USO DA TÉCNICA DE HISTOGRAMA EM ESCALA DE CINZA PARA AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO MAMÁRIO DE ANIMAIS LEITEIROS

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1 USO DA TÉCNICA DE HISTOGRAMA EM ESCALA DE CINZA PARA AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO MAMÁRIO DE ANIMAIS LEITEIROS Ariane Dantas 1, Michel de Campos Vettorato 2, Eunice Oba 3, Vânia Maria Vasconcelos Machado 4, Murilo Gomes Soutello Charlier 5 1 Doutoranda em Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Universidade Estadual Paulista (UNESP/FMVZ).dantas.vet@gmail.com 2 Mestrando em Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Universidade Estadual Paulista (UNESP/FMVZ) 3 Docente do Programa de Pós-graduação de Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Universidade Estadual Paulista (UNESP/FMVZ) 4 Docente do Programa de Pós-graduação de Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Universidade Estadual Paulista (UNESP/FMVZ) 5 Mestre em Biotecnologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Universidade Estadual Paulista (UNESP/FMVZ) 1. INTRODUÇÃO A glândula mamária é uma glândula cutânea modificada, cuja função nas fêmeas é a síntese e secreção de leite. Está presente em todos os mamíferos em número, localização, tamanho e conformação variáveis, segundo as diferenças anatomorfológicas de cada espécie (DYCE et al., 2010). Quanto ao desenvolvimento mamário, este inicia-se no período pré-natal e persiste ao longo de toda a vida reprodutiva do animal. Ocorre de forma dinâmica e é compreendido por etapas bem definidas, nas quais acontecem mudanças morfofuncionais que preparam a glândula para a lactação (DAVIDSON; STABENFELDT, 2014). A compreensão do conhecimento do desenvolvimento da glândula mamária de animais leiteiros é fundamental, pois permite a ampliação do conhecimento de princípios teóricos básicos e consequentemente o bom uso de práticas biotecnológicas. Dessa forma, a ultrassonografia apresenta-se como uma das metodologias importante para avaliar esse tipo de tecido, uma vez que proporciona a visualização em tempo real em escala de cinza além de fornecer imagens bidimensionais. Essa técnica tem sido descrita de forma eficaz em vacas, ovelhas, porcas e até mesmo em cadelas (FASULKOV, et al., 2012).

2 Além disso, através do processamento de imagens geradas pela ultrassonografia, pode-se elaborar histogramas em escala de cinza, os quais possibilitam a avaliação quantitativa da ecotextura e ecogenicidade de diversos tecidos, fornecendo informações importantes quanto as características estruturais dos tecidos (VESCOVI et al., 2009). No entanto, o uso dessa técnica como uma ferramenta complementar para ampliação do conhecimento do desenvolvimento do tecido mamário de animais leiteiros é escasso, porém de grande interesse para a atividade leiteira. Dessa forma, esta revisão tem como objetivo demonstrar os princípios e aplicações do histograma em escala de cinza na avaliação de imagens da glândula mamária de animais leiteiros, bem como identificar relatos atuais da literatura sobre o tema. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Foi realizado um levantamento bibliográfico sobre a utilização da técnica de histograma em escala de cinza para a avaliação do desenvolvimento mamário em animais leiteiros por meio da ultrassonografia. Para o seu desenvolvimento foram utilizados livros, teses, dissertações, monografias, publicações online, e periódicos publicados nos últimos cinco anos, cuja quais foram localizados em sites de busca como o Google Acadêmico, Scielo, Bireme e Pubmed por meio das palavras chaves: histograma, desenvolvimento mamário e animais leiteiros. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1. Glândula mamária A glândula mamária é um órgão especializado, cuja função é a síntese e secreção de leite e é formada por duas estruturas principais: o parênquima mamário e o estroma. O parênquima mamário origina-se da ectoderme e é composto pelos ductos e alvéolos, enquanto que o estroma deriva-se do mesoderma e é constituído por vasos sanguíneos e linfáticos, linfonodos, nervos e tecido adiposo. Os alvéolos são as unidades funcionais de produção de leite da glândula mamária durante a lactação (DYCE et al., 2010). O estroma está presente envolvendo e acomodando as estruturas intramamárias, bem como favorecendo o desenvolvimento do parênquima, uma vez que alguns hormônios e fatores de crescimento que modulam o desenvolvimento mamário são produzidos no tecido adiposo presente na glândula (HOVEY; AIMO, 2010). O desenvolvimento mamário apresenta padrão dinâmico, passando por diversas mudanças morfofuncionais, tais como o tamanho, número, e atividade preparando-se

3 para a lactação (ROWSON et al., 2012). A maior parte do desenvolvimento da glândula mamária ocorre durante a gestação, mais precisamente na etapa final (AKERS et al., 2000). Portanto, para que o desempenho e, consequentemente, a eficiência produtiva de animais leiteiros possam ser melhorados, é fundamental compreender os fatores envolvidos no desenvolvimento e diferenciação mamária Histograma em escala de cinza A ultrassonografia representa uma ferramenta útil de pesquisa, uma vez que é um método simples, indolor, não invasivo, dinâmico, eficaz, preciso e seguro tanto para o animal quanto para o operador. Outras vantagens desse método é a portabilidade do aparelho e a possibilidade de interpretação rápida da maioria dos resultados (HUDA; SLONE, 2003). Além disso, não requer a eutanásia do animal, logo é um método adequado para estudo e avaliação in vivo de informações anatômicas e características morfológicas de diversas estruturas. Por não utilizar radiação ionizante pode ser empregada de forma repetida sem efeitos nocivos ao animal. Além disso, permite a obtenção de informações em tempo real da estrutura analisada (DESCOTEAUX et al., 2010). Contudo, a análise de seus achados, é subjetiva, o que acaba gerando muitas divergências, tanto pela variabilidade de aparelhos de ultrassom, quanto pela experiência do operador. Por isso, é de extrema importância que existam técnicas complementares, que auxiliem à interpretação dos diagnósticos ultrassonográficos. Assim, o histograma em escala de cinza (HEC), apresenta-se como método prático e eficiente e que possibilita a obtenção de resultados mais fiéis a realidade (PEREIRA et al., 2011). O HEC consiste na mensuração da quantidade e distribuição da frequência de tonalidades de cinza que formam a imagem ultrassonográficas de uma determinada região analisada, fornecendo informações quantitativas, tanto sobre a ecogenicidade quanto a ecotextura (VESCOVI et al., 2009). Segundo Ferreira e Rasband (2011) as imagens de ultrassom são formadas por pixels, que são representados numericamente em uma escala de 255 tons de cinza, que variam de acordo com sua intensidade de brilho, sendo 0= preto e 255= branco. Para avaliação da ecogenicidade pelo HEC é necessário a mensuração do nmost, que se refere ao número de pixels que mais se repete na imagem visualizada, do nall,

4 que representa os pontos luminosos totais (pixels) de uma região pré-selecionada da imagem, o SD, que consiste no desvio padrão e trata-se da amplitude do eco, e o lmean, que representa o valor médio do número de tons de cinza que formam o local avaliado na imagem. Já a ecotextura é avaliada através da relação nmost/nall, sendo que a ecotextura será homogênea quando a relação (nmost/nall) for maior que o valor do desvio padrão dos tecidos, e heterogênea quando essa relação for menor (ABRÀMOFF et al., 2004). Ressalta-se ainda que os valores de lmean indicam ecogenicidades dos tecidos, sendo que quanto menor o seu valor, mais baixa será a ecogenicidade (SANTOS et al., 2009). Assim, a amplitude dos pixels pode ser definida como ecogenicidade, ou seja, é o quanto uma estrutura retém a onda sonora do ultrassom. Estruturas que tem alto poder de refletir as ondas sonoras (tecido adiposo) são definidas como hiperecóicas e, portanto, apresentam maiores valores de pixels. As imagens com baixa capacidade de reflexão são denominadas como hipoecóicas e tem os menores valores de pixels (ABRÀMOFF et al., 2004). Existem várias ferramentas de software com a função do HEC. De acordo com Ferreira e Rasband (2011), atualmente, muitos dos estudos utilizam o Image J como método de análise (por meio da média, moda mediana, desvio padrão total de pixels por região de análise, valor de pixel máximo valor de pixel mínimo entre outros). Albino et al. (2014) utilizaram esse programa para avaliar o desenvolvimento da glândula mamária em novilhas da raça Holandesa por meio da ultrassonografia e realça em seu trabalho que essa ferramenta combinada com a ultrassonografia possibilitou uma estimativa melhor da concentração de tecido adiposo na glândula mamaria, permitindo maior elucidação do efeito do manejo nutricional no desenvolvimento mamários de fêmeas pré-púberes. Em estudo feito por Petridis et al. (2014) com ovelhas em lactação para avaliação da diferenciação do efeito do tipo de desmama sobre a involução mamária de ovelhas, o uso do Image J permitiu com sucesso o acompanhamento da remodelação do tecido mamário de ovelhas no período seco. Barbagianni et al. (2015) em trabalho realizado também com o uso do programa para avaliação da glândula mamária de ovelhas gestantes mestiças Chios saudáveis e com toxemia da gestação e obtiveram excelente resultado de padrões de referência para interpretação de características normalidade e anormalidades da estrutura mamária durante a lactogênese.

5 Existem alguns aparelhos de ultrassom que já vem com a função do HEC disponível, porém, há ainda a necessidade da padronização de valores para que seu uso possa ser mais difundido na prática clínica e não somente no meio acadêmico, como é visto atualmente (VESCOVI et al., 2009). Assim, o uso dessa técnica como uma ferramenta complementar para ampliação do conhecimento do desenvolvimento dos tecidos é importante e de grande interesse a medicina veterinária (DANTAS et al., 2014), sendo de fundamental importância os estudos sobre esse tema. 4. CONCLUSÕES O histograma em escala de cinza demonstrou por meio dessa revisão ser um método prático e eficiente, o qual permite relacionar a fase de crescimento com o desenvolvimento mamário de animais leiteiros, podendo ser utilizado como ferramenta complementar para a seleção de animais jovens especialmente com características leiteiras, além de evitar a eutanásia do animal nas avaliações in vivo. 4. REFERÊNCIAS ABRÀMOFF, M. D.; MAGALHÃES, P. J.; RAM, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International, v. 11, n. 7, p , AKERS, R. M. et al. Local IGF-I axis in peripubertal ruminant mammary development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, New York, v. 5, p , ALBINO et al. Mammary gland development of dairy heifers fed diets containing increasing levels of metabolisable protein: metabolisable energy. Journal of Dairy Research, v. 82, p , BARBAGIANNI, M. S. et al. Increased incidence of peri-parturient problems in ewes with pregnancy toxaemia. Small Ruminant Research, v. 132, p , COLLIER, R. J., ANNEN-DAWSON, E. L.; PEZESHKI, A. Effects of continuous lactation and short dry periods on mammary function and animal health. Animal, Cambridge, v. 6, p , DANTAS, A. et al. Sonographic evaluation of echogenicity and echotexture of the mammary gland of prepubertal ewe lambs by histogram with gray levels. In: European Veterinary Diagnostic Imaging, 2014, Utrecht. Proceedings Book EVDI 2014 Utrecht The Netherlands, DAVIDSON, P. A.; STABENFELDT, H. G. A glândula mamária. In: KLEIN, G. B. Cunningham tratado de fisiologia veterinária. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, cap. 6, p DESCOTEAUX, L.; GNEMMI G.; COLLOTON, J. Principles and recommendations, essential concepts, and common artifacts in ultrasound imaging. In: Practical Atlas of Ruminant and Camelid Reproductive Ultrasonography, Blackwell Publishing, p. DYCE, K. M.; SACK, W. O.; WENSING, C. J. G. Pelve e órgãos reprodutivos dos ruminantes. In:. Tratado de anatomia veterinária. 4. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, cap. 4, p FASULKOV, I. R Ultrasonography of the mammary gland in ruminants: A review. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, Stara Zagora, v. 15, p. 1-12, 2012.

6 FERREIRA, T.; RASBAND, W. S. ImageJ User Guide IJ 146 imagejnihgov/ij/docs/guide HOVEY, R. C.; AIMO, L. Diverse and active roles for adipocytes during mammary gland growth and function. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, New York, v. 15, p , HUDA, W.; SLONE, R. Ultrasound, in Review of Radiologic Physics. ed. Philadelphia: Lippincot Williams and Wilkins p. PEREIRA, B. J. et al. Avaliação dos efeitos da terapia com prednisona em cães utilizando análises ultrassonográfica, citopatológica e histopatológica. Revista Ceres, Viçosa, v. 58, p , PETRIDIS, I. G., P. G. et al. Ultrasonographic findings in the ovine udder during involution. Journal of Dairy Research. v. 81, p , ROWSON, A. R. et al. Growth and development of the gland mammary of livestock: A vire table barnyard of opportunities. Seminars in Cell Development Biology, London, v. 23, p , SANTOS, W. G. et al. Ultrassonografia quantitativa do fígado em gatos com tirotoxicose induzida. Brazilian Journal Veterinary Research Animal Science, São Paulo, v. 46, n. 6, p , VESCOVI, L. A. et al. Ultrassonografia quantitativa do baço de gatos normais.veterinária em Foco, Canoas, p. 4-10, 2009.