CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE PHAEOMONIELLA CHLAMYDOSPORA OBTIDOS NA REGIÃO DEMARCADA DO DÃO

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1 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE PHAEOMONIELLA CHLAMYDOSPORA OBTIDOS NA REGIÃO DEMARCADA DO DÃO Jorge SOFIA 1,3 ; João TROVÃO 1* ; António PORTUGAL 1 ; Hugo PAIVA DE CARVALHO 1 ; Nuno MESQUITA 1 ; Teresa NASCIMENTO 2 ; Cecília REGO 2 ; Maria Teresa GONÇALVES 1 (1) Centro de Ecologia Funcional, Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Coimbra, Calçada Martim de Freitas, Coimbra. (2) Centro de Investigação em Agronomia, Alimentos, Ambiente e Paisagem, Instituto Superior de Agronomia, Universidade de Lisboa, Tapada da Ajuda, Lisboa. (3) Direção Regional de Agricultura e Pescas do Centro, Estação Agrária de Viseu, Estação de Avisos do Dão, Viseu. * Estes autores contribuíram de igual forma para o presente trabalho. Évora, 4 de Maio de º simpósio de Vitivinicultura do Alentejo

2 Introdução: A esca é considerada a mais importante doença do lenho na região demarcada do Dão, à semelhança do que acontece noutras regiões vitícolas do globo. Phaeomoniella chlamydospora e Phaeoacremonium spp. são os mais importantes patogénios relacionados com o complexo da esca e a sua manifestação em plantas jovens. P. chlamydospora é a espécie isolada com maior frequência. Região Demarcada do Dão

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4 Sem teleomorfo conhecido. Reprodução estritamente clonal. Elevada homogeneidade das populações estudadas em diferentes locais geográficos: Diversos marcadores moleculares (RAPD, ISSR, AFLP e UP PCR) revelaram baixos valores de variabilidade genética entre isolados obtidos em diferentes regiões mundiais de produção. As análises da região ITS, do gene da β-tubulina e do gene do EF1-α revelaram baixa recombinação genética e populações compostas essencialmente por uma estrutura clonal.

5 Objectivo: O presente estudo tem como objetivo a avaliação e divulgação nacional da variabilidade morfológica e molecular intraespecífica de uma colecção de 68 isolados portugueses de Phaeomoniella chlamydospora dos quais 47 foram obtidos na região demarcada do Dão e 21 noutras regiões vitícolas.

6 Métodos: Isolados: Foram analisados 68 isolados de P. chlamydospora obtidos a partir de plantas com sintomas de esca ou de doença de Petri: 47 isolados da região do Dão 21 isolados provenientes de outras regiões vitícolas. Caracterização fenotípica: Crescimento micelial em Malte Agar a 2%, à temperatura de 25 C, sob condições de obscuridade, durante um período de incubação de 30 dias. Aspecto cultural, cor, frente de crescimento, zonagem e morfologia das hifas. Numero de Ano de Idade da Sequencial sequência Isolate Isolado Wine Região region Concelho County Scion/Rootstock Casta/Porta-enxerto colheita Year Plant videira age number 1 CEVD1 Dão Mangualde Tinta Carvalha/ >50 years 2 CEVD2 Dão Mangualde /Rufete/ >50 years 3 CEVD3 Dão Mangualde -/ >25 years 4 CEVD4 Dão Mangualde Fernão Pires/ >50 years 5 CEVD5 Dão Mangualde Português Azul/ >50 years 6 CEVD6 Dão Viseu Baga/ >80 years 7 CEVD7 Dão Viseu Dona Branca/ >80 years 8 CEVD8 Bairrada Pombal Fernão Pires/ >20 years 9 CEVD9 Bairrada Pombal Fernão Pires/ >20 years 10 CEVD10 Dão Viseu Aragonês/ >5 years 11 CEVD11 Dão Viseu Jaen/ >30 years 12 CEVD12 Dão Viseu Jaen/ >30 years 13 CEVD13 Dão Viseu Moscatel Hamburgo/ years 14 CEVD14 Dão Viseu Bical/ years 15 CEVD15 Dão Viseu Encruzado/ years 16 CEVD16 Dão Viseu Arinto Gordo/ years 17 CEVD17 Dão Viseu Malvasia Rei/ years 18 CEVD18 Dão Tondela Touriga Nacional/ >50 years 19 CEVD19 Dão Tondela Touriga Nacional/ >50 years 20 CEVD20 Dão Tondela Arinto/ >50 anos 21 CEVD21 Dão Tondela Aragonês/ anos 23 CEVD23 Bairrada Pombal Baga/ years 24 CEVD24 Dão Viseu Arinto/ years 25 CEVD25 Bairrada Anadia Fernão Pires/ years 26 CEVD26 Bairrada Anadia Sauvignon Blanc/ years 27 CEVD27 Dão Penalva do Castelo Touriga Nacional/ year 28 CEVD28 Dão Penalva do Castelo Aragonês/ years 29 CEVD29 Azores Pico Aragonês/ years 30 CEVD30 Dão Oliveira Hospital Aragonês/ >25 years 31 CEVD31 Dão Tondela Jaen/ >25 years 32 CEVD32 Azores Pico Terrantez do Pico/ years 33 CEVD33 Dão Nelas Cabernet Sauvignon/ years 34 CEVD34 Dão Gouveia Syrah/ years 35 CEVD35 Dão Tábua Sauvignon Blanc/ years 36 Ph9 Península de Setúbal Grândola Periquita/99R Ph13 Bucelas Loures Arinto/ Ph14 Alentejo Monforte Viognier/1103P Ph15 Alentejo Monforte Arinto/1103P Ph16 Alentejo Vidigueira Cabernet Sauvignon/169VO years 41 Ph17 Alentejo Vidigueira Cabernet Sauvignon/337MM years 42 Ph18 Alentejo Vidigueira Petit Verdot/400MM years 43 Ph19 Alentejo Vidigueira Petit Verdot/400VO years 44 Ph20 Alentejo Vidigueira Chardonnay/76PB years 45 Ph21 Algarve Lagoa Arinto/1103P Ph22 Algarve Lagoa Arinto/1103P Ph23 Algarve Lagoa Alicante Bouschet/110R Ph24 Arruda Arruda dos Vinhos Touriga Nacional/ Ph26 Dão Lousã Cerceal / years 50 Ph28 Dão Mangualde Jaen/ years 51 Ph29 Dão Mangualde Touriga Nacional/ years 52 Ph30 Dão Nelas Jaen/SO years 53 Ph31 Dão Nelas Aragonês/SO years 54 Ph32 Dão Nelas Alfrocheiro/1103P years 55 Ph33 Dão Seia Jaen/ >50 years 56 Ph34 Dão Tondela Aragonês/ years 57 Ph35 Dão Mangualde Touriga Nacional/ years 58 Ph36 Dão Mangualde Encruzado/ >50 years 59 Ph37 Dão Gouveia Gouveio/ >50 years 60 Ph38 Dão Nelas Touriga Nacional/ years 61 Ph39 Dão Gouveia Jaen/ years 62 Ph40 Dão Arganil Baga/ >80 years 63 Ph42 Dão Mangualde Jaen/ years 64 CEVD36 Dão Arganil Rufete/ >50 years 65 CEVD37 Dão Tábua Touriga Nacional/1103P years 66 CEVD38 Dão Carregal do Sal Touriga Nacional/1103P year 67 CEVD39 Dão Carregal do Sal Touriga Nacional/1103P year 68 CEVD40 Dão Carregal do Sal Touriga Nacional/1103P year 69 CEVD41 Vinhos Verdes Arcos de Valedevez Loureiro/ >25 years

7 Métodos: Caracterização molecular: Crescimento micelial em meio liquído de batata glucosada - PDB. Extracção de DNA. Amplificação da região ITS-rDNA por PCR, utilizando os primers universais ITS1-F/ITS4. As sequências obtidas foram comparadas com as sequências do NCBI* Genbank database recorrendo à ferramenta BLAST**. Análise molecular: As sequências foram alinhadas com ClustalW. A análise molecular foi efectuada pelo método Maximum Likelihood (ML) (bootstrap de 1000 réplicas) usando o programa MEGA6. Utilizou-se como outgroup Eutypa lata (Genbank: KF ). * - National Center of Biotechnology Information ** - Basic Local Alignment Search Tool

8 Resultados: As variações fenotípicas permitiram o estabelecimento de dois grupos distintos: Grupo I com 45 isolados. Grupo II com 23 isolados. Características culturais e morfológicas de 68 isolados de Phaeomoniella chlamydospora em 2% MA ao fim de 30 dias, sob condições de obscuridade e temperatura de 25 C. Grupo Isolados I 1, 2, 3, 4, 5, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 23, 24, 26, 27, 28, 30, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 64, 65 68, 69 II 6, 7, 8, 10, 11, 12, 19, 20, 25, 29, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 41, 46, 54, 57, 63, 66, 67 Culturas em MA * Aspeto cultural feltroso feltroso Cor verdeoliváceo verdeoliváceo, frente de crescimento branca Frente de crescimento Zonagem Morfologia das hifas e micélio regular ausente predominam hifas filamentosas com micélio aéreo ralo regular ausente predominam hifas filamentosas com micélio aéreo ralo * 2% malte agar, face superior

9 Resultados: Todos os isolados produziram conídios e clamidósporos típicos da espécie. As taxas de esporulação, de crescimento micelial diário e os diâmetros médios das culturas foram registados. Valores médios, máximos e mínimos da taxa de crescimento micelial diária (mm) e do crescimento micelial (mm) ao fim de 30 dias, à temperatura de 25 C e sob condições de obscuridade para o conjunto de 68 isolados Phaeomoniella chlamydospora em estudo. Média ± s a Máximo Mínimo Parâmetros fenotípicos Grupo I Grupo II Grupo I Grupo II Grupo I Grupo II Taxa de crescimento micelial diária 0,68 ns ± 0,13 0,68 ns ± 0,11 0,98 0,93 0,48 0,50 Crescimento micelial ao fim de 30 dias 20,54 ns ± 3,90 20,52 ns ± 3,50 29,3 27,87 14,31 14,83 a - valores médios ± desvio padrão de dois conjunto de seis réplicas para cada isolado; ns - valores não significativamente diferentes calculados usando teste t (α = 0,05).

10 Resultados: A amplificação por PCR da região ITS-rDNA gerou um único fragmento de DNA com ca. de 570 pares de bases (bp) para todos os isolados. M C- M A comparação das sequências dos isolados de P. chlamydospora em estudo, com as sequências de P. chlamydospora das bases de dados do NCBI Genbank revelou índices de similaridade de 99% a 100%.

11 Resultados: A análise molecular deu origem a dois grupos distintos: Grupo A de 35 isolados com um bootstrap de 80%. Grupo B de 33 isolados com um bootstrap de 65% e uma separação do isolado 37 com 100%. A separação ocorreu devido a um SNP (Simple Nucleotide Polymorphism), nas posições 429 (T/A) e 497 (T/C). Verificou-se que um SNP na posição 534 (C/A) separou o isolado 37 do resto do seu grupo (B) , Árvore de ML após alinhamento das 68 sequências da região ITS obtidas neste estudo com Eutypa lata como outgroup. As percentagens de bootstrap são indicadas e a escala é representativa de substituições por local/site G r u p o A G r u p o B

12 Conclusões: Baixa variação fenotípica entre os isolados de P. chlamydospora provenientes do Dão e de outras regiões vitícolas portuguesas. Os isolados do Dão surgem agrupados com isolados de outras regiões, não havendo uma correspondência evidente com a combinação portaenxerto/casta, o ano de isolamento ou a origem geográfica do isolado. Foram detectadas três linhas clonais de P. chlamydospora, o que indicia que diferentes fontes de inóculo poderão ter sido introduzidas através de material de propagação vegetativa. Não se verificou uma correlação entre os grupos formados de acordo com as caraterísticas fenotípicas e os clusters genéticos. Reprodução clonal dominante da espécie P. chlamydospora. Recombinação genética, por via, de um ciclo parassexual, poderá explicar alguma da variabilidade genética detectada.

13 OBRIGADO! ( Évora, 4 de maio de º simpósio de Vitivinicultura do Alentejo