Exercício 4 Sequenciamento por finalizadores de cadeia Sequenciamento do DNA: os finalizadores A determinação da seqüência de bases de um segmento de DNA é um passo crítico em muitas aplicações da Biotecnologia. método mais utilizado hoje emprega componentes chamados de "finalizadores de cadeia", um termo que descreve o efeito letal destes componentes na síntese do DNA e a natureza das enzimas DNA polimerases. Estas enzimas lêem a seqüência de uma fita simples de DNA e sintetizam uma fita complementar. s finalizadores de cadeia nos permitem verificar a ordem na qual as enzimas DNA polimerases incorporam as bases à nova fita de DNA, e então, deduzir a seqüência da fita molde. que são estes "finalizadores de cadeia" e como eles bloqueiam a síntese do DNA? s "finalizadores de cadeia" são moléculas muito semelhantes aos nucleotídeos normais, mas sem o grupo essencial hidroxila () na posição 3' (Figura 1). Na duplicação do DNA, um nucleotídeo complementar à base molde é incorporado na devida posição. A DNA polimerase incorpora este nucleotídeo à fita de DNA em formação inserindo uma ponte de fosfodiéster entre o grupo fosfato na posição 5' do novo nucleotídeo e o grupo na posição 3' do último nucleotídeo da cadeia. A DNA polimerase não pode sintetizar o DNA sem um grupo 3' preexistente para ser usado como um ponto inicial (daí a necessidade de um fragmento inicial - primer - para o início da síntese de DNA). Se a DNA polimerase incorpora erroneamente um finalizador de cadeia no lugar de um nucleotídeo normal, nenhum nucleotídeo poderá então ser adicionado posteriormente e a síntese do DNA estará finalizada.
base base C 2 C 2 Deoxinucleosídio Dideoxinucleosídio base base C 2 C 2 N 3 Azidotimidina Aciclovir Figura 1. Um deoxinucleotídeo normal com os "finalizadores de cadeia". Todos são incorporados ao DNA em sua forma trifosfato. s finalizadores de cadeia utilizados no sequenciamento do DNA são os dideoxinucleotídeos (Figura 1). Como os dideoxinucleotídeos nos levam a identificar a seqüência de bases de uma molécula de DNA? A reação de sequenciamento contém a amostra de DNA a ser sequenciada, os iniciadores (primers) e os deoxinucleotídeos normais radioativos (deoxiadenosina [da], dg, dc, dt). Esta solução inicial é dividida em 4 partes e cada parte é então acrescida de um dideoxinucleotídeo diferente: dideoxiadenosina (dda), ddg, ddc ou ddt. Adiciona-se então a enzima DNA polimerase e serão sintetizadas novas moléculas de DNA. Contudo, ocasionalmente é inserido um dideoxinucleotídeo no lugar de um deoxinucleotídeo normal e a cadeia de DNA pára de ser sintetizada. Na solução de reação contendo dda (a reação A), alguma porcentagem das novas moléculas vão adicionar um dda onde houver uma T na fita molde. resultado é um grupo de novas moléculas as quais terminam em cada T que aparece na fita molde. Similarmente, na reação G, algumas das novas moléculas vão terminar a cada C da fita molde. Na reação C, algumas das novas
moléculas vão terminar a cada G da fita molde e na reação T, as moléculas terminam a cada A da fita molde. Ao seu término, as reações de síntese (reação-a, -G, -C e -T) são desnaturadas pelo calor e submetidas à eletroforese em um gel de poliacrilamida. As moléculas recémsintetizadas são separadas de acordo com o seu tamanho e visualizadas pela exposição do gel a um filme fotográfico (lembre-se de que os novos nucleotídeos são radioativos). A reação-a vai mostrar bandas que correspondem, em tamanho, às posições das T na fita molde. A reação-g vai mostrar bandas cujos tamanhos correspondem às posições das C e assim por diante. A seqüência da nova fita de DNA é "lida" na seqüência de bandas que aparecem no gel a partir da porção inferior (final do gel), onde estão os fragmentos menores. s "terminadores de cadeia" são utilizados como drogas anti-virais. As substâncias químicas utilizadas inicialmente em laboratórios de pesquisa, encontram freqüentemente uma utilização na Medicina. Componentes que afetam os processos biológicos são importantes na pesquisa básica e algumas vezes têm utilidade terapêutica. s finalizadores de cadeia são um bom exemplo de tais componentes. Inicialmente eles foram utilizados no sequenciamento do DNA (1995) e, posteriormente, como uma droga anti-aids e como a melhor droga disponível antiherpes (desta classe de componentes). Como os finalizadores de cadeia são utilizados na luta contra a AIDS e infecções pelo vírus do herpes As infecções virais são combatidas da mesma forma que é realizado o sequenciamento: finalizando a síntese de DNA. Para que um vírus estabeleça uma infecção, ele necessita multiplicar o seu ácido nucléico. Bloquear esta duplicação é uma forma potencialmente eficaz de combater a infecção pelo vírus, mas o bloqueio da síntese do DNA pode ser prejudicial tanto para o vírus como para o paciente. combate ao vírus do herpes e ao vírus da AIDS pode ser feito usando-se drogas que inibem a duplicação porque eles codificam as suas próprias enzimas de síntese de DNA, as quais têm propriedades únicas que podem ser exploradas. vírus da AIDS (uman Immunodeficiency Virus - IV) é um vírus de RNA. Ele codifica uma enzima especial, chamada transcriptase reversa, que sintetiza o DNA utilizando o RNA viral como molde. Este passo é essencial para a infecção pelo IV. s finalizadores de cadeia vão interferir neste passo. A enzima transcriptase reversa
é um bom alvo para as drogas finalizadoras de cadeia porque é uma enzima descuidada : ela incorpora mais facilmente nucleotídeos errados ou os finalizadores de cadeia do que uma polimerase humana. Além disso, a transcriptase reversa não tem a propriedade de rever os nucleotídeos incorporados e remover aqueles incorretos. á outros aspectos importantes na utilização das drogas finalizadoras de cadeia além da sensibilidade das polimerases virais. A droga deve permanecer no corpo e ser absorvida pelas células-alvo. A forma trifosfato ativa dos finalizadores de cadeia (demonstrada na Figura 2 pelo nucleotídeo que está sendo incorporado na cadeia) não é absorvida pelas células, de forma que as drogas são ministradas na forma desfosforilada (demonstrada na Figura 1). Quando estes componentes entram na célula, as enzimas humanas são capazes de adicionar grupos fosfato (fosforilar as moléculas) para ativá-las. Diferentes componentes são absorvidos e fosforilados com eficiências diferentes. Então o desenvolvimento de uma nova droga depende não apenas de sua toxicidade para o vírus, mas também de como ela é metabolizada no corpo humano. s finalizadores de cadeia freqüentemente empregados contra o vírus da AIDS são: azidotimidina (AZT), dideoxicitosina (ddc; o mesmo componente usado no sequenciamento do DNA) e dideoxinosina (ddi) (Figura 1). AZT, um análogo da timidina, é incorporado à cadeia de DNA que está sendo sintetizada no lugar da citosina. A inosina é um análogo de nucleotídeo que é idêntico à adenosina, exceto pela presença de um grupo amino. As células sintetizam inosina e esta é convertida diretamente em adenosina. Quando a ddi é ministrada como droga, ela entra na célula e é convertida rapidamente em dda. A dda é incorporada pela transcriptase reversa no lugar da adenosina normal. Estas drogas têm efeitos colaterais aos pacientes. Embora a DNA polimerase humana seja menos sensível às drogas do que a transcriptase reversa, a síntese de DNA nas células humanas normais também é afetada. AZT é tóxico particularmente à medula óssea, enquanto o ddc e o ddi afetam os nervos periféricos. Infelizmente, o IV adquire resistência a estes componentes. s vírus do herpes são vírus de DNA com genomas relativamente grandes. Eles codificam muitas de suas próprias enzimas de duplicação, incluindo a DNA polimerase. Após a infecção inicial, o vírus do herpes permanece no corpo no estado inativo (latente), do qual ele pode ser ativado e causar a doença. s vírus do herpes
simples 1 (SV-1) e 2 (SV-2) causam herpes labial e genital, respectivamente. vírus do herpes (Varicella-zoster virus) causa a catapora. vírus do herpes simples 1 pode ser tratado com o terminador de cadeia aciclovir (Figura 1). aciclovir (conhecido comercialmente como Zovirax) é relativamente atóxico para o corpo humano porque as nossas células não conseguem fosforilar esta droga que permanece na forma inativa. Contudo o vírus do herpes codifica uma enzima que fosforila o aciclovir de forma que este se tornará ativo apenas naquelas células infectadas pelo vírus. aciclovir é um análogo da guanina (G) e é incorporado onde houver uma citosina na fita molde. Uma vez incorporado o aciclovir finaliza a síntese do DNA viral e inibe a atividade da polimerase do vírus do herpes. Questões 1. A seqüência inteira da molécula de DNA molde (representada pela fita de DNA de papel) está presente no gel de sequenciamento? 2. Se você acrescentar alguns dideoxinucleotídeos no meio de uma cultura de células, qual (se há algum) processo celular seria o mais afetado? 3. (Texto a seguir) s dideoxinucletídeos e outras moléculas "finalizadoras de cadeia" são utilizados na Medicina como drogas no combate à AIDS. Porque?
Iniciadores e fita molde para o Sequenciamento do DNA