UTILIZAÇÃO DE ANTIOXIDANTES NA PRESERVAÇÃO SEMINAL EM SUÍNOS. (Use of antioxidants in swine semen preservation) Ricardo TONIOLLI RESUMO

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1 UTILIZAÇÃO DE ANTIOXIDANTES NA PRESERVAÇÃO SEMINAL EM SUÍNOS (Use of antioxidants in swine semen preservation) Ricardo TONIOLLI Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen (LRSTS) Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE) Av. Paranjana, 1700, Campus Itaperi, Fortaleza, Ceará. * toniolli@roadnet.com.br RESUMO A presença de ácidos graxos na membrana plasmática dos espermatozoides os torna células muito sensíveis aos danos oxidativos, os quais favorecem a formação de espécies reativas ao oxigênio (EROs), responsáveis pela perda de qualidade do ejaculado. Esta perda de qualidade pode variar desde a queda da motilidade até danos irreversíveis ao DNA espermático. Várias substâncias com ação antioxidante, têm sido utilizadas no tratamento de problemas de fertilidade, particularmente as vitaminas C e E, que quando adicionadas em níveis adequados a dieta de um reprodutor, pode permitir uma redução dos danos às membranas dos espermatozoides. A diminuição da qualidade do ejaculado de um reprodutor pode ser também explicada pelo desequilíbrio da produção de oxidante/antioxidante, levando a danos celulares, denominados estresse oxidativo. Na avaliação deste desequilíbrio entra também a ação protetora do plasma seminal com suas enzimas, que protegem os espermatozoides. A sensibilidade espermática aos danos oxidativos pode ser explicada pela quantidade de ácidos graxos poliinsaturados da membrana plasmática e pelas baixas concentrações de enzimas antioxidantes em seu reduzido citoplasma. ABSTRACT The presence of fatty acids in the sperm plasma membrane makes them very sensitive to oxidative damage, which favor the formation of reactive oxygen species (ROS) that are responsible for the loss of ejaculate quality. The loss of quality can vary since the fall of motility until irreversible damage to sperm DNA. Several substances with antioxidant 27 a 29 de junho de

2 activity, have been used in the treatment of fertility problems, particularly vitamins C and E, which when added to the male diet in adequate levels, may allow a reduction of the spermatozoa membranes damage. The decrease in the male ejaculate quality may also be explained by an imbalance in the production of oxidant / antioxidant, leading to the cell damage, called oxidative stress. In assessing this imbalance also enters the protective action of seminal plasma with their enzymes, which protect the sperm. The sperm sensitivity to oxidative damage can be explained by the amount of polyunsaturated fatty acids of the plasma membrane and the low antioxidant enzymes concentration in its reduced cytoplasm. INTRODUÇÃO Os espermatozoides são muito sensíveis aos danos oxidativos devido ao fato de apresentarem na constituição de suas membranas, grandes quantidades de ácidos graxos poliinsaturados (Poulos et al., 1973). Estes danos favorecem a formação de espécies reativas ao oxigênio (EROs), responsáveis pela redução da viabilidade (Hsu et al., 1998) e da motilidade espermática em ejaculados (Aitken e Baker, 2002). As EROs também podem produzir extensos danos à composição proteicas das membranas, modificar o citoesqueleto celular, bem como causar alterações nos mecanismos fisiológicos celulares (Sharma e Agarwal, 1996). Entre as espécies reativas ao oxigênio, podem ser citadas as seguintes: o radical hidroxila (OH-), o ânion superóxido (O2-), o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) e o óxido nítrico (Halliwell e Gutteridge, 1999), sendo o radical hidroxila a mais reativa e prejudicial ao espermatozoide (Halliwell, 1991). Inúmeras substâncias, com ação antioxidante, têm sido utilizadas no tratamento de problemas de fertilidade, tais como: as vitaminas C e E; a glutationa e a coenzima Q10. Indivíduos alimentados com dietas que apresentem níveis apropriados dessas vitaminas apresentaram nos ejaculados uma diminuição de espermatozoides que apresentavam danos em suas membranas celulares (Eicher, 1994). Dentro dessa óptica, uma vez que a vitamina C pode ser encontrada em altas concentrações no plasma seminal, é de se supor que existe uma relação entre ela e os danos oxidativos do espermatozoide, com um importante papel fisiológico entre esta substância e uma boa qualidade espermática presente no ejaculado (Fraga et al., 1992). A manutenção de uma 27 a 29 de junho de

3 dieta com níveis adequados de vitaminas antioxidantes, proporcionaria uma redução dos danos membranários nos espermatozoides do ejaculado, através da remoção dos radicais livres (Eichner, 1994). Os danos provocados pelo excesso de EROs afetam a qualidade do sêmen, incluindo perda da motilidade de forma irreversível, inibição de respiração espermática, lesões ao DNA espermático e mitocondrial e perda de enzimas intracelulares, interferindo na capacidade fecundante do espermatozoide (Valença e Guerra, 2007). Radicais livres Uma das razões que explicam a diminuição da qualidade do ejaculado de um reprodutor é a maior produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs), também chamadas de radicais livres, ou seja, átomos ou moléculas que possuem um ou mais elétrons despareados (Stryer, 1996). A formação do superóxido pode acontecer de forma espontânea nas seguintes situações: em ambientes aeróbicos, ricos em elétrons; próximo à membrana mitocondrial interna, devido ao escape de elétrons da cadeia respiratória (Nordberg e Árner, 2001). Distúrbios no equilíbrio da produção de oxidante/antioxidante, levam a danos celulares, denominados danos ou estresse oxidativo (Aitken, 1995), que podem ser causados de duas maneiras: pela redução na produção de antioxidantes para dentro do sistema de defesa celular ou pela produção elevada de EROs (Hallewell e Gutteridge, 1999). Estudos realizados por vários pesquisadores indicam que o H 2 O 2 é a ERO que promove os maiores danos in vitro aos espermatozoides, possuindo funções deletérias, atuando na diminuição da motilidade espermática (Armstrong, 1999). Na verdade, ela não é um radical livre, porém é de grande importância, devido à sua habilidade de penetrar em membranas biológicas (Halliwell, 1991) agindo como intermediária na formação de EROs. A grande sensibilidade espermática aos danos causados pelas EROs, pode ser explicado por duas razões: 01. A quantidade de ácidos graxos poliinsaturados presentes em sua membrana plasmática; 02. Baixas concentrações de enzimas antioxidantes em seu reduzido citoplasma (Aitken, 1994). Por outro lado, ejaculados com problemas morfológicos, particularmente a presença de gota proximal e distal podem produzir uma 27 a 29 de junho de

4 maior quantidade de EROs (Gomes et al., 1998). Acredita-se que a presença deste citoplasma residual aumentaria a capacidade destas células imaturas de gerarem nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH), que serviria como fonte de elétrons para a produção das EROs (Aitken, 2002). Também foi visto que espermatozoides imóveis e morfologicamente normais, entretanto, com algum problema de ordem funcional, são também fontes de EROs e parecem gerar radicais superóxidos (O 2 -) em maiores taxas do que espermatozoides saudáveis (Engel et al., 1999). Em indivíduos com problemas de infertilidade, constatou-se que a produção excessiva de EROs no sêmen poderia estar corroborando para a perpetuação do problema (Aitken e Fishel, 1994). Outra razão que pode explicar esta sensibilidade espermática às EROs, é que com a perda da maior parte do citoplasma durante a espermiogênese, as células perdem também os seus mecanismos endógenos de reparo e defesa enzimática. Contudo, na avaliação do desequilíbrio entre a produção de antioxidantes e EROs pelo organismo, não se pode esquecer da ação protetora do plasma seminal através de suas enzimas, protegendo os espermatozoides contra os ataques oxidativos (Halliwell e Gutteridge, 1999). Sabe-se que na espécie humana, a produção de EROs pelos espermatozoides é também considerada um processo fisiológico normal, tendo como funções: 01. Regulação da taxa de hiperativação, permitindo uma melhor reação acrossômica; 02. Mecanismo de fecundação, favorecendo uma melhor fusão espermatozoide/ovócito (DE Lamirande e Gagnon, 1993). Apesar do efeito positivo das EROs na fisiologia espermática, um desequilíbrio entre a sua produção e eliminação em um ejaculado, é prejudiciais aos espermatozoides (De Lamirande e Gagnon, 1995), sendo esta mais uma característica a ser considerada na avaliação de ejaculados. Geração de EROs no sêmen Dentro do ejaculado existem duas fontes principais de EROs: o espermatozoide e os leucócitos, com um mecanismo similar de geração de EROs localizada na membrana celular. Os leucócitos geram EROs durante a fagocitose, com capacidade 100 vezes maior que as células espermáticas, se tornando uma poderosa e perigosa, 27 a 29 de junho de

5 fonte de EROs com efeito prejudicial sobre função espermática (Aitken e Backer, 2002). Os danos causados no espermatozoide advêm da alta quantidade de ácidos graxos poliinsaturados oxidáveis em suas membranas, que o torna vulnerável à ação dose agentes oxidantes (radicais livres) bem como sensíveis à peroxidação lipídica. (Bilodeu et al., 2002). Quando as espécies reativas de oxigênio atacam as duplas ligações associadas aos ácidos graxos insaturados, uma reação em cadeia de peroxidação lipídica é iniciada, a qual, não sendo paralisada, leva a uma perda da permeabilidade da membrana e consequentemente da função espermática (Aitken e Backer, 2002). As espécies oxigênio reativas exercem um papel duplo na fertilidade do macho: 01. Fundamentais em processos como hiperativação da motilidade, capacitação, reação acrossômica e fertilização; 02. Podem causar severos danos ao espermatozoide, quando os seus mecanismos de defesa estão limitados. Assim, o espermatozoide esta continuamente na corda-bamba, porque uma produção controlada de EROs é de vital importância para a sua função normal, enquanto que a superprodução e/ou defesas antioxidantes inadequadas levam a estresse oxidativo, com impacto negativo na fertilidade (Aitken, 1995). Influência do estresse oxidativo no sistema reprodutor masculino O estresse oxidativo aparece por um desequilíbrio na quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs) e pode ser causado por diversos fatores relacionados com o aumento da produção de ERO e/ou a redução de antioxidantes (Souza e Ferreira, 2007). A ocorrência do estresse oxidativo na linha germinativa é profundamente influenciada pela presença de antioxidantes nas secreções do trato reprodutivo masculino e que incluem enzimas protetoras altamente especializadas secretadas no espaço extracelular e produzidas na cabeça e cauda do epidídimo (Vernet et al., 1997). O plasma seminal também possui removedores de radicais livres, que contribuem para a proteção antioxidante do espermatozoide (Van Overveld et al., 2000). O espermatozoide é um organismo aeróbio, sendo o oxigênio essencial para manutenção de suas funções, porém, ele causa danos quando em altas concentrações (Valença e Guerra, 2007). 27 a 29 de junho de

6 Há muito tempo, correlacionou-se a perda de motilidade espermática a efeitos do estresse oxidativo. Os mecanismos responsáveis por esse fenômeno em mamíferos envolvem a indução de danos peroxidativos à membrana plasmática do espermatozoide, composta por ácidos graxos poliinsaturados que são essenciais para dar à membrana a permeabilidade necessária para participar da fecundação (Jones et al., 1979). Mecanismos de defesa antioxidantes no sêmen Define-se um antioxidante como qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações, comparadas com as de um substrato oxidável, retarda ou previne significativamente a oxidação desse substrato (Halliwell e Gutteridge, 1999). Para proteger-se do efeito letal da formação excessiva de EROs, a célula possui um sistema de defesa antioxidante, que pode tanto remover o agente antes da lesão, quanto reparando a lesão ocorrida (Halliwell e Gutteridge, 1999), incluídos basicamente em dois sistemas de defesa antioxidante: 01. Sistema Intracelular de defesa antioxidante: a) Enzimático, formado pelas enzimas superóxido dismutase (SDO), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e redutase (GR); b) Não enzimático, formado por vitaminas, o ácido ascórbico (vitamina C) e o α-tocoferol (vitamina E) (Aitken, 1995). 02. Sistema Extracelular de defesa antioxidante : é a proteção vinda do plasma seminal que contém vários redutores de EROs. a) Redutores não enzimáticos: vitamina C, ácido úrico, albumina, vitamina E, tirosina; b) Redutores enzimáticos: catalase, glutationa, taurina, hipotaurina (Van Overveld et al., 2000). Como a capacidade biosintética do espermatozoide é limitada, o plasma seminal particularmente importante na sua proteção contra danos causados pelas EROs geradas pela própria célula e pelos fagócitos presentes no ejaculado (Aitken, 1995). O sêmen com um perfil antioxidante reduzido está associado à baixa qualidade espermática e alto grau de fragmentação do DNA. Essa associação entre a atividade das enzimas antioxidantes e a função espermática defeituosa está ligada a presença de células germinativas primordiais e citoplasma residual no ejaculado (Shamsi et al., 2009). Por outro lado, processos de criopreservação reduzem os níveis dos antioxidantes presentes tanto na célula quanto no plasma seminal, fortalecendo a evidência de que, 27 a 29 de junho de

7 entre as causas da deterioração da qualidade do sêmen após a criopreservação, estão também àquelas ligadas ao estresse oxidativo (Stradaioli et al., 2007). Outro aspecto a ser considerado na avaliação da viabilidade de um ejaculado, é que existe também uma relação inversa entre antioxidante e a qualidade espermática. Observou-se em homens com problemas de fertilidade uma correlação negativa entre atividade antioxidante e vários aspectos da função espermática, como: a capacidade de fusão sptz/ovócito; integridade morfológica e motilidade espermática. Esses indivíduos também apresentavam uma correlação positiva com os níveis de lipoperoxidação (Aitken e Baker, 2002). Vitamina E ou α-tocoferol Vitamina E é um termo geral para designar os compostos lipossolúveis tocoferóis e os tocotrienóis, com atividade biológica e metabolismo distintos. O grande interesse se dá devido às funções antioxidantes que ela desempenha no organismo, promovendo a diminuição do processo de envelhecimento celular. Sua presença na membrana é de extrema importância, pois protege contra a degradação lipídica e também contra o extravasamento de material intracelular (Batista et al., 2007). Os cachaços necessitam elevados níveis vitamínicos, especialmente vitamina E, que atua como um antioxidante de membrana celular, com grande importância para espermatozoide, onde os ácidos graxos são um componente fundamental (Laurent, 2001). Ela localiza-se tanto na membrana celular como nas lipoproteínas circulantes e bloqueia a peroxidação lipídica pela remoção de radicais peroxil, superóxido e hidroxil (Campos, 2004). A adição de Vitamina E e análogos (tocoferol e Trolox ) à ejaculados diluídos tem apresentado efeitos variados sobre a motilidade espermática do sêmen humano (Donnely et al., 1999) e de ovinos (Upreti et al., 1997). Por outro lado, pouco efeito da adição deste antioxidante foi visto no sêmen refrigerado de equinos e no sêmen congelado de homens (Ball et al., 2001). Estes resultados demonstram que o processo de oxidação pode ter efeito diverso, dependendo da espécie animal e/ou das estruturas celulares espermáticas afetadas. Desta forma, os efeitos da Vitamina E podem variar de acordo com a dose utilizada bem como com a quantidade de radicais hidroxilas a serem 27 a 29 de junho de

8 inativados. Dependendo desta proporção, poderá apresentar um efeito antioxidante ou inverso, estimulando o processo oxidativo (Cutler, 1997). O Trolox (100 a 200 μm) adicionado a frações rica e pobre de ejaculados de reprodutores suínos apresentaram os seguintes resultados: 01. Aumento significativo na motilidade espermática; 02. Aumento da velocidade espermática; 03. Redução significativa de células com movimento circular e desvio lateral de cabeça; 04. Aumento no número de espermatozoides com elevada atividade mitocondrial; 05. Efeitos preventivos maiores nas frações pobres em espermatozoides. Isto pode ter ocorrido tanto pela variação da composição do plasma seminal entre as duas frações, quanto pela variação da população espermática (Peña et al., 2003). CONSIDERAÇÕES FINAIS O preciso mecanismo de ação das EROs e sua influência negativa sobre a fisiologia do espermatozoide em espécies mamíferas, ainda não foi totalmente elucidado. Entretanto, o conhecimento atual sobre a ação das substâncias antioxidantes e o papel exercido sobre os sistemas de defesa antioxidante do organismo, em particular da célula espermática e do plasma seminal, torna evidente sua ação contra os danos oxidativos causados pelas EROs. O efeito oxidativo ocasionado pela geração de EROs seria diminuído pela presença de substâncias antioxidantes no plasma seminal ou através de sua adição aos diluentes de sêmen. Porém, os trabalhos têm demonstrado resultados contraditórios referentes a esta atuação sobre a preservação da viabilidade espermática no sêmen fresco e congelado, em virtude da divergência do tipo e da concentração do antioxidante utilizado, assim como seu mecanismo de ação específico referente à proteção de célula espermática (Donelly et al., 1999). Quais os benefícios da adição de antioxidantes, com menor estresse oxidativo e danos espermáticos, proporcionando a preservação da capacidade fecundante dos espermatozoides, ainda tem que ser melhor determinado nas espécies domésticas (Valença e Guerra, 2007). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AITKEN, R.J. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reproduction, Fertility and Development, v.7, p , a 29 de junho de

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