BIOCONVERSÃO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS, DE ANÁPOLIS E REGIÃO, EM PRODUTOS DE INTERESSE BIOTECNOLÓGICO Priscylla Amora Vieira 1,4, Lorena da Fonseca Ferreira 2,4 e Solange Xavier dos Santos 3,4 1 BolsistaPIBIC/CNPq/UEG 2 Voluntário Iniciação Científica PVIC/UEG 3 Pesquisadora Orientadora 4 Curso de Ciências Biológicas, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, UEG RESUMO: O Brasil é um país de grande atividade agrícola e grande gerador de resíduos agroindustriais. O município de Anápolis/GO e região constitui um importante pólo agroindustrial. Foi avaliado o potencial desses resíduos em bioprocessos para obtenção de produtos microbianos. Cinco linhagens foram utilizadas: Pleurotus ostreatoroseus (SXS 532), P. sajor-caju (SXS 512), P. eryngii (SXS 521), Lentinula edodes (SXS 504) e Ganoderma lucidum (SXS 531). Os resíduos constituiram-se de casca/sementes de tomate (TO), bagaço de cana-de-açúcar (CA), coroa-de-abacaxi (AB), palha de arroz (PA), impurezas do milho (IM), palha de milho (PM), palha da guariroba (GU), serragem (SE), farelo de arroz (FA) e Capim (CP), que foram empregados isoladamente e/ou combinados. Cultivos foram realizados em sacos de polipropileno a 27ºC. Crescimento micelial ocorreu em todos os substratos, exceto em SE+FA+IM e IM+CP. As linhagens de Pleurotus spp apresentaram crescimento mais elevado que as demais. Os substratos mais efetivos para a miceliação foram CA+IM, PM+TO, AB, IM+GU, GU, IM. Frutificação ocorreu apenas nas linhagens de Pleurotus spp e nos substratos de melhor miceliação. A linhagem 532 apresentou a maior produtividade de cogumelos. Todas as linhagens produziram celulase (CMCase) e ligninases (MnP e LiP) em todos os substratos testados. A 512 foi a mais efetiva em produzir peroxidades e a 504 em celulase. O substrato GU foi o mais efetivo na produção das enzimas, empatando com AB na produção de LiP. Esses dados são incentivadores para o aproveitamento das potencialidades regionais para bioconversão em produtos de alto valor agregado, uma vez que os fungos estudados são de interesse comestível, medicinal e biotecnológico. Palavras-chaves: cogumelos comestíveis e medicinais, enzimas microbianas, aproveitamento de resíduos. Introdução A economia brasileira é uma das mais importantes baseadas na agricultura, produzindo e exportando café, cana-de-açúcar, soja, mandioca, entre outros. Entretanto, a obtenção desses produtos agrícolas gera grande quantidade de resíduos (Uenojo & Pastore, 2007). Neste contexto encontra-se o município de Anápolis, que é caracterizado como um importante pólo agroindustrial do estado de Goiás, produzindo materiais residuários, que nem sempre costumam ter aproveitamento econômico e podem ser adquiridos a baixo custo ou custo zero. A bioconversão de materiais lignocelulósicos vem recebendo considerável interesse, pois esses materiais representam vasta fonte de material bruto, que podem ser empregados no desenvolvimento de bioprocessos que resultam em produtos de alto valor agregado; entre os quais açúcares fermentáveis, combustíveis, alimentos, fármacos, enzimas e substâncias de interesse industrial (Pandey et al., 2000a; Xavier-Santos, 2003; Uenojo et.al.,2007).
2 A biodegradação dos materiais lignocelulósicos por microrganismos é atribuída à ação de uma série de enzimas extracelulares, muitas das quais, através do desenvolvimento dos processos biotecnológicos, têm sido produzidas comercialmente e assumindo importante papel na indústria, seja no bioprocessamento de material vegetal, convertendo a biomassa em produtos de alto valor comercial, ou ainda em aplicações na indústria de alimentos, de combustíveis, papeleira ou farmacêutica (Guiraud et al., 1999; Duran & Espósito, 2000; Ruegger et.al.,2004). As celulases hidrolisam polissacarídeos das paredes celulares vegetais (Uenojo & Pastore, 2007) e têm amplo potencial de aplicação na indústria de alimentos, têxtil e química (Hang & Woodanms, 1997). As ligninases apresentam elevado poder oxidante, o que faz com que possam ser utilizadas não só sobre seu substrato habitual, mas numa grande variedade de espécies químicas similares à estrutura básica da lignina (Brito et al., 2004), por essa razão têm sido de suma importância para o tratamento enzimático de diferentes efluentes industriais, como o da indústria papeleira, ou ainda na degradação de corantes (Ferrer et al., 1991; Esposito et al., 1991 e 1993; Michel Jr. et al., 1991; Knapp et al., 1995). Além das enzimas, os cogumelos comestíveis e medicinais, constituem produtos de origem microbiana de grande interesse econômico. Muitas espécies de cogumelos podem melhorar a dieta alimentar, ou atuar como remédios, por apresentarem, em sua composição elevado índice de proteínas, vitaminas, minerais, carboidratos, além de compostos bioativos (Zanetti et al., 1997). A proposta desse trabalho consistiu em avaliar o potencial de resíduos agroindustriais gerados no município de Anápolis/GO e região, no desenvolvimento de bioprocessos, para a obtenção de diferentes produtos de origem microbiana, como cogumelos comestíveis e medicinais, e enzimas de interesse industrial. Materiais e Métodos Linhagens estudadas: SXS 504 (Lentinula edodes); SXS 512 (Pleurotus sajor-caju); SXS 521 (P. eryngii); SXS 531 (Ganoderma lucidum) e SXS 532 (P. ostreatoroseus). Preparação dos substratos, inoculação e incubação - Os substratos foram obtidos de diferentes resíduos agroindustriais adquiridos junto a lavouras, feiras, sacolões e indústrias de beneficiamento da região de Anápolis. Os resíduos foram utilizados na forma bruta ou após serem submetidos a um pré-tratamento (lavagem, secagem, trituração), dependendo da origem. O preparo dos substratos foi feito a partir do resíduo puro e/ou combindos, os quais foram hidratados e homogeneizados manualmente (UR 70%), distribuídos (1L) em sacos de
3 polipropileno e esterilizados a vapor, a 121ºC por1 h. A inoculação se deu a partir de discos de cultura miceliada em BDA. Os sacos foram incubados a ± 27 o C. Avaliação do crescimento micelial e indução da frutificação - Semanalmente, foi medidase a extensão da área de colonização do substrato pelo micélio. Os experimentos foram conduzidos em tri ou duplicatas. Após a completa colonização micelial do substrato e a verificação do surgimento de primórdios de frutificação, as culturas foram transferidas para uma estufa germinadora, mantendo-se uma média de 27ºC e UR de 70% a 84%. Cultivo para produção de enzimas - Para esses ensaios foram selecionados os substratos: AB; IM; PM+TO; PA+FA e GU. Uma alíquota de 5g de substrato foi distribuída em erlenmeyer de 250mL. O material foi hidratado e esterilizado, como anteriormente, inoculado com três discos de cultura miceliada em BDA e incubado a 27 C, por 30 dias. Obtenção da solução enzimática bruta - Foi obtida adicionando-se 40 ml de água destilada para cada 5g de substrato miceliado, que foi macerado e filtrado com o auxilio de uma gaze. Avaliação da atividade enzimática - A solução enzimática bruta foi avaliada quanto à atividade de ligninases (MnP e LiP) e celulase (CMCase). A atividade de CMCase foi determinada em 0,8 ml de tampão acetato de sódio 0,2 M ph 5,0, contendo 1% de Carboxi Metil Celulose e 0,2 ml de solução enzimática bruta. O açúcar redutor liberado, após a incubação da mistura reacional a 40ºC por 10 min., foi quantificado pelo método do DNS (Miler, 1959). Uma unidade de CMCase sendo definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de glicose por minuto, nas condições de reação, utilizando curva padrão de glicose. A atividade de MnP e LiP foi determinada segundo Glenn et al.(1986) e Tien & Kirk (1988), respectivamente. Todos os ensaios foram conduzidos em duplicata e os dados apresentados correspondem à média aritmética dos valores obtidos nas duas réplicas. A unidade de atividade enzimática foi expressa em U/g de substrato. Resultados e Discussão Miceliação Foi observado crescimento em todos os substratos, exceto em SE+FA+IM e CP+IM. As linhagens 512, 521 e 532 (todas Pleurotus) apresentaram taxas de crescimento mais elevadas (colonizando toda extensão do substrato entre 21 e 33 dias, em média) do que as linhagens 504 e 531 (que levaram de 61 a 68 dias). Os substratos mais efetivos em promover a miceliação, nos quais foi verificado crescimento de todas as linhagens inoculadas e as maiores taxas de crescimento vegetativo foram, respectivamente, CA+IM, PM+TO, AB, IM+GU, GU, IM (Figura 1). Frutificação - Das cinco linhagens estudadas, em três delas foi verificada a produção de cogumelos (512; 521 e 532). A ausência de frutificação, aliada à baixa velocidade de
4 miceliação nas linhagens 504 e 531, possivelmente se devam a condições ambientais desfavoráveis de cultivo (umidade, ph, temperatura, etc) e não necessariamente à composição dos substratos. Esses casos são merecedores de estudos adicionais envolvendo essas linhagens. Entre os 13 substratos estudados, foi obtida frutificação em cinco deles (GU, IM+GU, PM+TO, IM e AB), os quais foram também os mais efetivos para a miceliação. Exceção feita para CA+IM, que apesar de ter sido efetivo em promover a miceliação, não proporcionou a frutificação. A 532 foi a linhagem que frutificou em mais tipos diferentes de substratos (todos os cinco citados acima), seguida da 521 (que frutificou em GU, AB, PM+TO) e da 512 (que frutificou apenas em IM). A maior média de frutificação (16g peso úmido/l de substrato úmido) foi alcançada pela linhagem 532 no substrato AB (Figura 2). Atividade Enzimática - Todas as linhagens produziram celulase (CMCase) e ligninases (MnP e LiP) em todos os extratos testados. Os maiores níveis médios de atividade de celulase foram obtidos nos ensaios utilizando o substrato GU, sendo que os níveis de LiP foram equivalentes em GU e AB. A análise comparativa entre as linhagens, mostrou os maiores níveis médios de celulase entre a linhagem 504; e os maiores níveis de MnP e LiP entre a linhagem 512 (Tabela 1). Assim, a 512 foi a linhagem mais efetiva em produzir peroxidases e a 504 a mais efetiva em produzir celulase. O substrato GU foi o mais efetivo na produção de todas enzimas, empatando com AB na produção de LiP. Comparando-se a atividade enzimática com a frutificação, pode-verificar que a produção de enzimas, independe da capacidade de frutificação, pois mesmo cultivos que se mantiveram apenas na fase anamórfica, sintetizaram níveis de enzimas comparáveis àqueles que exibiram a fase teleomórfica. Conclusão Os substratos estudados se mostraram adequados para promover a miceliação, havendo crescimento em quase 100% deles. Foi verificada relação entre a miceliação e frutificação, de modo que os cultivos de maior crescimento micelial foram os que mais produziram cogumelos (linhagens: 512, 521 e 532; substratos: GU, IM+GU, PM+TO, IM e AB). Além disso, esse padrão de crescimento (tanto vegetativo, quanto reprodutivo) esteve relacionado com o grau de parentesco das linhagens, aquelas do gênero Pleurotus spp foram mais eficientes na miceliação e frutificação, do que aquelas pertencentes a outros gêneros. Por outro lado, a produção de enzimas, não mostrou relação aparente com a velocidade de miceliação ou a frutificação, pois mesmo cultivos que se mantiveram apenas na fase anamórfica, sintetizaram níveis de enzimas comparáveis àqueles que exibiram a fase teleomórfica. As linhagens 504 e 512 foram respectivamente as mais efetivas em produzir
5 celulase e peroxidases; o substrato GU foi o mais efetivo na produção das enzimas, empatando com AB na produção de LiP. Os dados obtidos são indicativos de que os substratos estudados têm potencial para serem utilizados em bioprocessos para a obtenção dos produtos microbianos em questão, merecendo aprofundamento nos estudos em direção à otimização dos processos. Referências Bibliográficas Brito, N.N. De; Zamora, P.P.; Neto, A.L. De O.; De Battisti, A.; Paterniani, J.E.S.; Pelegrini, R.T. 2004. Utilização de fungos na remediação de efluentes industriais. IV Fórum de Estudos Contábeis 2004. Faculdades Integradas Claretianas - Rio Claro/SP Brasil. Durán, N.; Esposito, E. 2000. Potential applications of oxidative enzymes and phonoloxidase-like compouds in wastewater and soil treatment: a review. App. Catal. B. Env., v.28, p.83-89. Esposito, E.; Canhos, V. P.; Durán, N. 1991.Screenning of lignin-degrading fungi for removal of color from kraft mill wastwater with no additional extra carbon-source. Biotechnol. Lett., v. 13, p.571576. Esposito, E.; Innocentini-Mel, L. H.; Ferraz, A.; Canhos, V. P.; Durán, N. 1993. Phenoloxidases and hidrolases from Pycnoporus sanguineus (UEC-1050 strain); applications. J. Bioctechnol., v. 29, p. 219-228. Ferrer, I.; Dezotti, M.; Durán, N. 1991. Decolorization of kraft effluent by free and immobilized lignin peroxidaases and horseradish peroxidase. Biotechnol. Lett., v. 13, n. 8, p. 577-582. Glen, J. K.; Akileswarean, L.; Gold, M. H. 1986. Mn (II) oxidation is the principle function of the extracelular Mn-peroxidaase from Phanerochaete chrysosporium Arch. Biochem. Biophys., v. 251, p. 688-696. Guiraud, P.; Steiman, R. ; Ait-Laydi, L.; Seigle -Murandi, F. 1999. Degradation of phenolic and chloroaromatic compounds by Coprinus spp. Chemosphefe, v.39, p.2775-2789. Knapp, J. S.; Newby, P. S.; Reece, L. P. 1995. Decolorization of dyes by wood-rotting basidiomycete fungi. Enzyme Microb. Technol., v. 17, p. 664-668. Michel Jr.; F. C.; Dass, B. S.; Grulke, E. A.; Reddy, C. A. 1991.Role of manganese peroxidases and lignin peroxidases of Phanerochaete chrysosporium in the decolorization of kraft bleach plant effluent. Appl. Environ. Microbiol, v. 57, n. 8, p.2368-2375. Miller, G. L.. 1959.Use of dinitrossalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem., v. 31, p. 426-428. Pandey, A.; Soccol, C. R.; Mitchell, D. 2000. New developments in solid state fermentation: I- bioprocesses and products. Process Biochem., v.35, p.1153-1169. Saliba, E.De O.S.; Rodriguez, N.M.; Morais, S.A.L.De. 2001.Ligninas Métodos de obtenção e caracterização química. Ciência Rural, v.31 (5), p. 917-928. Tien, M.; Kirk, K. T. 1988. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. In: WOOD, K.; KELLOGG, S. T. (ed.). Methods Enzymol., v.161, part B, p.238-249. Uenojo, M.; Pastore, M.G.,2007. Pectinases: aplicações industriais e perspectivas. Quim. Nova, v.30 (2), p. 388-394. Xavier-Santos, S. 2003. Diversidade, isolamento em cultura e perfil enzimático de fungos decompositores de madeira da estação ecológica do Noroeste Paulista São José do Rio Preto / Mirassol, SP. Tese de Doutorado. UNESP, Rio Claro, SP. 222p. Zanetti, A. L.; Ranal, M. A.1997 Suplementação da cana-de-açúcar com guandu no cultivo de Pleurotus sp.. Florida. Rev. Pesq. Agropec. Bras., v.32 (9).
6 Cobertura Micelial(cm) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 PM PM+TO AB CA+IM IM+GU GU IM CA PA+FA IM+TO SE+FA+IM AB+FA IM+CP 531 504 512 521 532 Peso fresco (g)/ L de substrato 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 PM+TO PM+TO AB AB IM+GU GU GU IM IM Substratos 521 532 512 Substratos Figura 1 Crescimento micelial de diferentes linhagens fúngicas cultivadas em diferentes substratos. Medida tomada aos 27 dias de incubação a 27 o C. Figura 2 Produtividade de cogumelos originários de cultivos em diferentes substratos. Tabela 1 Atividade enzimática das diferentes linhagens cultivadas em diferentes substratos. Enzima Celulase (U/g) MnP (U/g) LiP (U/g) Linhagem Substrato GU IM AB PM+TO PA+FA SXS 504-11,4 11,7-35,6 SXS 512 31,7 8,5 12,3 13,8 10,2 SXS 521 16,8 6,0 6,2 14,0 6,6 SXS 531 - - - - 11,7 SXS 532 20,3 16,6 3,3 5,5 10,7 SXS 504-8922,1 - - 6176,2 SXS 512 21813,3 17998,2 - - 4548,1 SXS 521-17524,3 - - 7217,1 SXS 531 - - - - 12064,9 SXS 532-8841,1-6880,9 4369,9 SXS 504-4305,9 15154,3-3613,0 SXS 512 17846,7 7663,2 27290,8 5700,9 2431,9 SXS 521 18851,1 6379,8 9448,8 3817,9 3031,8 SXS 531 - - - - 4394,2 SXS 532 7579,5 3106,2 11113,5 3236,4 2297,1
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