1), Farinha de Semente Integral (M2) Tabela 5- Valores de concentração de FOS em termos de Nistose e de atividade Frutosiltransferase (FTase) em função do tempo de cultivo em fermentação semi-sólida, para os meios contendo Farinha de Casca (M1), Farinha de Semente Integral (M2).. 38 Tabela 6- Valores de Proteínas Totais (PT) (mg/ml) e Atividade Específica (AE) (UI/ mg de proteínas) para os meios contendo Farinha de Casca de Melão (M1) Farinha de Semente de Melão Integral (M2) e Farinha de Semente de Melão Desengordurada (M3)

10 1. INTRODUÇÃO A geração de resíduos e subprodutos é inerente a qualquer setor produtivo e nos setores de agroindústria e de alimentos, esses resíduos podem apresentar elevados problemas de disposição final e potencial poluente, além de representarem, muitas vezes, perdas de biomassa e de nutrientes de alto valor (PINTO, 2005). Os resíduos sólidos agroindústriais (bagaços, tortas, restos de frutas e hortaliças, etc.) são provenientes de usinas sucro-alcooleiras, de estabelecimentos que processam frutas e hortaliças (bagaço, tortas, refugo e restos), indústria da celulose e papel (resíduos da madeira, lodo do processo de produção e do tratamento de águas residuárias) entre outros. Muitos frutos comestíveis são processados para fabricação de sucos naturais, sucos concentrados, doces em conserva, polpas e extratos, os quais possuem sementes que são, muitas vezes, descartadas e que poderiam ser utilizadas para minimizar o desperdício de alimentos (DANTAS e AQUINO, 2010). No setor de alimentação coletiva, a produção de refeições caracteriza-se pelo elevado processamento de alimentos com conseqüente geração de resíduos sólidos, sobretudo aqueles relacionados com as cascas e sementes de frutos e vegetais. Neste sentido, destaca-se como grande desafio de gestores e da sociedade o equilíbrio entre a produção de bens e serviços, o crescimento econômico, a igualdade social e a sustentabilidade ambiental. A preocupação com o meio ambiente leva à viabilização de projetos que promovem a sustentabilidade do sistema de produção, ao contrário do que acontecia no passado, quando resíduos eram dispostos de forma indevida. Atualmente, o reaproveitamento desses subprodutos é cada vez mais difundido (FERREIRA et al., 2011). Nesse contexto, a Fermentação em Estado Sólido ou Fermentação Semi-Sólida (FSS) desponta como uma importante tecnologia para o reaproveitamento e agregação de valor desses resíduos, visando a síntese de diversos compostos de alto valor agregado e de grande interesse indústrial (DANTAS e AQUINO, 2010). Na FSS, os fungos representam uma das classes de microrganismos mais promissores devido à variedade de produtos de seu metabolismo e também de seu crescimento através de hifas, que permite maior penetração dos microrganismos entre as partículas e as regiões porosas do substrato. Um dos fungos mais utilizados em FSS é o gênero Aspergillus, o qual é considerado microrganismo GRAS (Generally Recognized As Safe reconhecido como de uso seguro) pelo Food and Drug Administration (FDA), a agência reguladora de 10

11 alimentos dos Estados Unidos para a produção de alimentos (WOICIECHOWSKI et al., 2013). Assim, o Aspergillus oryzae ganha destaque por se desenvolver em culturas em estado sólido, sendo capaz de produzir e secretar grande número de proteínas, em especial enzimas, fato também apontado pela análise do genoma do microrganismo. Ademais, é descrito que A. oryzae secreta um número maior de proteínas quando crescido em estado sólido quando comparado ao crescimento em estado líquido (PINTO, 2012). Dessa forma, diante da problemática da geração de resíduos, uma alternativa para seu aproveitamento seria a produção de enzimas por meio da FSS, onde os microrganismos atuam degradando material lignocelulósico e outros carboidratos presentes no meio, sendo capazes de produzir enzimas específicas (DANTAS e AQUINO, 2010). Estudo realizado por Moura Rolim et al. (2018) identificaram potencial fermentativo na produção de celulases em casca e semente de melão, utilizando Aspergillus oryzae, bem como demonstraram possível efeito prebiótico destes resíduos ao constatar crescimento de Bifidobacterium lactis em meio contendo semente de melão Cantaloupe. Os mesmos autores avaliaram a composição nutricional dos resíduos e identificaram que os resíduos são ricos em proteínas e que a semente de melão é rica em lipídios. Neste sentido, o resíduo de melão cantaloupe pode ser um adequado substrato para produção de outras enzimas, tais como as frutosiltransferases. As frutosiltransferase (FTase) formam um grupo de enzimas é capazes de produzir frutooligossacarídeos (FOS) a partir de sacarose de modo desproporcional, formando inicialmente 1-kestose, depois 1-nistose seguido de 1-frutofuranosilnistose (OTTONI et al., 2012). O FOS são oligossacarídeos de frutose que podem ser usados como uma alternativa mais saudável com relação aos adoçantes artificiais e à sacarose, e são considerados fibras dietéticas de baixo valor calórico, o que vem despertando grande interesse da indústria e de pesquisadores em desenvolver formas cada vez mais econômicas de produzir e aumentar os rendimentos da produção dos FOS. Considerando a grande disponibilidade de resíduos de melão na região Nordeste, bem como a possibilidade de agregar valor a tais resíduos, este estudo se propôs a 11

12 utilizar estes substratos em estudos de fermentação semi-sólida na presença do fungo Aspergillus oryzae para produção de enzimas frutosiltransferase. 12

13 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Avaliar a viabilidade tecnológica de resíduos de melão Cantaloupe na produção de enzimas frutosiltransferase (FTase) OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar ensaios de fermentação semi sólida utilizando resíduo de casca e semente de melão; Avaliar a influência de pré-tratamento da amostra na produção de enzimas frutosiltransferases; Verificar atividade enzimática e específica das enzimas FTase; Quantificar os FOS pelo método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). 13

14 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Aproveitamento de Resíduos Alimentares e Agroindústriais Um-terço (1/3) dos alimentos produzidos para consumo humano em todo o mundo é perdido ou desperdiçado, em quantidades que chegam a 1.3 bilhões de toneladas por ano (FAO, 2018). O Banco de Alimentos (2018) estima que 10 % das perdas ocorrem no campo, 50% no manuseio e transporte, 30% na comercialização e abastecimento e 10% no varejo e no consumidor final. A organização destaca o valor do desperdício de alimentos em termos globais e brasileiros: de uma média de R$ 748 gastos por uma família média brasileira com alimentação por mês, R$ 90 seriam economizados se o desperdício fosse diminuído em pelo menos 20%; estima-se que 805 milhões de pessoas no mundo sofrem com a fome e 3,4 milhões de brasileiros vivem em situação de insegurança alimentar; 70% da água do mundo é utilizada na produção de alimentos mesmo com todo esse desperdício (Banco de Alimentos, 2018). O processamento de frutas pelas indústrias de alimentos e serviços de alimentação produz ao longo de sua cadeia produtiva em todo mundo, milhões de toneladas de resíduos agroindústriais, que ocasionam diversos problemas ambientais. Calcula-se que o processamento de frutas para produção de sucos e polpa gera entre 30 e 40% de resíduos agroindústriais (NASCIMENTO FILHO e FRANCO, 2015). Segundo dados da Associação Brasileira das Empresas de Refeições Coletivas- ABERC, estima-se que o mercado de refeições coletivas gerenciadas por prestadoras de serviço gere 13 milhões de refeições por dia (ABERC, 2018). Em Unidades de Alimentação e Nutrição (UANs), a geração de resíduos é em média de 0,2kg/comensal/dia e até os dias atuais há poucas ações relacionadas aos impactos ambientais provocados pela produção de refeições para a coletividade (ALVES e UENO, 2015). O desperdício de alimentos é proveniente de sobras de alimentos (alimentos preparados e não distribuídos) e restos (alimentos distribuídos e não consumidos). Os alimentos preparados e não distribuídos são provenientes do planejamento inadequado do número de refeições a serem produzidas, da frequência diária dos usuários, das preferências alimentares, do treinamento de funcionários na produção e no porcionamento (PISTORELLO, CONTO e ZARO, 2015). O crescimento da população mundial a taxas exponenciais que ocorreu no último século levou a um aumento na demanda por alimentos e energia, mas o lento desenvolvimento de estratégias efetivas de gerenciamento de resíduos acarretou na 14

15 acumulação dos resíduos agroindústriais. Apesar de haver medidas preventivas que podem ser tomadas para reduzir a geração desses resíduos, ainda se faz necessário encontrar formas de lidar com o impacto que já foi gerado, e a ideia de reaproveitar tais resíduos para a geração de energia e produtos químicos e biológicos, de alto valor agregado, é uma área da pesquisa com grande potencial e oportunidades, devendo o descarte dos resíduos em aterros sanitários e lixões, ser considerado somente em ultimo caso (Figura 1) (RAVINDRAN e JAISWAL, 2016). Figura 1: Hierarquia do gerenciamento de resíduos Adaptado de: RAVINDRAN e JAISWAL (2016) Um dos principais entraves ocasionados pelo crescimento indústrial é o processamento de frutas, verduras e hortaliças que em diversas partes do mundo está associada à produção de resíduos orgânicos. Destaca-se, portanto, o processamento mínimo de melão, maracujá e cana-de-açúcar que apresentam uma grande quantidade de matérias-primas sendo descartadas devido ao seu processamento indústrial. Estes resíduos são compostos por vitaminas, minerais, fibras, compostos antioxidantes e nutrientes essenciais para o bom funcionamento do organismo humano; no entanto eles são desperdiçados na grande parte das fábricas e indústrias. Cascas e sementes apresentam em sua constituição substâncias que são de grande importância para as funções fisiológicas. Compostos antioxidantes, fenólicos, vitamina C e carotenóides 15

16 podem ser encontrados em maior concentração nas cascas e sementes (NASCIMENTO FILHO e FRANCO, 2015) Utilização de sub-produtos alimentares em bioprocessos Bioprocessos podem ser definidos como processos de transformação de uma dada matéria-prima envolvendo uma célula viva (animal, vegetal, microbiana), ou parte de uma célula, como as enzimas ou uma alga que acumulem no meio de cultivo uma série de bioprodutos produzidos no metabolismo desses microrganismos. Pode-se também denominar como bioprocessos cultivos celulares, processos fermentativos, dependendo do tipo de organismo e do processo envolvido (WOICIECHOWSKI, 2013). Por serem ricos em nutrientes, os resíduos alimentares e agroindústriais podem ser considerados matérias-primas ideais por fornecerem macro e micronutrientes essenciais para cultivos microbiológicos e para a produção indústrial de produtos com alto valor agregado (PANESAR et al., 2016). Há uma gama de produtos importantes comercialmente que tem sido largamente produzidos a partir da biotransformação de sub-produtos alimentares, como biocombustíveis, enzimas, ácidos orgânicos, biopolímeros e fibras dietéticas (RAVINDRAN e JAISWAL, 2016). Em suma, os resíduos alimentares e agroindústriais são materiais de baixo custo, apresentam boa disponibilidade e podem conter muitas substâncias de alto valor que são convertidas em produtos de importante valor econômico; ao mesmo tempo, a utilização desses resíduos em novos processos reduz a necessidade da disposição de resíduo no meio ambiente, diminuindo assim a poluição ambiental (WOICIECHOWSKI, 2013). Resíduos alimentares têm sido apontados como opções ideais para a produção de enzimas, assim, muitos tipos de resíduos tem sido estudados para este fim (RAVINDRAN e JAISWAL, 2016). Enzimas são catalisadores biológicos responsáveis pela ocorrência de várias reações bioquímicas, tendo um papel importante em vários aspectos da vida e seus processos. São naturalmente biodegradáveis e atuam aumentando a taxa de reação através da diminuição da energia de ativação, auxiliando na redução dos custos de produção em termos de recursos requeridos pelos processos. Fontes naturais de enzimas incluem plantas, animais e microrganismos, sendo os últimos preferidos por razões 16

17 econômicas e tecnológicas, pois permitem a obtenção de altos rendimentos em pouco tempo de fermentação (PANESAR et al., 2016). De acordo com o estudo da analista Shalini Shahani Dewan, publicado pela BCC Research em 2014, o mercado global de enzimas indústriais foi avaliado em US$4,5 bilhões em 2012 e aproximadamente US$4,8 bilhões em Em 2018, é esperado que o mercado atinja cerca de US$7,1 bilhões, o que representa uma taxa de crescimento de 8,2% ao ano entre 2013 e Em 2014, foi estimado que o Brasil foi responsável por cerca de 6% do faturamento mundial (cerca de US$ ,00) (FERNANDES, 2015), sendo esse setor dominado por empresas européias e norteamericanas, e com forte crescimento nos países do leste asiático, puxados principalmente pelas demandas das indústrias de alimentos e bebidas, que detém 36% do mercado de enzimas indústriais, seguidos pelas indústrias de detergentes, alimentação animal e biocombustíveis (GLOBAL MARKET INSIGHTS, 2017). A maior parte dos custos envolvidos na produção de enzimas indústriais é decorrente principalmente dos substratos e processos de fermentação. Assim, de modo a minimizar os custos de produção e atender às demandas e desafios da indústria, uma grande variedade de microrganismos e substratos agroindústriais de baixo custo têm sido estudados a fim de se promover uma produção mais econômica de enzimas (PANESAR et al., 2016). A principal razão do elevado interesse na utilização de resíduos na produção de enzimas é o custo associado, dado que este é um processo de alto-custo, em que cerca de 28% dos custos operacionais são dedicados à obtenção de matérias-primas (RAVINDRAN e JAISWAL, 2016). A composição do meio de cultura também é um dos fatores mais importantes que influencia o crescimento celular e sua fisiologia, e consequentemente, a formação de produtos. Há situações em que o meio que permite o melhor desenvolvimento do microrganismo pode não favorecer a produção da enzima desejada (OTTONI et al., 2012) e uma das principais linhas de pesquisa que vem sendo exploradas nesse sentido é a de produção de enzimas através da Fermentação Semi- Sólida (FSS) Fermentação Semi-Sólida (FSS) A bioconversão dos resíduos agrícolas e da indústria de alimentos está recebendo crescente atenção, uma vez que essas matérias residuais representam recursos 17

18 possíveis e utilizáveis para a síntese de produtos de alto valor agregado, como enzimas e diferentes metabólitos, e a FSS desempenha um papel essencial no aproveitamento desses resíduos. Os substratos para FSS são, em geral, resíduos ou subprodutos da agroindústria e do mercado de alimentação. Farelos, cascas, sementes, bagaços e outros, são materiais considerados viáveis para a biotransformação. Esta técnica aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos sólidos sem a presença de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície das partículas (PINTO et al., 2005). As principais características que definem a fermentação semi-sólida estão listadas na Figura 2. Figura 2: Principais características da FSS FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA (FSS) O crescimento microbiano ocorre em condições mais próximas às dos habitats naturais Fase sólida atua como fonte de carbono, nitrogênio e demais componentes, além de servir como suporte para o crescimento das células microbianas O meio apresenta alta heterogeneidade e os substratos não estão completamente acessíveis ao microrganismo. O ar, necessário ao desenvolvimento microbiano, deve atravessar os espaços vazios do meio a pressões relativamente baixas. O substrato não deve apresentar aglomeração das suas partículas individuais Fonte: PINTO et al. (2005). O uso de resíduos agroindústriais como meio de cultura para a FSS acarreta numa redução de custos quando comparado ao uso de meios de cultura enriquecidos com sacarose comercial (MUÑIZ-MARQUÉZ et al., 2016). A fermentação semi-sólida é preferida nestes tipos de processo principalmente devido aos custos operacionais associados, que representam até um décimo (1/10) dos custos de uma fermentação submersa. A fermentação semi-sólida também replica as situações naturais no biorreator, o que comprovadamente aumenta o rendimento de produção de enzimas (RAVINDRAN e JAISWAL, 2016). A FSS é aplicada para produção de alimentos, enzimas, e substâncias químicas diversas. O grande potencial é principalmente na produção de enzimas através de fungos filamentosos, os quais têm recebido a maioria das atenções nas pesquisas, pois 18

19 apresentam capacidade de crescimento em baixos níveis de água (DANTAS e AQUINO, 2010) Aspergillus oryzae O filo Ascomycota compreende a maioria dos fungos descritos na literatura, com espécies relacionadas às indústrias alimentícias e farmacêuticas, e ainda organismos patogênicos, e é neste filo que se encontra o ascomiceto Aspergillus oryzae. Esta espécie é um fungo filamentoso, largamente utilizado na produção de alimentos no leste asiático, com aplicações na indústria de derivados de soja, por exemplo. Este microrganismo não só apresenta altas atividades de enzimas como amilases e proteases, como também secreta várias enzimas hidrolíticas (LEE et al., 2016). Sua morfologia caracteriza-se por uma vesícula arredondada com correntes conoidais que se extendem, que aparecem como pelos brancos na superfície do substrato onde o fungo está crescendo (NANAVATY e OGLEDZINSKI, 2015). A U.S. Food and Drugs Administration (FDA) concedeu o status de Generally Recognized as Safe (GRAS, em português Geralmente Reconhecido Como Seguro) a diversos produtos resultantes do metabolismo do Aspergillus oryzae, incluindo diversas preparações de enzimas utilizadas como aditivos da indústria de alimentos, como as α- amilase, hidrolases e proteases secretadas por esse microrganismo (FDA, 2018) Frutooligossacarídeos e as Frutosiltransferases A busca por substâncias benéficas à saúde humana tem impulsionado o desenvolvimento de pesquisas visando o estudo de enzimas por meio de bioprocessos. Um dos principais componentes da indústria de alimentos funcionais são os carboidratos denominados Frutooligossacarídeos (FOS), derivados da sacarose. Os FOS são sintetizados por enzimas chamadas de frutosiltransferases que podem ser encontradas em plantas, bactérias e fungos (PATEL e GOYAL, 2011). Os frutooligossacarídeos são oligômeros de frutose, representados principalmente por 1-kestose (GF2), nistose (GF3) e frutofuranosil nistose (GF4). As unidades de frutosil (F) são unidas entre si e à sacarose por ligações glicosídicas do tipo β(2 1), o que os distingue de outros oligômeros. Podem ser produzidos por meio da reação de transfrutosilação catalisada pela enzima frutosiltransferase (FTase), onde uma molécula de sacarose é hidrolisada e o radical frutosil é transferido para outra sacarose (YUN, 1996). 19

20 Figura 3: Estrutura química dos principais frutooligossacarídeos 1-kestose, nistose e 1-frutofuranosilnistose Fonte: SABATER-MOLINA et al. (2009). Frutooligossacarídeos (FOS), também conhecidos como oligofrutose ou oligofrutanos, são oligossacarídeos que podem ser usados como uma alternativa aos adoçantes artificiais e são considerados fibras dietéticas de baixo valor calórico (MUSSATTO et al., 2012). Devido as suas muitas propriedades funcionais, dado que os mesmos são não-cariogênicos, podem ser usado por pessoas diabéticas, além de causar uma diminuição nos níveis de fosfolipídios, triglicerídeos e colesterol, ajudar na absorção de cálcio e magnésio no trato gastrointestinal e estimular o crescimento de bifidobactérias, tem havido um interesse cada vez maior na aplicação dos FOS em compostos alimentícios e farmacêuticos nos últimos anos. Como consequência, é também de grande interesse desenvolver processos apropriados e economicamente viáveis para a produção de FOS que permitam a obtenção de grandes rendimentos deste produto (MUSSATTO et al., 2009). FOS são hidrossolúveis e apresentam um grau de doçura 0,3-0,6 vezes a da sacarose, a depender de sua estrutura química e do grau de polimerização do oligossacarídeo. São altamente higroscópicos e sua capacidade de reter água é maior do que a sacarose e a mesma do sorbitol. FOS pode substituir a sacarose em muitas de suas propriedades, incluindo solubilidade, pontos de fusão e ebulição e propriedades cristalinas. Foi estimado que o valor calórico dos FOS varia de 1,5 a 2,0 kcal/g, o que representa 40-50% do valor calórico de carboidratos digeríveis tais como a sacarose (SABATER-MOLINA et al., 2009). Têm sido atribuídas aos FOS diversas propriedades prebióticas, dados que a ingestão destes oligossacarídeos estimula o crescimento de bifidobactérias no intestino 20

21 humano. De acordo com a World Gastroenterology Organization (2011), prebióticos são definidos como substâncias alimentares (consistem fundamentalmente em polissacarídeos não-amido e oligossacarídeos não digeridos pelas enzimas humanas) que nutrem um grupo seleto de microrganismos que colonizam o intestino, favorecendo a multiplicação das bactérias benéficas em detrimento das prejudiciais, desempenhando papel importante na saúde como na prevenção de câncer de cólon (DENIPOTE, TRINDADE e BURINI, 2010). Dadas as importantes propriedades apresentadas pelos FOS, há um interesse crescente na pesquisa de novos produtores de enzimas do tipo frutosiltransferase, como também no estudo das condições ótimas para as reações de transfrutosilação, a fim de se obter os maiores rendimentos possíveis de FOS com pureza para aplicações indústriais (OTTONI et al, 2012). A produção de FOS pode ocorrer por via biotecnológica, por meio da ação de enzimas microbianas, consistindo tanto de cadeias lineares como de cadeias ramificadas, com grau de polimerização variando entre 1 e 5 unidades de frutosil (HARTEMINK et al., 1997). Os FOS de origem microbiana são produzidos por transfrutosilação enzimática, a partir da sacarose, sendo essa reação catalisada pelas enzimas β-frutofuranosidase ou frutosiltransferase (FTase). Na literatura observa-se uma divergência entre os autores quanto à denominação da enzima. Alguns se referem às enzimas como frutofuranosidases (E.C ) e outros como frutosiltransferases (E.C ), ainda que oriundas do mesmo microrganismo, como Aspergillus niger. Isso se deve ao fato de que alguns autores utilizam a denominação de frutosiltransferase para diferenciá-la das enzimas hidrolíticas, enquanto outros consideram a atividade de transfrutosilação como uma reação que ocorre na utilização de invertase em altas concentrações de sacarose (YUN, 1996). Contudo, os dois tipos de enzimas microbianas, as hidrolases (glicosidases, EC 3.2.) e as transferases (glicosil-transferase, EC 2.4.), podem, em teoria, sintetizar oligossacarídeos (MONSAN e PAUL, 1995). As enzimas FTase podem ser derivadas de fontes vegetais, bacterianas ou fúngicas, sendo esta última as que apresentam as maiores atividades de transfrutosilação (MUSSATTO et al., 2012), especialmente em fungos dos gêneros Penicillum, Aerobasidium, Fusarium e principalmente Aspergillus. Muitos estudos (MUÑIZ-MARQUÉZ et al., 2016; OTTONI et al., 2012; SANGEETHA et al., 2004) 21

22 apontam a produção de FOS pelo uso de β-frutofuranosidases produzidas por Aspergillus oryzae com alta atividade de frutosiltransferases. Diversos tipos de resíduos alimentares e agroindústriais têm sido estudados para a produção de FTase. Mussatto et al. (2012) avaliaram a produção de FTase metabolizada por Aspergillus japonicus imobilizado em 6 tipos de materiais lignocelulósicos (grãos para produção de cerveja, palha de trigo, sabugo de milho, cascas de grãos de café, rolhas de carvalho e bucha vegetal. Ghazi et al. (2006) estudaram a produção de FTase usando melaço de açúcar de beterraba como substrato e Dorta et al. (2006) investigaram o melaço de cana de açúcar com os microrganismos Aspergillus niger e Aspergillus japonicus O melão (Cucumis melo L) como substrato para produção de enzimas microbianas Os substratos mais utilizados para obtenção de bioprodutos são fontes de carbono, de alta massa molecular, tais como, celulose, amido, pectina, hemicelulose, entre outros. Tal composição está presentes nos resíduos agrícolas. Neste contexto, destaca-se o melão, fruto do meloeiro curcubitácea, originário da Ásia e largamente cultivado em todas as regiões tropicais do mundo e amplamente consumido no Brasil, seja em sua forma in natura, ou como ingrediente no processamento industrial de sucos, iogurtes e sorvetes (MALACRIDA et al., 2006). Entretanto, esse fruto é também um grande gerador de resíduo (casca e semente) pós-processamento, pois sua casca é naturalmente não comestível e o mesmo contém uma grande quantidade de sementes que, apesar de apresentarem potencial nutritivo, constituem material de descarte em indústrias de alimentos e no consumo doméstico (MOURA ROLIM et al., 2018). Segundo o Anuário Brasileiro de Fruticultura 2017 (CARVALHO et al., 2017), estima-se uma ampliação na produção de melão de cerca de 10% ao ano, o que representa em torno de 2 mil novos hectares anuais. Atualmente, o plantio nacional da fruta é de 20 mil hectares, perfazendo produção de 500 mil toneladas. O cultivo deste fruto concentra-se, sobretudo no Nordeste, em especial da Chapada do Apodi, que fica na divisa dos estados do Rio Grande do Norte e do Ceará, sendo o primeiro o estado que mais produz no Brasil, com 250 mil toneladas, seguido do Ceará, com 200 mil toneladas, o que torna esses dois estados responsáveis por 90% da produção brasileira. 22

23 O melão pertence ao gênero Cucumis, sendo que as principais variedades produzidas comercialmente pertencem a dois grupos: C. melo inodorus Naud. e C. melo cantaloupensis Naud. Os frutos do grupo C. melo cantaloupensis Naud. são muito aromáticos, mais doces que os inodoros, porém de baixa conservação pós-colheita. Os frutos são de tamanho médio, com superfície reticulada, verrugosa ou escamosa, podendo apresentar gomos (costelas), e têm polpa de coloração alaranjada ou salmão ou, às vezes, verde. O melão também pode ser comercialmente classificado em diversas categorias, agrupados por tipo com características semelhantes, de acordo com o aspecto da casca, cor, presença ou ausência de suturas quando maduros, cicatrizes, reticulações ou rendilhamento, formato do fruto e cor da polpa (MOURA ROLIM et al., 2018). Uma das variedades mais consumidas e consequentemente que possuem elevada quantidade de resíduo inerente ao seu processamento, é o melão do tipo Cantaloupe. Estudo realizado por Moura Rolim et al. (2018) identificou a composição físico-química de farinhas obtidos a partir de resíduos de melão cantaloupe, destacando que as cascas e sementes deste fruto são potenciais substratos em processos fermentativos, com ênfase ao conteúdo de celulose, hemicelulose, lignina, proteínas e lipídeos (Tabela 1). Tabela 1. Composição centesimal físico-química, em base seca, das farinhas dos resíduos da casca e da semente do melão, variedade reticulatus, após secagem a 80 C/ 24h. Composição em Base Seca Farinha de Casca de Melão Farinha de Semente de Melão Umidade [%] b a Cinzas [g kg -1 ] b a Lipídios [g kg -1 ] a b Proteínas [g kg -1 ] a a Fibras Insolúveis [g kg -1 ] a b Hemicelulose [g kg -1 ] a a Celulose [g kg -1 ] a b 23

24 Lignina [g kg -1 ] a a Fonte: MOURA ROLIM et al. (2018). a,b Valores na mesma linha com letras iguais não diferiram significativamente (p<0,05) no teste de student. Tendo em vista a redução dos impactos ambientais causados pela falta de gerenciamento dos resíduos alimentares gerados nos diversos setores da cadeia produtiva e de distribuição de alimentos, o presente estudo avaliou a produção da enzima frutosiltransferase (FTase) por meio de Fermentação Semi-Sólida utilizando resíduos da casca e sementes de melão Cantaloupe como substrato e o fungo Aspergillus oryzae como microrganismo produtor. 24

25 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Material Para a realização desse estudo, foram utilizados os resíduos de melão Cantaloupe (Cucumis melo L. var. reticulatus), cascas e sementes, provenientes do Restaurante Universitário da UFRN (Campus Natal-RN). Os resíduos foram higienizados e, em seguida, secos em estufa ventilada por 24 horas a 80 ºC, posteriormente triturados em processador doméstico e peneirados para padronização da farinha em granulometria de 16 mesh. Para as análises também foi utilizada amostra desengordurada da farinha de semente de melão. Para este processo, a farinha da semente foi submetida à extração de gorduras com solvente a quente. O solvente utilizado foi o éter etílico e a extração ocorreu por 4 horas a 80 C. Em seguida, a amostra passou por secagem em estufa a 105 C/ 1 hora para evaporação do solvente (Figura 4). Figura 4: Da esquerda para a direita: farinha de casca de melão, farinha de semente de melão integral e farinha de semente de melão desengordurada. Fonte: A autora 4.2. Métodos Produção de Frutosiltransferase (FTase) Microrganismo e sua ativação O agente de fermentação utilizado foi o fungo filamentoso Aspergillus oryzae ATCC 9362, cujos esporos do fungo permanecem armazenados em areia a -20ºC. A ativação do microrganismo se deu pela retirada duas alçadas seguidas de inoculação em placas contendo meio de cultivo ágar batata dextrose (PDA) (ph 5,5). Estas foram incubadas a 30 C por 7 dias em estufa bacteriológica (Figura 5) e, em seguida, foram utilizadas para etapa de proliferação dos esporos no meio com sabugo de milho estéril. 25

26 Figura 5: Aspergillus oryzae ativado em meio Agar Dextrose Batata após 7 dias de incubação a 30º C. Fonte: A autora Proliferação dos esporos O meio sabugo consistiu de 4,6 g de sabugo de milho seco e moído (aproximadamente 3,0 mm), adicionado a Erlenmeyers de 125 ml, vedado com tampão de algodão e esterilizado em autoclave a 121ºC por 1 hora. Antes da inoculação dos esporos, 6,0 ml de uma solução umidificante (solução de nutrientes) foram adicionadas ao sabugo. Esta solução de nutrientes é preparada através da mistura de 100 ml de solução de fosfato de potássio monobásico 200 g/l (chamada de solução A), 100 ml de solução B (3,96 g de sulfato de zinco heptahidratado mais 4,6 g de sulfato de ferro II heptahidratado) e 50 ml de solução 56 g/l de peptona. As soluções foram autoclavadas (15 min a 121 ºC), e posteriormente 0,20 ml da solução A e 0,025 ml da solução B foram adicionadas aos 50 ml de solução peptonada. A inoculação do microrganismo se deu pela transferência de 1,0 ml de solução Tween 80 a 0,2% (p/v) para as placas contendo o fungo. Com o auxílio de uma ponteira estéril, raspou-se a superfície do meio com o objetivo de descolar os esporos aderidos ao meio PDA. A partir daí, 1,0 ml da solução de Tween contendo esporos foi coletada e transferida para o meio com sabugo, com o cuidado de distribuí-lo bem por todo o substrato, sendo então incubados em estufa incubadora BOD (Biochemical Oxygen Demand) a 30 C por cinco dias (Figura 6). 26

27 Figura 6: Propagação do fungo Aspergillus oryzae em meio contendo sabugo de milho estéril após 5 dias de incubação a 30 ºC. Fonte: A autora Após esse período foi obtida a solução de esporos, pela adição de solução com Tween 80 a 0,2% (p/v) sob agitação. A contagem dos esporos foi feita utilizando a câmara de Neubauer, conforme estudo prévio realizado por Moura Rolim et al. (2018), que estabeleceram concentração de esporos de 1, esporos/g de meio sólido Fermentação semi-sólida (FSS) As fermentações foram realizadas em Erlenmeyer de 250 ml de volume contendo 5,0g de material composto por farinha de casca de melão (M1), farinha de semente de melão (M2), e farinha de semente de melão desengordurada (M3) (Figura 7). Figura 7: Meio para Fermentação Semi sólida contendo farinha de semente de melão integral (esquerda) e desengordurada (à direita). Fonte: A autora 27

28 Às amostras, adicionou-se 10 ml de solução salina nutriente de composição especificada nos quadros 2.a, 2.b e 2.c. Antes da inoculação, os meios foram suplementados com 5 ml de solução de frutose 10% e 10 ml de solução de sacarose 40%, uma vez que as reações de transfrutosilação acontecem pela transferência de resíduos frutosídicos para as moléculas de sacarose, em altas concentrações de sacarose (KURAKAKE et al., 2010). Previamente foram realizados experimentos para a determinação da relação umidade e atividade de água das farinhas. Desta forma, para o processo de fermentação foram adicionados 15 ml de água destilada estéril tanto para o meio contendo farinha de casca como para o meio contendo a farinha da semente. Por fim, foram adicionados 187 μl do inóculo contendo a concentração inicial desejada de 1, esporos/g de meio sólido (MOURA ROLIM et al., 2018). A composição dos meios está descrita na Tabela 2. Tabela 2: Composição dos meios contendo farinha da casca de melão (M1), farinha de semente de melão (M2) e farinha de semente de melão desengordurada (M3) Componente Farinha de Resíduo de Melão (M1, M2 ou M3) Nitrato de amônio Fosfato de potássio monobásico (K 2 HPO 4 ) Cloreto de sódio (NaCl) Extrato de levedura Uréia Solução de sacarose (40%) Solução de frutose (10%) Quantidade 5,0 g 0,125 g 0,025 g 0,025 g 0,250 g 0,250 g 10 ml 5 ml A cinética do processo foi acompanhada por um período de 7 dias à temperatura de 45 ± 2 ºC em incubadora orbital, sendo realizadas amostragens a cada 24 horas. O ph dos meios foi de 5,5 para o meio contendo farinha de casca e 6,0 para o meio contendo farinha de semente. A cada intervalo de 24 h foi realizada etapa de extração do complexo enzimático e, em seguida, os extratos foram medidos a atividade hidrolítica da FTase, açúcares redutores totais e proteínas totais. 28

29 Extração das enzimas A extração das enzimas ao término da fermentação ocorreu por meio da adição de 15mL, para os meios contendo farinha de semente integral e semente desengordurada, e 25mL para os meios contendo farinha de casca de melão, de solução tampão citrato de sódio (200mM, ph 4,8) por grama de resíduo utilizado no processo fermentativo, agitando-se em shaker a 150 rpm por 2 horas. A separação de células e do caldo contendo as enzimas foi feita por filtração com papel de filtro, o material filtrado foi então centrifugado por 10 minutos a 3500 rpm à 10 C. O sobrenadante foi recuperado e armazenado a -18ºC para posterior análise das atividades enzimáticas. Os ensaios da atividade enzimática foram realizados em triplicata Determinação da atividade hidrolítica da enzima Frutosiltransferase (FTase) A atividade FTase foi estimada medindo-se a quantidade de glicose produzida a partir da sacarose. A atividade enzimática foi determinada em um meio de reação contendo 40% de sacarose em tampão citrato de sódio (200 mm, ph 4,8), acrescido de 1,0 % (v/v) da suspensão enzimática, incubando-se a 50 C. Os açúcares redutores foram quantificados por meio do método descrito por Miller (1959), o qual consiste em um método colorimétrico para quantificação de açúcares redutores, envolvendo a reação da amostra com o reagente DNS (ácido dinitrossalicílico). A curva padrão foi preparada com soluções padrão de glicose, com concentrações de (1,0μmol/mL- 20,0μmol/mL), com intervalos de 0,2μmol/mL, e a equação determinada por regressão linear. Para a atividade hidrolítica da FTase, 0,5 ml do extrato de enzima, diluídos em 10 vezes, foi adicionado ao tubo de ensaio juntamente com 0,5 ml de tampão citrato de sódio 200 mm (ph 4,8) e 0,5 ml de sacarose 40%, que serviu como substrato para essa reação. Um controle foi preparado contendo 1,0 ml da solução tampão e 0,5 ml de sacarose. Os tubos foram levados ao banho-maria a 50 C por 10 min, e a reação foi parada pela adição de 0,5 ml de reagente DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). Os tubos de reação, controles e o branco (realizado para zerar o espectrofotômetro utilizando reagente DNS e o tampão) foram aquecidos a 100 C por 5 minutos, resfriados em banho de gelo, e tiveram seus volumes completados para 5 ml com água destilada. Após agitação em Vórtex, foi realizada a leitura da absorbância a 540 nm em espectrofotômetro (Bel Photonics modelo S-05). 29

30 A atividade enzimática foi expressa em UI/g (μmol de produto liberado/g de substrato), conforme equações abaixo: [Enz] ( μmol ) = Concentração de glicose liberada (curva padrão) Eq. 1 ml [Enz] ( μmol μmol [Enz] min ) = ( ml ) Volume total da mistura reacional (ml) Tempo (min) Eq. 2 [Enz] ( UI μmol ml ) = [Enz]( min ) Volume total da mistura reacional (ml) Eq. 3 [Enz] ( UI UI [Enz] g ) = ( ml ) Volume do tampão (ml) Massa de substrato (g) Eq. 4 De acordo com os dados encontrados por Moura Rolim et al. (2018) para a composição centesimal da farinha de semente de melão, a qual apresentou cerca de 25% de conteúdo lipídico, foi também realizada fermentação semi-sólida na amostra da semente de melão desengordurada para avaliação da atividade de FTase, seguindo o mesmo protocolo experimental descrito anteriormente Determinação das Proteínas totais A análise de proteínas dos extratos fermentados seguiu a metodologia descrita por Bradford (1976). O reagente de Bradford foi preparado dissolvendo-se 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 em 50 ml de etanol 95%, e adicionando lentamente 100 ml de ácido fosfórico concentrado. A solução obtida foi diluída em balão volumétrico de 1L com água destilada, agitada e deixada em repouso por 24h. Posteriormente a solução foi filtrada sob vácuo por um filtro de papel para retirada do corante não solubilizado, partículas e eventuais impurezas. Para quantificação de proteínas totais misturou-se 3,0 ml do reagente Coomassie com 100 μl da amostra (filtrado referente à extração da enzima após fermentação semi-sólida) com homogeneização em aparelho vórtex, e incubada por 45 min. Após o tempo de incubação, a densidade óptica foi lida a 595 nm, contra um branco (3,0 ml de reagente Bradford + 100,0 μl de água destilada). Para determinação da concentração de proteína, uma curva de calibração foi preparada utilizando Albumina de Soro Bovino (BSA), como proteína padrão. Para isso, foi pesado 1,0 g de BSA que foi diluído em 1,0 L de água destilada, sob agitação magnética. Concentrações 30