UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Soroprevalência de Rickettsia spp. em equídeos e pesquisa de Rickettsia spp. em carrapatos Amblyomma cajennense e Dermacentor nitens da região do Pantanal Mato-grossense, Brasil Alvair da Silva Alves Cuiabá-MT 2014

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Soroprevalência de Rickettsia spp. em equídeos e pesquisa de Rickettsia spp. em carrapatos Amblyomma cajennense e Dermacentor nitens da região do Pantanal Mato-grossense, Brasil Autor: Alvair da Silva Alves Orientador: Prof. Dr. Richard Pacheco de Campos Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. CUIABÁ-MT 2014

3 Dados Internacionais de Catalogação na Fonte. S586s Alves, Alvair da Silva. Soroprevalência de Rickettsia spp. em equídeos e pesquisa de Rickettsia spp. em carrapatos Amblyomma Cajennense e Dermacentor nitens da região do Pantanal Mato-grossense, Brasil / Alvair da Silva Alves f. : il. color. ; 30 cm. Orientador: Richard de Campos Pacheco. Co-orientador: Luciano Nakazato. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Cuiabá, Inclui bibliografia. Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.

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6 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho especialmente aos meus pais Armando e Rosemir, a minha avó Gildete, ao meu irmão Helder e as minhas irmãs Grazielly e Mirella, desejo que um dia vocês saibam que cada passo que eu dou é pensando em vocês e por vocês, que a minha vitória não é só minha, mas de vocês também. Dedico também a todos os pesquisadores que contribuíram e contribuem dedicando parte do seu tempo para a evolução da ciência e do mundo.

7 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente ao criador de todo universo, é ele que me guia, mostrando sempre o melhor caminho, me ajudando em todas as decisões, concedendo saúde e serenidade. Ao meu orientador professor Richard por todos os momentos dedicados a execução deste trabalho, aos conhecimentos e experiências transmitidas durante todo este período de mestrado. Quero que saiba que tenho muito orgulho de ser teu orientado (não digo isso porque estou entregando a dissertação com um pouquinho de atraso não tá hahaha), mas sim pelo real papel de ORIENTAR que o senhor desempenha, cobrando e corrigindo quando necessário, durante esses dois anos construímos uma amizade, e diria também um cuidado fraternal, demos muitas risadas, contamos histórias e quando necessário me dava uns puxões de orelha, quem te conhece sabe que tens por fora esse jeito durão de ser mas que o coração é imenso. Meu muito OBRIGADO. Aos meus amigos de laboratório que contribuíram no dia-dia para o meu crescimento pessoal e profissional, me ajudando na elaboração dos projetos e execução dos trabalhos, tornaram-se parte da minha família durante todo esse tempo, afinal de contas passávamos mais tempos juntos no laboratório do que com a própria família, e às vezes dando uma esticadinha até no Seu Manoel né Ísis, Elenice, Rafael, Marcus, Letícia, Cris e Erlichinha? Meu agradecimento especial a Andréia que esteve ao meu lado durantes todas as coletas e sempre muito solícita em todos os momentos. Valeu galera! Aos professores da pós-graduação que não medem esforços para o crescimento e consolidação do curso, especialmente aos professores: Daniel Aguiar que é parceiro nosso e um dos autores do projeto, Váleria Dutra e Luciano Nakazato que permitiram a minha frequência em seus laboratórios e utilização dos equipamentos. Ao professor Marcelo Labruna pelo apoio e captação de recursos financeiros junto aos órgãos de fomento. Aos meus amigos pessoais pelos momentos de descontração que geralmente não são poucos e que sempre recorro quando preciso de um ombro amigo ou uma boa conversa, a vocês Odérmisson, Leandro, Sidney, Rose, Gisele, Érica, Heid, Mateus, Brunno, Alexandre, Silvana, Carolina, Rosa e a minha segunda mãe Dausinéia o meu muito Obrigado. As famílias que nos recebiam de portas abertas no município de Poconé durante os dois anos para realização das coletas. A Dona Doca e Seu Adolfo pelo carinho e ajuda durante nossas semanas de estadia na base de estudos avançados da UFMT. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGVET), a UFMT e a CAPES pela bolsa.

8 EPÍGRAFE Apesar de todas as dificuldades da vida o meu chão eu fiz de mola, posso cair todos os dias... o resultado da minha queda é o impulso!

9 RESUMO Soroprevalência de Rickettsia spp. em equídeos e pesquisa de Rickettsia spp. em carrapatos Amblyomma cajennense e Dermacentor nitens da região do Pantanal Mato-grossense, Brasil O objetivo do estudo foi estimar a infecção Rickettsial ( Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, ' Candidatus R. amblyommii ', Rickettsia rhipicephali e Rickettsia bellii ) em eqüídeos, e carrapatos de uma região do Pantanal do Brasil. Amostras de 547 eqüídeos (500 cavalos e 47 asininos e muares ) foram avaliados pelo teste de imunofluorescência indireta (IFI ). Um total de 665 adultos e 106 pools de ninfas de Amblyomma cajennense F.s1, 10 carrapatos Dermacentor nitens Neumann, e 88 pools de larvas de Amblyomma sp. foram testadas por PCR. No geral 337 ( 61,6 % ) eram reactivos equídeos ( título 64 ) para pelo menos um antigénio de Rickettsia spp. Os valores de prevalência de Rickettsia foram 66%, e foram observados os maiores títulos de ponto final para 'Ca. R. amblyommii '. Na PCR, 3 ( 0,45% ) do fêmeas de A. cajennense s.l. foram positivos para 'Ca. R. amblyommii '. Para os carrapatos imaturos foram observados uma taxa mínima de infecção de 0,75% e 0,34% para ninfas e larvas, respectivamente. As amostras positivas de carrapatos tiveram um fragmento do gene 16S rrna sequenciados e as sequências apresentaram 99% de semelhança com Amblyomma sculptum Berlese. Este estudo relata uma ampla distribuição de Rickettsia entre equídeos, sugerindo o possível envolvimento, pela primeira vez, de A. sculptum na transmissão de 'Ca. R. amblyommii ' Palavras Chaves: Equídeos, Rickettsia amblyommii; Amblyomma Sculptum; Detecção Molecular; Sorologia; Dermacentor nitens; Pantanal.

10 Abstract Seroprevalence of Rickettsia spp. in equine research and Rickettsia spp. in Amblyomma ticks Amblyomma and Dermacentor nitens of the Pantanal region, Brazil The aim of the study was to estimate the rickettsial (Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, Candidatus R. amblyommii, Rickettsia rhipicephali, and Rickettsia bellii) infection in equids, and ticks of a Pantanal region of Brazil. Sera of 547 equids (500 horses and 47 mules, and donkeys) were evaluated by indirect immunofluorescence assay (IFA). A total of 665 adults and 106 nymphal pools of Amblyomma cajennense F. s.l., 10 Dermacentor nitens Neumann ticks, and 88 larval pools of Amblyomma sp. were tested by PCR. Overall 337 (61.6%) equids were reactive (titer 64) to at least one antigen of Rickettsia spp. The prevalence values for Rickettsia were 66%, and the highest endpoint titers were observed for Ca. R. amblyommii. In PCR 3 (0.45%) female of A. cajennense s.l. were positive for Ca. R. amblyommii. For the immature ticks were observed a minimum rate of infection of 0.75% and 0.34 % for nymphs and larvae, respectively. Positive samples of ticks have had a fragment of the 16S mitochondrial rrna gene sequenced and sequences showed 99% similarity to Amblyomma sculptum Berlese. This study reports a wide distribution of Rickettsia among equids, suggesting the possible involvement, for the first time, of A. sculptum in transmitting Ca. R. amblyommii. KEY WORDS Equids, Pantanal mato-grossense, Amblyomma sculptum, Candidatus Rickettsia amblyommii

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14 11 1. INTRODUÇÃO As riquetsioses caracterizadas como zoonoses estão entre as mais antigas doenças transmitidas por carrapatos. Entretanto, nos últimos 25 anos, a importância e conhecimento dos patógenos transmitidos por carrapatos cresceu drasticamente, fazendo este complexo de doenças um paradigma ideal para o entendimento de infecções emergentes e reemergentes. Várias espécies de Rickettsia que foram consideradas não patogênicas por décadas, agora estão associadas com infecções humanas e novas espécies de Rickettsia, de patogenicidade desconhecida, continuam sendo detectadas e isoladas de carrapatos ao redor do mundo (PAROLA et al., 2013). O Pantanal é composto por três biomas diferentes: amazônica, cerrado e chaco (paraguaio e argentino). Durante a seca, que coincide com o inverno, a temperatura pode chegar a 0 C, influenciada pelos ventos que chegam do sul do continente. A vegetação do Pantanal não é homogênea e há um padrão diferente de flora de acordo com a altitude. Nas partes mais baixas, predominam as gramíneas, que são áreas de pastagens naturais para o gado. A vegetação de cerrado, com árvores de porte médio entremeadas de arbustos e plantas rasteiras, aparece nas alturas intermediárias. A poucos metros acima das áreas inundáveis, ficam os capões de mato ou cordilheiras. Nas altitudes maiores, o clima árido e seco torna a paisagem parecida com a da caatinga (ALHO et al., 1987). A biodiversidade observada na região do Pantanal pode propiciar a ocorrência de enfermidades infecciosas, principalmente as transmitidas por artrópodes (BORGES et al., 2013). Pesquisas de vigilância de agentes do gênero Rickettsia são necessários para entender quais espécies estão presentes em uma região, para mostrar a sua distribuição, e para delimitar o risco potencial para a saúde. O estudo investigou infecção por Rickettsia spp em carrapatos vida livre e de animais domésticos, e em soro sanguíneo de equídeos, utilizando técnicas moleculares e por meio da pesquisa de anticorpos, respectivamente.

15 12 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Rickettsia spp. Rickettsia é uma bactéria intracelular obrigatória, pertencente à família Rickettsiaceae e ordem Rickettsiales (RAOULT E ROUX, 1997). Sua transmissão tem sido associada com carrapatos desde o inicio do século 20, quando eles foram incriminados como prováveis hospedeiros e transmissores da espécie Rickettsia rickettsii, considerada altamente patogênica para seres humanos (RICKETTS, 1909). Tradicionalmente, as riquétsias patogênicas estão classificadas em dois grupos: o Grupo do Tifo (TG), composto pela Rickettsia prowazekii e Rickettsia typhi, cujos vetores são piolhos (Pediculus humanus) e pulgas, respectivamente; e o Grupo da Febre Maculosa (GFM), formado por mais de 20 espécies, no qual os carrapatos são incriminados como vetores principais (RAOULT E ROUX, 1997). Por outro lado, outras riquétsias têm apresentado particularidades antigênica e genéticas que impedem a inclusão no grupo do GT ou no grupo GFM. Nesta situação estão as espécies Rickettsia bellii e Rickettsia canadensis, descritas em carrapatos do continente americano (LABRUNA et al., 2007c; MCKIEL et al., 1967). Com o descobrimento de uma variedade de novas riquétsias, em diferentes ordens de artrópodes terrestres e, também com as análises genéticas de plasmídeos como é o caso da Rickettsia felis, o gênero tem sido reclassificado em diferentes grupos: GT, GFM, Grupo Transicional (GTR), Grupo Bellii (GB), Grupo Canadensis (GC) e outros grupos básicos (GILLESPIE et al., 2007; WEINERT et al., 2009). R. rickettsii é a mais patogênica espécie de Rickettsia do mundo (MERHEJ E RAOULT, 2011). A doença causada pela R. rickettsii foi relatada pela primeira vez nos Estados Unidos, onde foi denominada de Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (FMMR), na qual o pesquisador Howard Taylor Ricketts isolou a bactéria em 1909 (RICKETTS, 1909). Diferentes espécies de carrapatos tem sido incriminados como vetores de R. rickettsii em diferentes áreas geográficas. Atualmente os carrapatos Dermacentor andersoni e Dermacentor variabilis são os principais vetores nos Estados Unidos (DUMLER E WALKER, 2005), enquanto o Amblyomma cajennense tem sido considerado o mais importante vetor na América do Sul. No Brasil Amblyomma aureolatum também é reconhecido como vetor dentro

16 13 da área metropolitana de São Paulo (PINTER E LABRUNA, 2006), onde Rhipicephalus sanguineus é um vetor suspeito (MORAIS-FILHO et al., 2009). Recentemente, Pacheco et al. (2010) realizaram o isolamento desta bactéria em R. sanguineus, o que reforça a ideia da existência, aqui no país, de mais esse vetor. Adicionalmente, Piranda et al. (2011) conseguiram demonstrar, experimentalmente, que o cão pode atuar como hospedeiro amplificador da R. rickettsiii para o carrapato R. sanguineus. Além disso, esse estudo relata que ninfas e adultos de R. sanguineus transmitiram com sucesso a bactéria às cobaias, confirmando a existência de uma competência vetorial, por parte desse carrapato após aquisição da infecção, a partir de cães riquetsêmicos. Taxas de doença e mortalidade agudas estão entre 30 e 40% (ANGERAMI et al., 2006). De 1985 até julho de 2011 foram confirmados 440 casos de febre maculosa brasileira (FMB) e 152 óbitos em 79 municípios do Estado de São Paulo. Em 2001, quando a FMB passou a ser considerada doença de notificação compulsória em todo o País, os únicos estados que mantinham um programa ativo de vigilância epidemiológica para a FMB eram São Paulo e Minas Gerais. Segundo dados do Ministério da Saúde, entre os anos de 1997 e 2010, houve a notificação no Brasil de 868 casos confirmados da doença, dentre os quais 227 óbitos, distribuídos entre São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de janeiro, Bahia, Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Distrito Federal (PINTER et al., 2011). Diversos gêneros de carrapatos, incluindo Dermacentor sp., Rhipicephalus sp. e Amblyomma sp., são importantes reservatórios de R. rickettsii na natureza (BURGDORFER, 1988; DUMLER e WALKER, 2005). Tais carrapatos desempenham esse papel devido à capacidade de transmitir a bactéria pelas vias transovariana (transmissão da bactéria entre sucessivas gerações) e transestadial (sobrevivência do agente em todos os estágios de vida). Assim, o carrapato permanece infectado durante toda a vida e é capaz de disseminar o organismo para os novos estádios e as novas gerações. Entretanto, apenas esse mecanismo não é suficiente para manter a bactéria ativa ao longo do tempo, tendo em vista o efeito deletério que a mesma causa nos carrapatos (SOARES et al., 2012). As bactérias do gênero Rickettsia desenvolveram muitas estratégias para se adaptar a diferentes condições ambientais, incluindo aqueles dentro de seus vetores artrópodes e hospedeiros vertebrados (SOCOLOVSCHI et al., 2009). Em hospedeiros vertebrados, R. rickettsii

17 14 causa infecção aguda com duração de apenas alguns dias ou semanas, sem manutenção persistente do agente (BURGDORFER, 1988). A necessidade de reservatórios (carrapatos infectados) para a circulação do agente e a manutenção do agente na natureza é fundamental. A capivara é um potencial hospedeiro amplificador da R. rickettsii na natureza uma vez que foi demonstrada através de infecção experimental, a sua capacidade de mantê-la circulante em seu organismo, sem apresentar sinais clínicos da doença (SOUZA et al., 2009). Esses resultados indicam que as capivaras atuam como hospedeiro amplificador desta bactéria para carrapatos da espécie A. cajennense no Brasil. Em geral, o hospedeiro vertebrado tem que preencher os seguintes cinco requisitos para ser considerado um excelente hospedeiro amplificador para R. rickettsii em uma determinada área endêmica para FMB: 1. Tem que ser abundantes na área endêmica para R. rickettsii; 2. Tem que ser hospedeiro primário para o carrapato vetor; 3. Tem que ser suscetível à infecção por R. rickettsii; 4. Uma vez infectado por R. rickettsii, o hospedeiro tem que desenvolver uma riquetsemia em grau suficiente, capaz de infectar carrapatos que ali se alimentam; 5. Tem que ser uma espécie prolífica, a fim de ter uma introdução contínua de animais não imune na população. (LABRUNA, 2009). No Brasil, além das capivaras, os gambás (Didelphis marsupialis), demonstraram, experimentalmente, a capacidade de adquirir a infecção por R. rickettsii, assim como transmitir a bactéria para o carrapato vetor A. cajennense, desempenhando assim o papel de possíveis hospedeiros amplificadores (HORTA et al., 2009). Em todo o mundo, a sorologia em cães demonstrou ser um meio viável de determinar a exposição de seres humanos a Rickettsia sp. e predizer alterações na incidência de infecções em pessoas (RAOULT e PAROLA, 2007). Assim, os cães são considerados importantes sentinelas para riquetsioses, inclusive a FMB, em seres humanos. Tal fato se justifica, pois a soroprevalência para R. rickettsii em cães de determinadas áreas geográficas se aproxima da encontrada em seres humanos (BREITSCHWERDT et al., 1987). Os equídeos também assumem importante papel de sentinela da FMB (HORTA et al., 2004; LEMOS et al., 1996; SANGIONI et al., 2005), pois em áreas endêmicas nos Estados de Minas Gerais e São Paulo, estes

18 15 animais se apresentaram com altos títulos de anticorpos contra a R. rickettsii, possivelmente, correlacionados ao alto parasitismo pelo carrapato vetor A. cajennense (HORTA et al., 2004; SANGIONI et al., 2005). A Rickettsia parkeri foi apresentado pela primeira vez como responsável por quadros febris em seres humanos nos Estados Unidos somente em 2004, 65 anos após esta espécie ter sido isolado de carrapatos Amblyomma maculatum, nesse país (PADDOCK et al., 2004). Na América do Sul, a mesma já foi detectada e/ou isolada em carrapatos da espécie Amblyomma triste no Uruguai (VENZAL et al., 2004; PACHECO et al., 2006). No Brasil, a R. parkeri também já foi detectada por isolamento e PCR em carrapatos A. triste (SILVEIRA et al., 2007) e, também incriminada como provável agente responsável por infecções, por meio da detecção de anticorpos pela reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) em capivaras do estado de São Paulo (PACHECO et al., 2007), equinos em Santa Catarina (MEDEIROS et., al 2013) e Paraná (TOLEDO et al., 2011), além de cães do Rio Grande do Sul (SAITO et al., 2008) e Mato Grosso (MELO et al., 2011). A relação da R. parkeri com seus vetores primários (A. triste), aliadas a altas taxas de infecção entre as populações de carrapatos (se comparado a R. rickettsii), são indicativos de que os carrapatos A. triste possam ser reservatórios muito eficientes dessa espécie, uma vez que Nieri-Bastos et al. (2013) comprovou, experimentalmente que a R. parkeri é mantida por via transestadial e transovariamente por sucessivas gerações, e com a mesma competência vetorial, tendo em vista que os coelhos utilizados como hospedeiros no experimento soroconverteram por meio da detecção de anticorpos pela RIFI. Entretanto, estudos são necessários para avaliar o papel dos possíveis hospedeiros amplificadores na ecologia dessa espécie (LABRUNA, 2009). Somente no final da década passada que o diagnóstico de uma segunda riquetsiose transmitida por carrapatos ao homem ocorreu no Brasil (SPOLIDORIO et al., 2010). O agente é uma nova Rickettsia do GFM denominado de Rickettsia sp. cepa mata Atlântica, relacionada com a R. parkeri, Rickettsia africae e Rickettsia sibirica, e descrita nos Estados de São Paulo e Bahia, sendo os casos, clinicamente semelhante à doença causada pela R. parkeri (SPOLIDORIO et al., 2010; SILVA et al., 2011). A Rickettsia sp. cepa mata Atlântica tem sua transmissão associada, principalmente ao carrapato Amblyomma ovale, incriminado como possível vetor aos seres humanos (SABATINI et al., 2010). Além disso, A. aureolatum e R. sanguineus também foram encontrados infectados por esta nova cepa e nas mesmas áreas de

19 16 Mata Atlântica no sul e sudeste do Brasil (SABATINI et al., 2010; MEDEIROS et al., 2011), com níveis de infecção em A. ovale de até 10%, possibilitando inferir que a febre maculosa causada pela Rickettsia sp. cepa da Mata Atlântica seja muito mais abrangente do que é conhecido (SABATINI et al., 2010; SZABÓ et al., 2013). Candidatus: Rickettsia amblyommii, mesmo sem comprovação de patogenicidade, tem sido associada como possível agente causador de doença febril em humanos nos Estados Unidos, onde foi detectada a presença de anticorpos contra este antígeno (APPERSON et al., 2008). No que se refere à Candidatus: Rickettsia amblyommii, sabe-se que apresenta uma estreita relação com carrapatos da espécie Amblyomma americanum, onde se processa transmissão transovariana e transestadial da bactéria, e a partir do qual ela foi inicialmente isolada nos Estados Unidos (BURGDORFER et al.,1981). No Brasil a Candidatus: Rickettsia foi isolada pela primeira vez em carrapatos A. cajennense do Estado de Rondônia (LABRUNA et al.,2004a). A primeira observação de cães naturalmente infectados por Candidatus: Rickettsia amblyommii foi descrita na área rural do município de Monte Negro, Rondônia (LABRUNA et al., 2007a), sendo que no estado de Mato Grosso, foi determinada como provável antígeno responsável pela infecção (PARI) em cães e equinos por meio da RIFI, do município de Poconé, região do pantanal matogrossense (MELO et al., 2011, AMORIM et al., 2013). Recentemente, houve o isolamento e comprovação da transmissão transovariana e transestadial da Candidatus: Rickettsia amblyommii em carrapatos Amblyomma auriculatum de Pernambuco, região nordeste do país (SARAIVA et al., 2013). Quanto à Rickettsia rhipicephali, seu primeiro relato foi em R. sanguineus, nos Estados Unidos, onde, posteriormente foi também isolada de três espécies de carrapato pertencentes ao gênero Dermacentor, não havendo comprovação de sua patogenicidade à humanos. No Brasil, esta espécie de riquétsia foi detectada e isolada em cultivo celular de carrapatos da espécie Haemaphysalis juxtakochi (LABRUNA et al., 2007b). Há evidências sorológicas da infecção de R. rhipicephali em estudos epidemiológicos realizados em cães (LABRUNA et al., 2007a; MELO et al., 2011; AMORIM et al., 2013). Apesar de a Rickettsia bellii ter sido relatada nos Estados Unidos há mais de 50 anos, foi somente descrita pela primeira vez na América do Sul em 2004, seguido de inúmeros relatos em diferentes espécies de carrapatos. No Brasil, R. bellii tem sido descrita infectando 11 espécies de carrapato (A. ovale, Amblyomma

20 17 oblongoguttatum, Amblyomma scalpturatum, Amblyomma humerale, Amblyomma rotundatum, A. aureolatum, Amblyomma dubitatum, Amblyomma incisum, Amblyomma nodosum, Ixodes loricatus e H. juxtakochi). Também foi observado a infecção em Amblyomma neumanni e Amblyomma tigrinum na Argentina e Amblyomma varium no Peru, totalizando 14 espécies de carrapatos para o continente (LABRUNA et al., 2004a; LABRUNA et al., 2007c, OGRZEWALSKA et al., 2012). Mesmo não sendo associada com casos humanos, existem evidências sorológicas de infecção por R. belli em capivaras e em cães no Brasil (PACHECO et al., 2007; FORTES et al., 2010; MELO et al., 2011; AMORIM et al., 2013). A transmissão da R. rickettsii ocorre por meio da picada de carrapatos, que devem permanecer fixados à pele do hospedeiro por um período variável de cinco a vinte horas, tempo necessário para uma possível reativação da bactéria na glândula salivar do carrapato. Dessa forma, a partir da picada do carrapato infectado, a R. rickettsii se dissemina pelo organismo por meio dos vasos linfáticos e pequenos vasos sanguíneos, atingindo pele, cérebro, pulmões, coração, fígado, baço, pâncreas e trato gastrointestinal (LABRUNA E PEREIRA, 1998; DANTAS-TORRES, 2007). Quanto ao diagnóstico da enfermidade, a pesquisa de anticorpos por meio da RIFI é o método sorológico mais utilizado para o esclarecimento diagnóstico das riquétsioses, sendo considerado padrão-ouro e o mais disponível na rotina laboratorial. A RIFI é uma reação de alta sensibilidade que pode ser utilizada para a pesquisa de imunoglobulinas específicas da classe IgM e da classe IgG. Em geral, os anticorpos são detectados entre o 7 o e o 10 o dia de doença. Títulos de anticorpos superiores ou iguais a 64, em uma única amostra, ou uma diferença de quatro vezes no título de anticorpos observada em duas amostras pareadas de soro, coletadas de 2 a 4 semanas entre elas, são os requisitos para confirmação diagnóstica através da sorologia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005). Apesar da elevada sensibilidade, este teste não consegue distinguir entre uma infecção causada por R. rickettsii de outra causada por outra espécie do GFM. Por isso, neste teste preconiza-se a utilização de antígenos locais, considerando o PARI, como aquele que obteve um título quatro vezes superior ao observado para qualquer outra espécie de Rickettsia spp. testada (BROUQUI et al., 2004). A detecção molecular é alternativa para o diagnóstico, porém, sua realização esbarra na possibilidade de haver baixa quantidade de Rickettsia circulante na corrente sanguínea devido ao curto período de riquetsemia.

21 18 A técnica de imunohistoquímica geralmente é usada em pacientes com lesões cutâneas através de biópsia da pele. Também é possível realizar o isolamento da bactéria através do cultivo in vitro, que requer uma boa estrutura laboratorial, haja vista que esse agente é classificado como nível 3 com relação à biosseguridade (BRASIL, 2005; BROUQUI, et al., 2004). Estudos envolvendo sorologia por meio da RIFI em animais sentinelas vêm sendo constantemente realizados a fim de determinar a possível circulação do agente na região, além de ser um meio viável para determinar a exposição de seres humanos a Rickettsia spp. e predizer alterações na incidência de infecções nas áreas estudadas (FORTES et al., 2011). 2.2 Amblyomma cajennense lato sensu É uma das espécies de carrapatos mais amplamente distribuídas no continente Americano. Sua ocorrência estende-se do norte da Argentina, para o Caribe e a parte mais ao sul dos EUA. Ao longo de sua distribuição, este carrapato se adaptou amplamente a diferentes condições ecológicas, incluindo ecossistemas tão diferentes como pradarias semiáridas e subtropical, florestas secundárias (ESTRADA-PEÑA et al., 2004). A área geográfica ocupada por este carrapato é intercalada por grandes barreiras geográficas como a Cordilheira dos Andes, Golfo do México, e grandes rios (ESTRADA-PEÑA et al., 2004; WALKER et al.,1987). Beati et al. (2013) investigou a evolução, o histórico da distribuição geográfica e estruturas genéticas através de genes mitocondrial (12S rdna, d-loop, e COII) e um gene nuclear (ITS2). Esse estudo revelou que A. cajennense é um conjunto de seis espécies distintas, que têm evoluído separadamente um do outro. Sendo, proposta recentemente a existência de um complexo, composto por seis espécies, assim descrito: A. cajennense senso stricto, Amblyomma interandinum, Amblyomma mixtum, Amblyomma patinoi, Amblyomma sculptum e Amblyomma tonelliae no continente americano (BEATI et al., 2013; NAVA et al., 2014), no entanto, ainda não se sabe se essas divergências genéticas podem interferir ou não na manutenção e transmissão de riquétsias entre esses carrapatos. No sudeste do Brasil, local da maioria dos casos de FMB, a doença ocorre, principalmente dentro de um bem conhecido fundo ecológico: altas infestações de A.

22 19 cajennense no ambiente, mantidas por um dos seus principais hospedeiros, as capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) (SZABÓ et al., 2013). O carrapato estrela, como é conhecido popularmente, tem ciclo trioxênico e não apresenta comportamento sexual partenogenético fazendo com que o macho tenha um papel fundamental na perpetuação da espécie (OLIVEIRA, 2004). Dada a menor especificidade parasitária das larvas e ninfas, estes são os principais estágios que parasitam os seres humanos, larvas e ninfas desta espécie podem parasitar várias espécies de pequenos mamíferos e, eventualmente, aves. O estágio adulto é mais específico de grandes mamíferos tais como equinos, antas e capivaras e, eventualmente, quando as populações deste carrapato se apresentam muito numerosas, é que o estágio adulto irá parasitar outros mamíferos inclusive humanos (MANUAL DE VIGILÂNCIA ACAROLÓGICA, 2002.). Para que uma população de A. cajennense esteja estabelecida numa área, há dois pontos críticos a serem considerados: (1) a presença de hospedeiros primários (equídeos, capivaras e antas) e (2) condições ambientais favoráveis às fases de vida livre do carrapato. Numa área onde uma população de A. cajennense está estabelecida, pelo menos uma destas três espécies de hospedeiros vertebrados deverá estar presente (MANUAL DE VIGILÂNCIA ACAROLÓGICA, 2002). A distribuição sazonal A. cajennense, carrapato dos equinos é determinada pelas condições do ambiente natural e social, resultando em comportamento epidemiológico diferenciado para os diversos ecossistemas. Estudos realizados na Região Sudeste do Brasil têm demonstrado que esta espécie tem um ciclo anual, isto é, o desenvolvimento de apenas uma geração por ano, com picos populacionais bem definidos ao longo do ano para cada estádio de desenvolvimento (GUEDES E LEITE, 2008; OLIVEIRA et al., 2000). As larvas, vulgarmente chamadas de micuim, predominam nos meses de abril a julho; as ninfas, popularmente chamadas de vermelhinho, predominam de julho a outubro e os adultos, vulgarmente chamados de rodoleiro ou de carrapato-estrela, predominam nos meses quentes e chuvosos, de outubro a março. Dadas essas diferenças temporais entre os diferentes estágios, é relativamente comum encontrar pessoas com anos de vivência no campo, que interpretem estes diferentes estágios do A. cajennense como se fossem três espécies distintas de carrapatos (MANUAL DE VIGILÂNCIA ACAROLÓGICA, 2002)

23 20 No Estado de São Paulo, Labruna et al. (2002) realizaram um estudo sobre a dinâmica sazonal de A. cajennense avaliando as infestações naturais de equinos mantidos a pasto. Os autores observaram que este carrapato apresenta picos distintos de atividade para cada um de seus estádios parasitários e um padrão definido de uma geração por ano. Este padrão cíclico anual do carrapato na Região Sudeste do Brasil esta controlado primariamente pela realização de diapausa comportamental pelas larvas não alimentadas existentes nas pastagens durante os meses de verão, onde os dias são mais longos (> 12 horas) e a temperatura ambiente mais elevada (± 20 C) (CABRERA E LABRUNA, 2009), fato este comprovado pela ausência ou ocorrência em número muito reduzido de larvas no ambiente na primavera e verão, uma vez que a diapausa comportamental é caracterizada pelo confinamento de larvas eclodidas no chão abaixo da vegetação por muitas semanas Os autores observaram que o fotoperíodo e as variáveis climáticas como a temperatura e a umidade relativa do ar, apresentam uma correlação estatisticamente significativa com as infestações do carrapato (LABRUNA et al., 2003; CABRERA E LABRUNA, 2009). Segundo Belezerov (1982), as atividades dos ixodídeos são marcadas por ritmos sazonais que alternam períodos de picos de atividades como a busca pelo hospedeiro, ingurgitamento, postura de ovos, etc., com períodos de dormência em sincronia com as estações do ano para regulação do seu ciclo de vida. Uma vez que a população de carrapatos cresce, ela passa a parasitar outros hospedeiros, chamados secundários. Na literatura há diversos relatos do parasitismo por A. cajennense em dezenas de espécies de hospedeiros mamíferos e aves. Como regra geral, quanto maior a população de A. cajennense numa determinada área, maior a chance de encontrá-lo parasitando outras espécies de hospedeiros, inclusive seres humanos. De fato, a ocorrência de infestação humana por A. cajennense está associada a altas infestações por este carrapato em seus hospedeiros primários (equinos, antas e capivaras) (LABRUNA et al., 2001). Populações de A. cajennense podem sobreviver em áreas onde não existam equídeos, parasitando várias espécies de animais silvestres, principalmente, em áreas de pastagens sujas ou de cobertura vegetal mais densa, as quais esses hospedeiros silvestres frequentam com mais assiduidade. Por outro lado, áreas de pastos limpos limitam o estabelecimento deste carrapato, mesmo na abundância de hospedeiros primários (LABRUNA et al., 2001).

24 21 Por sua total dependência do sangue de seus hospedeiros, tais carrapatos atuam como vetores de uma série de agentes infecciosos, entre eles protozoários, vírus e bactérias. Além da sua importância do ponto de vista econômico-zootécnico nos sistemas de exploração animal, o A. cajennense também se destaca na saúde pública, já que é incriminado como o principal vetor de R. rickettsii, agente etiológico da FMB (GUEDES et al., 2005). Carrapatos A. cajennense infectados com R. rickettsii já foram comprovadamente identificados no México (BUSTAMANTE E VARELA, 1947), no Panamá (RODANICHE, 1953), na Colômbia (PATINO- CAMARGO, 1941) e no Brasil (GUEDES et al., 2005), onde foi descrito o primeiro isolamento em cultivo celular dessa espécie de bactéria de carrapatos A. cajennense (KRAWCZAK et al., 2014). Entretanto, Guedes et al. (2005) descreve que essa espécie de carrapatos demonstra baixa taxa de infecção por R. rickettsii (<%1) em condições naturais, porém já foi comprovado experimentalmente que A. cajennense é capaz de adquirir e transmitir a infecção por R. rickettsii tanto na forma transestadial quando na transovariana, contudo, a taxa de infecção declina drasticamente entre as sucessivas gerações, taxas em torno de 50%, necessitando assim de hospedeiros amplificadores para manter-se circulante na natureza (SOARES et al., 2012). LABRUNA et al. (2008) demonstraram a refratariedade do vetor à infecção quando comparada à outras espécies como por exemplo o A. aureolatum, onde encontrou taxas de transmissão transestadial e transovariana de 100% nas larvas e ninfas estudadas. Figura 1. Carrapatos adultos da espécie Amblyomma cajennense (Créditos: Maria Ogrzewalska)

25 22 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Local de Estudo O município de Poconé (16º15 24 Sul; 56º37 22 Oeste) está localizado no nordeste da região do Pantanal, 100 Km a sudoeste da cidade de Cuiabá, capital do estado de Mato Grosso, tendo como vizinhos os municípios de Cáceres (oeste), Nossa Senhora do Livramento (norte), Barão de Melgaço (leste) e estado de Mato Grosso do Sul na borda sul (Figura 2). Para coleta dos carrapatos foi utilizada a Base Avançada de Pesquisa do Pantanal da Universidade Federal de Mato Grosso Amostras de soros dos equideos testados foram gentilmente cedidos por Borges et al., Os procedimentos de coleta foram aprovados pelo comitê de Bioética em pesquisa animal da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), sob o protocolo de número: /12-1. Foram selecionadas 25 propriedades do município de Poconé, MT (Figura 2), as quais foram sorteadas dentre as propriedades cadastradas no Instituto de Defesa Agropecuária do Estado de Mato Grosso (INDEA/MT). Em cada propriedade foram amostrados 20 animais, totalizando 500 equinos. Além disso, foram coletadas amostras de sangues de todos os muares e asininos, totalizando 47 muares/asininos. As amostras de sangue dos equídeos foram obtidas durante os meses de janeiro a julho de 2010, e o soro de cada animal foi armazenado em microtubos de 1,5 ml e estocado a -20 o C até sua utilização.

26 Figura 1. Município de Poconé e fazendas selecionadas para a coleta de sangue dos equídeos do pantanal mato-grossense, Poconé-MT, janeiro a julho de

27 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) A RIFI foi realizada com o objetivo de detectar anticorpos anti-rickettsia usando antígenos derivados de cinco espécies isoladas no Brasil: R. rickettsii cepa Taiaçu e R. bellii cepa Mogi (PINTER E LABRUNA, 2006), Candidatus: Rickettsia amblyommii cepa Ac37 (LABRUNA et al., 2004a), R. rhipicephali cepa HJ5 (LABRUNA et al., 2007b), R. parkeri cepa At24 (SILVEIRA et al., 2007) como descrito por Labruna et al. (2007a), sendo as amostras de soro equinos diluídas a 1:64 em Solução Tampão Fosfatada PBS ph 7,2 (0,0084M Na2HPO4, 0,0018M NaH2PO4 e 0,147M NaCl), aplicadas às lâminas com antígeno fixado, e incubadas por 30 minutos à 37 ºC em câmara úmida. Em seguida, foram realizadas duas etapas de lavagem em PBS, com duração de 10 minutos cada e, após a secagem, adicionado conjugado de coelho anti-igg específico para equinos, na diluição 1:1000. Novamente as lâminas foram incubadas à 37 ºC por 30 minutos, e lavadas em PBS acrescido com Azul de Evans. Após a secagem foi aplicada na lâmina Glicerina (ph 8,5) sobreposta por lamínula, e esta examinada em microscópio de epifluorescência (ZEISS AX10), em objetiva de 40x. As amostras consideradas positivas foram sucessivamente diluídas na razão dois para obtenção do título final, e em seguida, avaliadas as titulações, buscando encontrar um título quatro vezes maior que o valor das demais espécies de riquétsias encontradas, a fim de determinar um provável antígeno responsável pela infecção (PARI) (LABRUNA et al., 2007a). Em cada lâmina foram adicionados soros-controle positivo e negativo. 3.3 Coleta e Identificação dos Carrapatos Carrapatos adultos e imaturos foram coletados no período de novembro de 2012 a Julho de 2013, (intervaladas de 3 meses) totalizando 4 visitas, uma em cada estação do ano (primavera, verão, outono e inverno) em fazendas que continham cães domésticos sabidamente sororeagentes a antígenos de Rickettsia spp. (Figura 3), conforme observado por Melo et al. (2011). Em cada campanha, todos os carrapatos foram coletados no ambiente por meio da técnica de arraste de flanela (Figura 4) e, manualmente dos animais (cães e equinos). Os carrapatos foram identificados utilizando chaves especificas para adultos (BARROS-BATTESTI et al.,

28 ) e ninfas (MARTINS et al., 2010). Larvas e ninfas no momento da coleta já foram armazenadas em frascos plásticos com álcool absoluto, sendo que os adultos foram trazidos vivos ao laboratório, onde foram mantidos em estufa a 32 ºC com umidade relativa de 95% por 3 a 5 dias, com o intuito de reativar a riquétsia em seu organismo. Posteriormente foram submetidos ao teste de hemolinfa (BURGDORFER,1970), como descrito a seguir..figura 2. Pontos de coleta dos carrapatos no pantanal mato-grossense do Munícipio de Poconé-MT, durante o período de novembro de 2012 a julho de 2013

29 26 Figura 3. Arraste de flanela e pontos de coletas no pantanal mato-grossense do Munícipio de Poconé-MT, durante o período de novembro de 2012 a julho de Teste de Hemolinfa Todos os carrapatos adultos foram processados individualmente para a realização do teste de hemolinfa, que é um teste de triagem para identificar aqueles adultos infectados com estruturas morfologicamente semelhantes às riquétsias (BURGDORFER, 1970). A cada exemplar de carrapato foi seccionado a porção distal de uma pata e uma a duas gotas de hemolinfa aplicada em lâmina de vidro limpa e desengordurada, sendo posteriormente coradas de acordo com o método desenvolvido por Gimenez (1964) (Figura 5) e, examinadas ao microscópio óptico no aumento de 1000x. Após o teste os carrapatos, ainda vivos, foram congelados a 80 ºC negativos. Carrapatos imaturos coletados foram acondicionados em tubos plásticos de 1,5 ml com álcool absoluto e, posteriormente agrupados em pools com 5 ninfas ou pools com 10 larvas.

30 27 Figura 4. Teste de Hemolinfa: Figura A e B (João Fábio Soares USP) imagens C e D referem-se à hemolinfa de carrapato da espécie da A. cajennense (arquivo pessoal), Cuiabá-MT, Extração de DNA e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) Carrapatos adultos negativos ao teste de hemolinfa e carrapatos imaturos já identificados foram submetidos à extração de DNA pelo protocolo de Tiocianato de Guanidina conforme descrito por SANGIONI et al. (2005). O DNA extraído de cada carrapato foi testado pela PCR utilizando primeiramente os iniciadores CS-78 e CS- 323 (LABRUNA et al., 2004a) que amplificam um fragmento de 401 pares de base (pb) do gene citrato sintase (glta) presente, possivelmente em todas as espécies do gênero Rickettsia (LABRUNA et al., 2004a). As amostras positivas na PCR para este gene, foram submetidas a PCR para outro iniciador, Rr190.70p e Rr n (REGNERY et al., 1991), que amplifica um segmento de 530 pb do gene da proteína externa de membrana A de 190-kDa (ompa), presente em riquétsias do GFM (REGNERY et al., 1991). Os produtos da amplificação das PCRs foram purificados com illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare ) e

31 28 sequenciados em sequenciador automático. As sequências parciais obtidas foram submetidas à análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHULet al.,1990) para determinar a similaridade com outras espécies de Rickettsia. Para confirmar a identificação taxonômica dos carrapatos positivos para Rickettsia uma amostra de DNA dos adultos, pool de ninfas e de larvas foram submetidos a PCR para análise do gene mitocondrial 16S rrna (MANGOLD et al., 1998).

32 29 4 RESULTADOS 4.1 Reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) Dentre os animais amostrados, 337 (61,6%) equídeos foram reagentes (título 64) a pelo menos um antígeno de Rickettsia spp. Os valores de prevalência de anticorpos anti-rickettsia spp foram de 66% (53,2-76,7% IC 95%). Elevados títulos anti-rickettsia foram observados para Candidatus: Rickettsia amblyommii, sendo o mesmo considerado como PARI em 145 (26,5%) equídeos. Seguindo o mesmo critério descrito acima, outros 28 (5,1%) tiveram reação homóloga à R. parkeri (Tabela 1). Os valores de prevalência (IC 95%) para Candidatus: Rickettsia amblyommii e R. parkeri foram 30,5% (21-42%) e 5% (3-7,8%), respectivamente Carrapatos Um total de 100 carrapatos foram coletados de animais, e foram identificados como 50 adultos (15 machos e 35 fêmes) e 40 ninfas de A. cajennense s.i. (coletados equinos e cães, respectivamente), e 10 adultos (2 machos e 10 fêmeas) de Dermacentor nitens Neumann ( coletados dos equinos). Um total de 1,985 carrapatos foram coletados do ambiente, e foram identificados como 615 adultos (217 machos e 398 fêmes) e 490 ninfas de A. cajennense s.l., e 880 larvas de Amblyomma sp. Entre esses carrapatos, 665 adultos e 106 pools de ninfas de A. cajennense s.l., 10 carrapatos D. nitens, e 88 pools de larvas de Amblyomma sp. foram testados pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção de infecção rickettsial. Na PCR, 3 (0.45%) espécimes de A. cajennense s.l fêmeas adultas foram positivas para os genes glta e ompa, Nenhuma amostra de D. nitens apresentaram-se positivas. Um total de 4 e 3 pools de ninfas e larvas, respectivamente foram positivas para ambos genes glta and ompa. Taxas mínimas de infecção na população testada foram de 0.75% e 0.34% para ninfas e larvas, respectivamente (Pelo menos 1 carrapato infectado entre 530 ninfas ou 880 larvas) Amostras positivas na PCR para gene ompa foram sequenciadas e o produto (471 pb) mostrou 99% (469/471) de similaridade, com as sequencias correspondentes de várias espécies de Candidatus R.amblyommii disponíveis no no GenBank.

33 30 Foram obtidas sequências parciais do 16S rrna mitocondrial geradas a partir de 3 fêmeas adultas e de pools de ninfas e larvas contendo DNA de Candidatus: Rickettsia amblyommii. Esses carrapatos apresentaram dois haplótipos que diferiram por 1 único nucleotídeo. Submetendo essas amostras ao programa BLAST, estas sequências foram 99% idêntica à sequência correspondente de um A. cajennense s.l do estado de Mato Grosso do Sul, Brasil (JX573118). As sequencias de DNA gerados no presente estudo foram submetidos ao GenBank sob o número de acesso KJ para Candidatus: Rickettsia amblyommii ompa, e KJ KJ para sequencias parciais de 16S rrna A. sculptum sequências parciais.

34 30 Tabela 1.Resultados da RIFI para 5 espécies de Rickettsia spp. em equídeos coletados no período de janeiro a julho de 2010, de fazendas do município de Poconé, uma área do Pantanal dentro do estado de Mato Grosso, Brazil. Localidade No. de equídeos testados Amostras reativas (% sororeativos por localidade) Número de equídeos sororeativos para cada espécies de Rickettsia (%) R. rickettsii R. parkeri R. bellii R. amblyommii R. rhipicephali Nº de equídeos com possível reação homóloga (PARI em parênteses) a Fazenda (52,3) - 3 (14,28) 1 (4,76) 11 (52,38) - 11 (11 R. amblyommii) Fazenda (80,0) - 6 (30) 4 (20) 16 (80) - 12 (12 R. amblyommii) Fazenda (96,1) 6 (30,0) 25 (100) 3 (15) 25 (100) 3 (15) 5 ( 1 R. parkeri; 4 R. amblyommii) Fazenda (100,0) 7 (3,8) 19 (86,36) 1 (4,54) 22 (100) 6 (27,27) 8 (1 R. parkeri e 7 R. amblyommii) Fazenda (95,6) - 17 (73,91) 4 (17,39) 22 (95,65) 4 (17,39) 14 (14 R. amblyommii) Fazenda (55,0) - 4 (20) - 11 (55) - 9 (1 R. parkeri; 8 R. amblyommii) Fazenda (95,8) 1 (4,1) 22 (91,66) 6 (25) 23 (95,83) 7 (29,16) 6 (2 R. parkeri; 4 R. amblyommii) Fazenda (75,0) 4 (20,0) 12 (60) 3 (15) 13 (65) 4 (20) 5 (2 R. parkeri; 3 R. amblyommii) Fazenda (30,0) - 3 (15) 2 (10) 5 (25) 1 (5) 3 (1 R. parkeri; 2 R. amblyommii) Fazenda (96,2) 1 (3,8) 25 (96,15) - 26 (100) 4 (15,38) 10 (1 R. parkeri; 9 R. amblyommii) Fazenda (86,3) 1 (4,5) 16 (72,72) 1 (4,54) 18 (81,81) 4 (18,18) 12 (1 R. parkeri; 11 R. amblyommii) Fazenda (95,0) 1 (5,0) 10 (50) 1 (5) 19 (95) 1 (20) 17 (17 R. amblyommii) Fazenda (55,0) - 10 (55,55) - 8 (44,44) - 7 (6 R. parkeri; 1 R. amblyommii) Fazenda (90,0) 4 (20,0) 17 (85) 3 (15) 18 (90) - 3 (3 R.amblyommii) Fazenda (25,0) (25) - 5 (5 R. amblyommii) Fazenda (53,8) 1 (6,2) 13 (81,25) 1 (6,25) 14 (87,50) 5 (31,25) 4 (1 R. parkeri; 3 R. amblyommii) Fazenda (34,3) - 1 (3,33) - 10 (33,33) - 9 (9 R. amblyommii) Fazenda (40,0) - 8 (40) - 6 (30) - 4 (3 R. parkeri; 1 R. amblyommii Fazenda (59,0) - 11 (68,75) 1 (6,25) 12 (75) 1 (6,25) 7 (2 R. parkeri; 5 R. amblyommii) Fazenda (90,0) - 17 (89,47) 1 (5,26) 16 (84,21) - 5 (3 R. parkeri; 2 R. amblyommii) Fazenda (23,8) 1 (5,0) 2 (10) 1 (5) 5 (25) 1 (5) 3 (3 R. amblyommii) Fazenda (0,0) Fazenda (25,0) - 4 (20) 1 (5) 4 (20) - 3 (2 R. parkeri; 1 R. amblyommii) Fazenda (30,0) - 3 (15) 2 (10) 5 (25) 1 (5) 4 (1 R. parkeri; 3 R. amblyommii) Fazenda (45,0) 1 (5,26) 1 (6,26) 2 (10,52) 9 (47,36) 1 (5,26) 7 (7 R. amblyommii) Total ( 28 R. parkeri; 145 R. amblyommii) a Reação homóloga foi sugerida quando o títulos final para uma espécie de Rickettsia foi 4 vezes mais alto que o valor final observado para outras espécies, sendo assim considerado o provável antígeno responsável pela infecção (PARI).

35 32 5. Discussão Este estudo buscou avaliar a infecção de riquétsias em carrapatos e equídeos do Pantanal Matogrossense (município de Poconé), Brasil. Os anticorpos contra Rickettsia spp. foram encontrados em 337 (61,6%) dos equídeos avaliados. Altas taxas de cães soropositivos foram observados por Melo et al. (2011), na mesma localidade, com 47,5% dos cães reagentes a pelo menos uma espécie de Rickettsia spp. Além disso, segundo a totalidade de cães avaliados, o parasitismo por Amblyomma spp., associado ao hábito de caça e quando oriundos de área rural apresentaram-se como fatores de risco para a infecção por Rickettsia spp. Amorim et al. (2013), estudando 12 regionais do Estado de Mato Grosso (áreas divididas pelo INDEA/MT) observaram 59,34% de equinos positivos para Rickettsia spp. sendo a Candidatus: Rickettsia amblyommii determinada como PARI em 28,47% das amostras avaliadas. Bermudez et al. (2011) em um estudo realizado no Panamá, relataram uma forte interação entre o A. cajennense e Candidatus: Rickettsia amblyommii, onde a presença da bactéria foi determinada tanto pela PCR em carrapatos coletados de cães e cavalos, assim como pela RIFI. Nesse estudo, Candidatus: Rickettsia amblyommii foi o PARI em 26,5%, enquanto a R. parkeri foi determinada com PARI em 5,1% das amostras. Atualmente, este agente é reconhecido como provável patógeno responsável por infecções em seres humanos, com múltiplos casos nos Estados Unidos, onde é transmitida por A. maculatum (PADDOCK et al., 2005). Em animais, evidências sorológicas da infecção por Candidatus: Rickettsia amblyommii já foram documentados em cães (BARRETT et al., 2014; MELO et al., 2011; LABRUNA et al., 2007) e equinos (AMORIM et al., 2013), mas sem descrição de patogenicida para esses animais. R. parkeri é um reconhecido patógeno para seres humanos com vários casos confirmados nos Estados Unidos, onde é transmitido por A. maculatum (PADDOCK et al., 2005). No Brasil, R. parkeri tem sido associado com casos humanos de riquétsioses em São Paulo (SPOLIDORIO et al., 2010), e no estado da Bahia (SILVA et al., 2011). Casos notificados no sul do país com alguns aspectos clínicos, incluindo doenças menos graves, quando comparadas com a infecção por R. rickettsii, muitas vezes relacionadas a uma linfadenopatia típica e diagnostico

36 33 favorável (ANGERAMI et al., 2009), sendo possível que a febre maculosa da região sudeste tenha sido causada pela R. parkeri (MEDEIROS et al., 2013). Este agente também foi isolado de carrapatos A. triste no município de Poconé-MT (Dados não publicados), reforçando a importância em saúde pública dos resultados encontrados neste trabalho. Candidatus: Rickettsia amblyommii foi relatado infectando A. cajennense e Amblyomma coelebs (LABRUNA et al., 2004a), Amblyomma longirostre e Amblyomma geayi no Brasil (OGRZEWALSKA et al. 2008; 2010). Neste estudo relata, pela primeira vez, Candidatus: Rickettsia amblyommii infectando carrapatos A. sculptum pela primeira vez no Brasil na região do Pantanal. Considerando-se os cavalos e capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) os hospedeiros primários mais abundantes para carrapatos do complexo A. cajennense no Brasil (LABRUNA et al., 2009), é possível inferir que Candidatus: Rickettsia amblyommii é, possivelmente, transmitida por A. sculptum na região. De acordo com Melo et al. (2011), no mesmo município de Poconé, infestação por A. cajennense (possivelmente A. sculptum) foi um fator de risco associado à infecção por Rickettsia nos cães amostrados. A taxa de infectividade nos carrapatos A. cajennense adultos observado neste estudo foi de 0,45%, notavelmente, Labruna et al. (2004a) observou em condições naturais taxas mais elevadas (26,8%) em A. cajennense senso stricto, em Rondônia,. Soares et al. (2012) observou que o carrapato A. cajennense s.s. é parcialmente refratário a infecção por R. rickettsii, quando comparada a outras espécies de carrapatos, por isso é possível deduzir que este fenômeno também possa ocorrer em infecções de A. cajennense s.l aqui descrita já como A. sculptum por Candidatus: Rickettsia amblyommii, justificando a baixa taxa de infectividade observados. Taxas Minimas de infecção na população testada foram de 0,75% e 0,34% para ninfas e larvas, respectivamente (pelo menos um carrapato infectado dentro de 530 ninfas ou 880 larvas). Saraiva et al. (2013) observaram que a Candidatus: Rickettsia amblyommii foi mantida de forma eficiente em 100% dos carrapatos demonstrando a transmissão transovariana e perpetuação transestadial em carrapatos A. auricularium. Mais estudos são necessários para verificar se A. sculptum são responsáveis pela manutenção de R. amblyommi na natureza, ou a presença de hospedeiros amplificadores torna-se necessário.