UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária

0 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária Tese Antioxidantes na produção in vitro de embriões e criopreservação de sêmen de ovinos Jorgea Pradieé Pelotas, 2013

1 JORGEA PRADIEÉ Antioxidantes na produção in vitro de embriões e criopreservação de sêmen de ovinos Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do conhecimento: Reprodução Animal). Orientador: Thomaz Lucia Jr. Comitê de orientação: Lígia M. Cantarelli Pegoraro Arnaldo Diniz Vieira Rafael Gianella Mondadori Pelotas, 2013

2 Dados de catalogação na fonte: ( Marlene Cravo Castillo CRB-10/744 ) P896a Pradiee, Jorgea Antioxidantes na produção in vitro de embriões e criopreservação de sêmen de ovinos. / Jorgea Pradiee ; orientador Thomaz Lucia Jr. - Pelotas,2013.-69f. : il..- Tese ( Doutorado) Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Faculdade de Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2013. 1.Cisteina 2.Espermatozoides 3.Oócito 4.βmercaptoetanol. I.Lucia Jr., Thomaz(orientador) II.Título. CDD 636.0824

3 Banca examinadora: Prof. Dr. Thomaz Lucia Jr. Profa. Dra. Mari Lourdes Bernardi Profa. Dra. Carine Dahl Corcini Prof. Dr. Gabriel Ribas Pereira

4 À Deus, força suprema que nos guia e nos permite o aperfeiçoamento moral; Aos meus pais, Luciana e Jorge pelo incentivo e incondicional amor; Ao meu grande amigo e amor Dirceu, como traduz Saint-Exupéry: Amar não é olhar um para o outro, mas olhar juntos na mesma direção! À minha família e aos amigos. Pelo apoio, paciência, compreensão, encorajamento, carinho e amor... Dedico.

5 Agradecimentos Ao Programa de Pós-graduação em Veterinária/ UFPEL, pela oportunidade de realizar o doutorado; Ao meu orientador Thomaz Lucia Jr., por me aceitar e proporcionar o aperfeiçoamento dos conhecimentos científicos; A EMBRAPA Clima Temperado, pelo consentimento da bolsa no primeiro ano do doutorado; pela oportunidade de aprendizado e execução dos trabalhos no Laboratório de Reprodução Animal; A pesquisadora Dra. Lígia M. Cantarelli Pegoraro, por me ensinar, incentivar e por ter acreditado em mim como co-orientada. Aos co-orientadores: Prof. Dr. Arnaldo Diniz Vieira e Prof. Dr. Rafael Gianela Mondadori, o meu especial agradecimento, vocês foram muito importantes na minha formação, desde a escrita dos projetos, execução dos trabalhos até a escrita final dos artigos. Aos professores Ivan Bianchi, Carine Dahl Corcini, Carlos Eduardo da Rosa (Nino); aos funcionários, Sr. Paulo (UFPel), D.Ledi (Embrapa) e Giovane (Embrapa) com os quais convivi durante estes quatro anos, pelo apoio prestado no decorrer do curso, e pela amizade. Aos colegas e amigos do REPROPEL e Laboratório de Reprodução Animal da EMBRAPA: Liziane, Elisangela, Elisa, Alex, Gustavo, Raquel, Karina, Fabiana, Carlos, Zilah e Kauê; e também a todos os estagiários deste mesmo grupo, que foram muitos desde que entrei, mas especialmente aos que mais me acompanharam: Estela, Tainã, José César, Andressa, Bruna, Stela Mari, Anderson, Guilherme e Luzia, pela amizade, companheirismo e ajuda durante as fases de campo dos experimentos. À minha família e a todos aqueles que, de alguma forma, auxiliaram na realização deste projeto, deixo meu agradecimento e o desejo de sucesso. Muito obrigada!

6 Resumo PRADIEE, Jorgea. Antioxidantes na produção in vitro de embriões e criopreservação de sêmen de ovinos. 2013. 69f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Na tentativa de diminuir os danos estruturais na membrana plasmática, devido aos radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS), os antioxidantes β- mercaptoetanol (BME) e cisteína (CIS) foram testados na criopreservação de sêmen e na maturação (MIV) e cultivo (CIV) in vitro de embriões de ovinos. Amostras de sêmen de quatro carneiros da raça Crioula Lanada foram coletadas com vagina artificial, duas vezes por semana (n = 23). As amostras dos quatro machos foram combinadas em pool e divididas em seis tratamentos: T1, Controle, sem antioxidante; T2, com 2mM BME; T3, com 5mM BME; T4, com 2mM BME e 5mM de cisteína; T5, com 5mM BME e 5mM de cisteína; e T6 com 5mM de cisteína. O sêmen foi diluído em tris-gema-glicerol e estocado em palhetas de 0,25 ml contendo 100 x 10 6 espermatozoides. O resfriamento e o congelamento foram realizados em máquina TK3000 e o descongelamento foi realizado a 37ºC por 20 s. A motilidade, a integridade da membrana espermática e do acrossoma e a atividade mitocondrial, antes do congelamento e após o descongelamento, não diferiram entre os tratamentos (P> 0,05). A quantificação de ROS e da atividade antioxidante total pós-descongelamento foram semelhantes entre os tratamentos (P> 0,05). Nas concentrações testadas, a inclusão de BME e cisteína não influenciou a viabilidade espermática pós-descongelamento. No primeiro experimento de PIV, a inclusão de 20 μm de BME na MIV e CIV de embriões foi comparada a um tratamento controle sem antioxidantes. Não houve efeito deletério do antioxidante sobre a taxa de clivagem (Controle: 70,0%; BME: 69,8%). Porém, a taxa de desenvolvimento até o estágio de blastocisto no tratamento BME (5,2%) foi inferior (P<0,001) à do controle (16,9%). No segundo experimento, foi testada a associação de 50 μm de BME e 600 μm de CIS, na MIV e CIV. Não houve diferença entre os tratamentos controle e BME/CIS (P>0,05), quanto às taxas de clivagem (60,3% e 64,3%, respectivamente) e de desenvolvimento embrionário (33,6% e 36,6%, respectivamente). A adição isolada de 20 μm de BME na MIV e CIV de embriões ovinos foi associada com redução no desenvolvimento embrionário até blastocisto. Porém, a adição dos antioxidantes BME e cisteína, em associação, não afetou as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário até blastocisto. Assim, a associação dos antioxidantes BME e CIS usados no congelamento de sêmen ovino e na PIV, não promoveu melhora dos tratamentos em que foram adicionados, ainda que em concentrações diferentes. Palavras-chave: β-mercaptoetanol. Cisteína. Espermatozoides. Oócito.

7 Abstract PRADIEE, Jorgea. Antioxidantes na produção in vitro de embriões e criopreservação de sêmen de ovinos. 2013. 69f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. In an attempt to diminish the structural damage to the plasma membrane, due to free radicals and reactive oxygen species (ROS), the antioxidants β- mercaptoethanol (BME) and cysteine (CIS) were tested for semen cryopreservation and in vitro maturation (IVM) and culture (IVC) of ovine embryos. Semen samples from four rams of the Crioula Lanada breed were collected with artificial vagina twice weekly (n = 23). Samples of four rams were pooled and split in six treatments: T1, control without antioxidant, T2, with 2mM BME, T3, with 5mM BME, T4, with 2mM BME and 5mM cysteine; T5, with 5 mm BME and 5mM cysteine, and T6 with 5 mm cysteine. Semen was diluted in trisegg yolk-glycerol and stored in straws of 0.25 ml containing 100 x 106 spermatozoa. Cooling and freezing were performed using a TK3000 and thawing was performed at 37 C for 20 s. Sperm motility, membrane integrity and mitochondrial activity and acrosome, before freezing and after thawing, did not differ between treatments (P> 0.05). Quantification of ROS and total antioxidant activity after thawing were similar between treatments (P> 0.05). At the tested concentrations, the inclusion of BME, and cysteine did not affect sperm viability after thawing. In the first experiment of IVP, the inclusion of 20 mm of BME in IVM and IVC of embryos was compared to a control treatment without antioxidants. There was no deleterious effect of antioxidant on the cleavage rate (control: 70.0%; BME: 69.8%). However, the rate of development to the blastocyst stage with BME (5.2%) was lower (P <0.001) than with the control (16.9%). In the second experiment, we tested the association of 50 mm BME and 600 mm of CIS in IVM and IVC. There was no difference between control and BME/CIS (P> 0.05), for cleavage (60.3% and 64.3%, respectively) and embryonic development rates (33.6% and 36.6 %, respectively). The addition of 20 mm of isolated BME in IVM and IVC sheep embryos was associated with decreased embryonic development to blastocyst. However, the addition of antioxidants BME, and cysteine in combination, did not affect the rates of cleavage and embryo development to blastocyst. Therefore, the combination of antioxidants and CIS BME used in freezing ram semen and PIV, did not improve the treatments that have been added, albeit at different concentrations. Keywords: β-mercaptoethanol. Cysteine. Spermatozoa. Oocyte.

8 Lista de Figuras FIGURA 1 FIGURA 2 Taxa de re-expansão (24 h) e eclosão (48 h) por tratamento, durante cultivo suplementar in vitro após reaquecimento de embriões vitrificados. Controle: sem antioxidantes. BME: inclusão de 20µM de BME nos meios de MIV e CIV...57 Taxa de re-expansão (24 h) e eclosão (48 h) por tratamento, durante cultivo suplementar in vitro após reaquecimento de embriões vitrificados. Controle: sem adição de antioxidantes. BME/CIS: inclusão de 50µM de BME e 600µM de CIS nos meios de MIV e CIV...58

9 Lista de Tabelas ARTIGO 1. Efeito antioxidante de β-mercaptoetanol e cisteína sobre a viabilidade pós-descongelamento de sêmen de ovinos da raça Crioula Lanada TABELA 1 TABELA 2 Motilidade, integridade da membrana espermática (MEMB), do acrossoma (ACR) e atividade mitocondrial (MIT) de sêmen ovino antes e após descongelamento...35 Motilidade espermática de sêmen ovino em dois períodos pósdescongelamento por tratamento...36 TABELA 3 Produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e capacidade antioxidante total (TOSC) de sêmen ovino pós-descongelamento por tratamento...37 ARTIGO 2. Efeito dos antioxidantes β-mercaptoetanol e cisteína sobre a maturação e cultivo in vitro de embriões ovinos TABELA 1 TABELA 2 Taxas de clivagem, desenvolvimento embrionário até o oitavo dia após a inseminação (D8) e rendimento global de acordo com a inclusão de β-mercaptoetanol (20 μm) nos meios de maturação e cultivo in vitro...55 Taxas de clivagem, desenvolvimento até o sétimo dia após a inseminação (D7) e rendimento global de acordo com a inclusão de β-mercaptoetanol (50µM) e cisteína (600µM) nos meios de maturação e cultivo in vitro...56

10 Sumário 1 INTRODUÇÃO... 12 2 OBJETIVOS... 14 3 ARTIGOS... 15 3.1 Artigo 1. EFEITO ANTIOXIDANTE DE β-mercaptoetanol E CISTEÍNA SOBRE A VIABILIDADE PÓS-DESCONGELAMENTO DE SÊMEN DE OVINOS DA RAÇA CRIOULA LANADA... 15 Resumo... 16 1.Introdução... 17 2.Materiais e métodos... 18 2.1 Processamento do sêmen e avaliações... 19 2.2 Análises Bioquímicas... 21 2.2.1 Espécies reativas de oxigênio (ROS)... 21 2.2.2 Capacidade antioxidante total (TOSC)... 22 4 Resultados... 23 5Discussão... 24 6 Conclusão... 26 3.2 Artigo 2 EFEITO DOS ANTIOXIDANTES β-mercaptoetanol E CISTEÍNA SOBRE A MATURAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES OVINOS... 38 Resumo... 39 1 Introdução... 39 2 Material e métodos... 42 2.1 Primeiro experimento: BME na MIV e CIV de embriões ovinos... 42 2.2 Segundo experimento: BME associado à CIS na MIV e CIV de embriões ovinos... 44 2.3 Análise dos dados... 44 3 Resultados... 44

11 4 Discussão... 45 5 Conclusões... 47 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 59 5 REFERÊNCIAS GERAIS... 61

12 1 INTRODUÇÃO Estratégias da reprodução assistida que maximizem o potencial reprodutivo, como a criopreservação de sêmen, a produção in vitro de embriões (PIV) e a criopreservação de embriões tem apresentado crescimento substancial nos últimos anos (SALAMON & MAXWELL, 2000; MARTINÉZ et al., 2006; BUCAK et al., 2008; HOSSEINI et al., 2011; ROMÃO et al., 2013). Atualmente a PIV ovina vem sendo melhorada (COGNIÉ et al., 2003) e ganhando espaço no Brasil (FONSECA et al., 2010) já que permite que uma fêmea doe um maior número de oócitos desde antes da sua puberdade até a senilidade, e até mesmo num período recente após sua morte. Outra biotécnica importante, podendo ser associada à PIV, é a criopreservação de oócitos, embriões e sêmen, permitindo a maximização da eficiência reprodutiva, além da preservação do material genético tanto de animais de alto valor quanto de animais em risco de extinção. Isto possibilitará, para os últimos, a formação de bancos de germoplasma, ou seja, promover a preservação ex situ de raças ovinas como a Crioula Lanada. Entre os entraves que limitam a PIV de embriões ovinos, pode-se destacar, durante a fase de maturação in vitro (MIV), a maturação citoplasmática e nuclear do oócito. Portanto, é imprescindível que o oócito esteja maduro para que, na fase de fecundação in vitro (FIV), possa ser fecundado pelo espermatozoide. Outro fator importante é a contribuição do macho para a FIV, pois diferenças são encontradas na fertilidade entre indivíduos. Quanto ao desenvolvimento embrionário na etapa de cultivo in vitro (CIV), deve-se levar em consideração que a PIV, por ser um sistema fechado, não permite trocas das substâncias metabolizadas no meio, tornando-se saturado. Assim, visando mimetizar os sistemas enzimáticos específicos que atuam in vivo, antioxidantes estão sendo cada vez mais utilizados na PIV na tentativa de

13 diminuir os danos causados às células (DE MATOS et al., 2002; BAI et al., 2008), sobretudo aos lipídeos da membrana plasmática, proteínas, carboidratos e ácidos nucleicos, que alteram a estrutura, a integridade e fluidez das membranas biológicas (NIKI et al., 2009). A origem de tais injúrias se dá pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) que são produzidos principalmente pelas mitocôndrias (KOWALTOWSKI et al., 2009). Conforme já descrito em outras espécies, (FUNAHASHI et al., 2005; FURNUS et al., 2008) a adição dos antioxidantes β-mercaptoetanol (BME) e cisteína (CIS) (BAI et al., 2008) aos meios de maturação in vitro (MIV) e cultivo in vitro (CIV) seria uma alternativa para minimizar tais prejuízos. A integridade de membranas biológicas pós-descongelamento é imprescindível para a funcionalidade dos espermatozoides criopreservados. Assim como observado na PIV, dentre os fatores que influenciam na qualidade espermática estão a formação de radicais livres e ROS que provocam a redução da motilidade espermática (BILODEAU et al., 2001), além de comprometer sua viabilidade devido a danos nas membranas e material genético (PERIS et al., 2007). Diferentes antioxidantes, enzimáticos e não enzimáticos, como a catalase, análogos da vitamina E, glutationa (GSH), CIS, entre outros, vêm sendo testados como aditivo no congelamento de sêmen ovino (BUCAK et al., 2008; MAIA et al., 2010; SICHERLE et al., 2011). Entretanto, os resultados obtidos não permitiram um incremento significativo na viabilidade espermática póscongelamento. Esta resposta pode ter sido provocada pela rota de atuação dos antioxidantes utilizados, que não proporcionaram a adequada produção de antioxidantes intracelulares. Para obter tal resultado sugere-se a abordagem que visa disponibilizar precursores de GSH, que é o principal antioxidante intracelular (LUBERDA, 2005). Agentes derivados dos tióis, como o BME, atuam na cascata de GSH mediante disponibilização de CIS. Como não existem relatos do uso de BME no congelamento de sêmen ovino, este trabalho objetiva determinar o efeito do BME associado ou não a CIS como aditivos ao diluente de congelamento de sêmen, e utilizar também a combinação destes dois antioxidantes nas etapas de MIV e CIV na produção in vitro de embriões ovinos.

14 2 OBJETIVOS A. Objetivo geral Melhorar a qualidade pós-descongelamento de sêmen de ovinos da raça Crioula Lanada e a eficiência da PIV de embriões ovinos, pela adição dos antioxidantes BME e cisteína, ao diluente de congelamento de sêmen e aos meios de MIV e CIV. B. Objetivos específicos Determinar o efeito da adição de BME e CIS ao diluente de congelamento, na qualidade pós-descongelamento do sêmen de ovinos da raça Crioula Lanada; Determinar a eficiência dos antioxidantes BME e CIS na MIV e CIV de embriões ovinos.

15 3 ARTIGOS 3.1 Artigo 1. EFEITO ANTIOXIDANTE DE β-mercaptoetanol E CISTEÍNA SOBRE A VIABILIDADE PÓS-DESCONGELAMENTO DE SÊMEN DE OVINOS DA RAÇA CRIOULA LANADA Pradieé, Jorgea; Cardoso, Tainã, F.; Fernandes, Estela, S.; Lazzari, José César; Gonçalves, Alexander, O.; Gastal, Gustavo D.; da Rosa, Carlos Eduardo; Vieira, Arnaldo D.; Mondadori, Rafael G.; Pegoraro, L.M.C.; Lucia Jr., Thomaz. Será submetido à revista Ciência Rural (Formatado segunda as normas da revista Ciência Rural)

16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Efeito antioxidante de β-mercaptoetanol e cisteína sobre a viabilidade pósdescongelamento sêmen de ovinos da raça Crioula Lanada Antioxidant effect of β-mercaptoethanol and cysteine on post-thawing sperm viability in rams of Crioula Lanada breed Resumo O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da inclusão dos antioxidantes β-mercaptoetanol (BME) e cisteína no diluente de congelamento sobre a viabilidade do sêmen ovino após o descongelamento, considerando que a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas a partir dos componentes celulares presentes no sêmen é prejudicial para a viabilidade espermática. Amostras de sêmen de quatro carneiros da raça Crioula Lanada foram coletadas com vagina artificial, duas vezes por semana, totalizando 23 coletas. As amostras foram combinadas em pool, incluindo sêmen dos quatro machos, e divididas em seis tratamentos: T1, Controle, sem inclusão de antioxidante; T2, com 2mM BME; T3, com 5mM BME; T4, com 2mM BME e 5mM de cisteína; T5, com 5mM BME e 5mM de cisteína; e T6 com 5mM de cisteína. O sêmen foi diluído em tris-gema-glicerol e estocado em palhetas de 0,25 ml contendo 100 x 10 6 espermatozoides. O processo de resfriamento e congelamento foi realizado em máquina TK3000 e o descongelamento foi realizado em banho-maria 37ºC por 20 s. A motilidade espermática, a integridade da membrana espermática e do acrossoma e a atividade mitocondrial, antes do congelamento e após o descongelamento, não diferiram entre os tratamentos (P > 0,05). A quantificação de ROS e da atividade antioxidante total pósdescongelamento também foram semelhantes entre os tratamentos (P > 0,05). Nas concentrações testadas, a inclusão de BME e cisteína, não influenciou a viabilidade espermática pós-descongelamento. Abstract The objective of this study was to evaluate the effect of the inclusion of the antioxidants β-mercaptoetanol (BME) and cysteine in freezing extenders on the postthawing ram sperm viability, considering that reactive oxygen species (ROS) generated from cellular components present in sperm are detrimental to sperm viability. Ejaculates were collected from four rams of the Crioula Lanada breed through an artificial vagina, twice a week, totaling 23 per ram. Ejaculates were pooled, including sperm from all four rams in the pools and subsequently split in six treatments: Control, with no antioxidant; 2mM BME; 5mM BME; 2mM BME and 5mM cysteine; 5mM BME and 5mM cysteine; and 5mM cysteine. Sperm samples were diluted in tris-egg yolk-glycerol and stored in 0.25 ml straws containing 100 x 106 spermatozoa. Cooling and freezing were conducted in a TK3000 machine and thawing was done in water bath at 37ºC for 20 s. Sperm motility, membrane integrity, acrosome integrity and mitochondrial functionality, both pre-freezing and post-thawing did not differ among treatments (P > 0.05). The amount of ROS and the total antioxidant activity were also similar across treatments (P > 0.05). The

17 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 inclusion of BME and cysteine at the tested concentrations had no influence on postthawing sperm viability. 1. Introdução Dentre os fatores que influenciam na qualidade espermática pós-descongelação estão os radicais livres, radicais hidroxil e as espécies reativas de oxigênio (ROS) (peróxido de hidrogênio, ânion superóxido) que provocam a redução da motilidade espermática (BILODEAU et al., 2001), além de comprometer sua viabilidade devido a danos nas membranas e no material genético (SINHA et al.,1996; PERIS et al., 2007), cuja integridade é imprescindível para a funcionalidade dos espermatozoides criopreservados. A sensibilidade dos espermatozoides à lipoperoxidação e ao ataque de radicais livres ocorre em função do alto teor de ácidos graxos poli-insaturados presente em suas membranas e também da pouca quantidade de antioxidantes presentes no seu citoplasma (AGARWAL et al., 2005). Os danos atribuídos aos radicais livres e as ROS durante os processos de congelamento e descongelamento, podem ser reduzidos através da suplementação de antioxidantes ao meio diluente. Diferentes antioxidantes (vitamina E e seus análogos, catalase, GSH, superóxido dismutase, cisteína) vêm sendo testados como adjuvantes incluídos nos diluentes usados para congelamento de sêmen ovino (SICHERLE et al., 2011; MAIA et al., 2010; BUCAK et al., 2008). Entretanto, os resultados obtidos ainda não permitiram um incremento significativo na viabilidade espermática pós-congelamento, o que pode ter ocorrido em função da rota de atuação destes antioxidantes, que não proporcionou a adequada produção de antioxidantes intracelulares. Para otimizar os efeito antioxidantes, sugere-se a disponibilização de precursores de glutationa (GSH), que é o principal antioxidante intracelular (LUBERDA, 2005). Agentes derivados tióis como o β-mercaptoetanol (BME) atuam na cascata de GSH

18 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 mediante disponibilização de cisteína. Porém, como a cisteína disponibilizada no meio é facilmente oxidada a cistina, não pode ser utilizada pela célula. A reação entre BME e cistina produz uma mistura dissulfídica que é rapidamente reduzida e liberada no meio, livre para reagir com outra cistina novamente. Com esta ação cíclica do BME, as células são capazes de utilizar a cistina constantemente (ISHII et al., 1981). Além disso, o BME também é um importante estimulador da síntese de RNA e de proteínas mitocondriais, que são essenciais para a produção de enzimas requeridas para prover energia para motilidade dos espermatozoides (SALEM et al., 1988). No entanto, não existem relatos do uso dos antioxidantes BME e da cisteína no processo de congelamento de sêmen ovino. A raça Crioula Lanada é nativa da região Sul e é oriunda de uma série de cruzamentos entre ovinos trazidos pelos colonizadores portugueses e espanhóis para o Brasil (VAZ, 1993). Desta combinação, resultaram uma grande variabilidade genética (ARAUJO et al., 2009) e uma elevada rusticidade (BRICARELLO et al., 2004). Atualmente seu rebanho encontra-se reduzido, o que justifica a busca pela preservação desta raça, visando a preservação de seus genes que podem ser de inestimável importância para a manutenção da variabilidade genética da espécie ovina. Este trabalho teve como objetivo determinar o efeito antioxidante do BME, incluído isoladamente ou em associação com a cisteína no diluente de congelamento de sêmen ovino, sobre a viabilidade pós-descongelamento de sêmen de ovinos da raça Crioula Lanada. 92 93 94 95 2. Materiais e métodos O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal do Departamento de Patologia da Faculdade de Veterinária UFPel e no Laboratório de

19 96 97 98 Reprodução Animal da EMBRAPA Clima Temperado, situados no município do Capão do Leão, Rio Grande do Sul. Os testes bioquímicos foram realizados no Laboratório de Zoofisiologia da Universidade Federal de Rio Grande (FURG). 99 100 101 102 103 104 2.1 Processamento do sêmen e avaliações Quatro carneiros da raça Crioula Lanada, com idade entre 4 e 5 anos, foram utilizados como doadores de sêmen, sendo realizadas 23 coletas. Os carneiros foram mantidos nas instalações da EMBRAPA Clima Temperado, sob as mesmas condições de manejo e alimentação. 105 106 107 108 109 110 111 112 113 Todos os indicadores de qualidade espermática foram avaliados antes e após o descongelamento. Porém, a motilidade espermática continuou sendo avaliada a cada 30 minutos, durante duas horas após o descongelamento do sêmen. Após as avaliações précongelamento, somente os ejaculados que apresentaram motilidade espermática maior ou igual a 70% e vigor espermática maior ou igual 3, foram utilizados no experimento (CBRA, 1998). A motilidade e o vigor foram avaliados com visualização em microscopia óptica em aumento de 200x, com uma alíquota de 5μl em uma lâmina coberta por lamínula, ambas previamente aquecidas a 37 C (BEARDEN & FUQUAY, 1997; CBRA, 1998). 114 115 116 117 118 119 A análise da morfologia espermática foi realizada em microscopia óptica de contraste de fase, sob lente de imersão com aumento de 1000x. Para a avaliação da concentração espermática, o sêmen foi diluído em solução de formol salina na proporção de 1:400 e avaliado em câmera de Neubauer sob microscopia óptica comum, em aumento de 200x. Após a avaliação da concentração dos ejaculados, as amostras de sêmen dos quatro carneiros foram combinadas (pool), de modo que cada um

20 120 121 122 123 contribuísse com a mesma concentração de espermatozoides viáveis (250 x 10 6 espermatozoides), totalizando 1 x 10 9 espermatozoides no pool e 100 x 10 6 espermatozoides na palheta de 0,25 ml. O diluente base utilizado para o congelamento do sêmen foi tris-gema-glicerol (EVANS & MAXWELL, 1987). 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 As amostras foram divididas em seis tratamentos: T1, Controle, sem antioxidantes; T2, com 2mM BME; T3, com 5mM BME; T4, com 2mM BME e 5mM CIS; T5, com 5mM BME e 5mM de CIS; e T6, com 5mM de CIS. A curva de resfriamento/congelamento foi realizada em equipamento de congelamento automático (TK3000, Uberaba, MG), em programa específico para ovinos (P3S1), em que a redução da temperatura na rampa positiva se dava a 0,25 C/minuto até chegar a 5 C, permanecendo nesta temperatura durante 1 hora. Logo em seguida iniciava-se a rampa negativa, em caixa de isopor contendo 7 cm de nitrogênio liquido, com redução de 20 C/minuto até a temperatura de -120 C, a seguir as palhetas eram imersas em nitrogênio líquido (-196 C). Já o descongelamento foi realizado em banho-maria a 37 C por 20 segundos. 135 136 137 138 139 140 141 142 143 A integridade da membrana plasmática foi avaliada através de coloração fluorescente utilizando-se a combinação dos corantes diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) (20 µm) (C4916, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) e Iodeto de Propídio (IP) (73 µm) (P4170, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) (HARRISON & VICKERS, 1990), em microscópio de epifluorescência, com o filtro de excitação 450-490 nm, em aumento de 400x, sendo avaliadas 200 células por lâmina. Os espermatozoides corados em verde eram considerados íntegros (membrana plasmática íntegra) e os corados de vermelho ou de verde e vermelho simultaneamente, eram classificados como não íntegros (membrana plasmática lesada).

21 144 145 146 147 148 149 150 151 Para a avaliação da integridade do acrossoma os espermatozoides foram corados com FITC-PNA (L7381, Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MI, EUA), utilizando a técnica adaptada de Tabuchi et al. (2008). Foram contadas 200 células por lâmina, avaliadas em aumento de 1000x, em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP. Brasil), em filtro WU com excitações de 450-490nm e emissão de 520nm. Os acrossomas foram considerados íntegros quando apresentaram conformação normal e coloração verde e, quando apresentaram coloração vermelha e conformação anormal, foram considerados lesados. 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 A avaliação da atividade mitocondrial foi realizada através de técnica descrita por Evenson et al. (1982), utilizando os corantes Rodamina 123 (0,2 mm) (R8004, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) e Iodeto de Propídio (IP) (73 µm) (P4170, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Foram contadas 200 células por lâmina, avaliadas em aumento de 400x em microscópio de epifluorescência (Olympus BX 51, América INC, São Paulo, SP. Brasil), em filtro WU com excitações de 450-490 nm e emissão de 516-617nm. As células que apresentavam a peça intermediária com uma intensa fluorescência verde foram consideradas com mitocôndrias íntegras (funcionalmente ativas), enquanto as células sem intensa fluorescência verde na peça intermediária foram consideradas não funcionais. 162 2.2 Análises bioquímicas 163 164 165 166 2.2.1 Espécies reativas de oxigênio (ROS) A mensuração das ROS foi feita através de um teste de cinética realizado em fluorímetro (Victor 2, Perkin Elmer ), a partir de protocolo modificado de MYHRE & FONNUM (2001). Após o descongelamento do sêmen em banho-maria a 37 C durante

22 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 30 s, o mesmo foi depositado em microtubos de 1,5 ml onde foi centrifugado por duas vezes a 800 G por 10 min com descarte do sobrenadante e ressuspensão do pellet com 1 ml de PBS livre de cálcio e magnésio. Foram retirados 400 μl do volume e congelado para posterior análise da capacidade antioxidante total (TOSC). Foram então adicionados 600 μl do preparo da sonda fluorescente 2 7 Diacetato de Diclorofluoresceina H2DCF-DA (40μM em PBS) (35845, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) para ressuspensão do pellet, homogeneizado por 5 segundos em vórtex, permanecendo em incubação com a sonda por 30 min a 36 C. Logo foi realizada a última centrifugação e lavagem com 600μl de PBS para retirada do excesso da sonda H2DCF-DA e posterior leitura no fluorímetro. Foram colocadas 160μl das amostras, em triplicatas, em placas brancas de 96 poços (Corning 3912). A leitura foi realizada em 12 ciclos com intervalo de 4 min e agitação de 2 s antes e depois de cada ciclo em uma temperatura de 36 C. 180 181 A geração de ROS foi determinada através da integração da área da curva de fluorescência pelo tempo, sendo os resultados expressos por UFx10 7. 182 183 184 185 186 187 188 189 190 2.2.2 Capacidade antioxidante total (ACAP) A capacidade antioxidante total foi mensurada contra os radicais peróxidos, gerados pela decomposição térmica a 36 C, de 2,2 azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloreto (ABAP), segundo AMADO et al. (2009). Para a realização do protocolo, uma alíquota de 500 μl do sêmen descongelado foi armazenada a -18ºC por no máximo 15 dias para posterior análise. No momento da análise, a alíquota foi descongelada a temperatura ambiente e sonicada por 5 segundos e, em seguida, centrifugada a 800 G por 10min, sendo o pellet desprezado. Em uma placa de 96 poços (Corning 3912) foi adicionado 125 μl de tampão de reação (PBS), sendo acrescido uma alíquota de 10 μl

23 191 192 193 194 195 196 de cada amostra em 4 poços. Em dois poços foram acrescentados 7,5 μl de água Milli- Q e nos outros dois, 7,5 μl de solução de ABAP (20 μm), sendo as amostras feitas em duplicatas. Em seguida foram adicionados 10 μl de solução da sonda H2DCF-DA (16 μm) em todos os poços para leitura em fluorímetro durante 30min com intervalo de 5min, em temperatura controlada de 36ºC, usando comprimentos de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 529 nm. 197 198 199 O resultado final, ou seja, a capacidade antioxidante contra os radicais peróxidos foi obtida pela diferença entre a área ROS com e sem ABAP relacionado à área ROS sem ABAP. 200 201 3.2.3 Análise estatística 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 As respostas avaliadas antes e após congelamento foram as seguintes: motilidade espermática; integridade da membrana espermática e do acrossoma, e atividade mitocondrial dos espermatozoides. Também foram analisados os resultados dos testes de espécies reativas de oxigênio (ROS) e capacidade antioxidante total (ACAP) pósdescongelamento. As respostas, integridade de membrana e acrossoma antes do congelamento, foram comparadas entre os tratamentos por análise de variância, com comparação de médias pelo teste de Tukey. Nos demais casos, nos quais as respostas não apresentaram normalidade, segundo o teste de Shapiro-Wilk, foi utilizado um teste não paramétrico (análise de variância de Kruskal-Wallis). As análises estatísticas foram realizadas pelo uso do programa Statistix (2008). 212 213 4 Resultados

24 214 215 216 217 218 219 220 Na Tabela 1 são mostrados os resultados das avaliações de qualidade seminal antes e depois do descongelamento, respectivamente. Nenhuma das respostas diferiu entre os tratamentos (P > 0,05). A avaliação da motilidade espermática em dois períodos após o descongelamento (Tabela 2) indicou que os tratamentos não afetaram a sobrevivência das células durante este período (P > 0,05). As análises bioquímicas de ROS e TOSC, não apresentaram diferença entre os tratamentos (P>0,05) (Tabela 3). 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 5 Discussão O presente trabalho é o primeiro que utiliza a associação entre os antioxidantes tióis, BME e cisteína, no congelamento de sêmen ovino. Esta informação agrega conhecimento sobre a eficiência do processo de congelamento do sêmen ovino, no qual a maior produção de ROS ocorre durante o resfriamento e o descongelamento. Por ocasião deste estresse oxidativo, há um aumento da peroxidação lipídica na membrana do espermatozoide (CHATTERJEE & GAGNON, 2001). As células espermáticas de mamíferos contém uma alta proporção de ácidos graxos poli-insaturados, sendo mais susceptíveis a peroxidação lipídica. Além do mais, como a composição lipídica da membrana espermática é um dos principais determinantes da viabilidade celular (BUCAK et al., 2008), tais danos estruturais diminuem a motilidade espermática. Por isso, tem se estudado a adição de substancias antioxidantes no meio de congelamento e descongelamento, a fim de controlar a geração de ROS para diminuir a lipoperoxidação, melhorando os resultados pós-descongelamento. No presente estudo, assumiu-se que a concentração de 5 mm de cisteína (BUCAK et al., 2008) seria a mais indicada para sêmen ovino, tendo sido associada ao BME, em duas concentrações diferentes, 2 mm e 5 mm, no congelamento do sêmen. Tais

25 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 concentrações de BME foram determinadas em pré-experimentos, nos quais foi utilizada a concentração de 7,5 mm, sem que tenham sido observadas diferenças na motilidade espermática pós-descongelamento. Porém, essa concentração provocou redução na integridade de membrana (dados não publicados), indicando que esta poderia interferir nas proteínas de membrana e assim diminuir a viabilidade espermática. Ainda que diversos autores tenham comprovado a ação positiva da cisteína, utilizada isoladamente, como antioxidante no sêmen de ovinos (BUCAK et al., 2008), bovinos (SARIOZKAN et al., 2009; BILODEAU et al., 2001) e suínos (FUNAHASHI & SANO, 2005; YAMAGUCHI et al., 2012), o presente experimento não comprovou este efeito aditivo. A associação de antioxidantes tióis, tais como, BME e cisteína vêm sendo estudada em células (ISHII, et al 1981) e embriões (BAI et al, 2008; HOSSEINI et al, 2011), em várias espécies animais. O interesse por estes compostos se justifica por efeitos positivos gerados pela disponibilização destes precursores na formação de um dos principais antioxidantes intracelulares, a glutationa (GSH) (LUBERDA, 2005; BUCAK et al., 2007). Porém, nossos resultados não comprovaram efeitos positivos para o congelamento do sêmen ovino. Agentes tióis (BME e N-acetilcisteína) em concentração acima de 0,5 mm permitem a manutenção da motilidade espermática por até 6 h pós-descongelamento para sêmen bovino (BILODEAU et al.,2001). Portanto, o efeito antioxidante do BME foi tão eficiente quanto o efeito de outros produtos como a cisteína e n-acetilcisteína, sendo associado com a manutenção da motilidade espermática mesmo em presença de estresse oxidativo (H 2 O 2 ). Estes achados corroboram os resultados do presente experimento, pois o tratamento contendo somente cisteína não diferiu dos tratamentos contendo BME, em nenhum dos parâmetros testados. No entanto, ainda que o contato dos antioxidantes com as células tenha ocorrido durante um período mais longo, as concentrações testadas não

26 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 foram deletérias para as células espermáticas, mas não proporcionaram manutenção da motilidade após o descongelamento. Ainda que durante o resfriamento do sêmen ocorra a produção de radicais livres, aumentando o estresse oxidativo (CHATERJEE & GAGNON, 2001), a adição dos antioxidantes durante esse período não foi benéfica. A adição de BME ao sêmen, associado ou não a outra substância antioxidante, foi estudada em bovinos (BILODEAU et al., 2001; TALEVI et al., 2007), ovinos (SALEM et al., 1988) e suínos (YAMAGUCHI et al., 2012), porém com adição pós-descongelamento, o que aumentaria o número de células funcionais e inibiria a capacitação espontânea (YAMAGUCHI et al., 2012). Porém, como os antioxidantes foram adicionados antes do resfriamento, o longo período de contato com as células (durante o resfriamento, o congelamento e armazenamento) talvez explique a ausência de efeito benéfico do antioxidante, o qual pode ter sido totalmente consumido durante este período. Outro fator que pode ter influído nos resultados do presente experimento é a composição do diluente utilizado para congelamento (tris + gema de ovo), a qual, por si só, poderia apresentar potencial efeito antioxidante, pois estes componentes são capazes de reduzir peróxido de hidrogênio, radicais superóxido e óxido nítrico no sêmen de bovinos (CHATTERJEE et al., 2001). Porém, mesmo com uma composição similar do diluente de congelamento, o presente estudo não diferenciou e os tratamentos contendo BME e CIS, isoladamente ou associados, nos testes de ROS e ACAP. 284 285 6 Conclusão 286 287 288 A inclusão dos antioxidantes BME e cisteína, nas concentrações utilizadas, no diluente de congelamento para ovinos, isoladamente ou em associação, não promoveram

27 289 290 benefícios para a qualidade seminal pós-descongelamento, não sendo capazes de reduzir os radicais livres nem aumentar a capacidade antioxidante total. 291 292 293 294 295 296 297 298 5541. Aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Pelotas, sob o número 299 300 301 302 303 Agradecimentos: EMBRAPA Clima Temperado (Pelotas-RS). EMBRAPA Pecuária Sul (Bagé-RS). 304

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35 454 455 Tabela 1: Taxas de motilidade, integridade da membrana (MEMB) e do acrossoma (ACR) e atividade mitocondrial (MIT) de sêmen ovino pré e pós-descongelamento por tratamento* Pré congelamento Pós descongelamento Variáveis Motilidade MEMB ACR MIT Motilidade MEMB ACR MIT Controle 80,4 ± 0,4 74,9 ± 2,1 52,4 ± 3,2 74,9 ± 1,8 31.3 ± 1.6 42.3 ± 3.7 40,9 ± 1,9 64,5± 3.0 2mM BME 80,0 ± 0,6 74,2 ± 2,3 52,4 ± 3,8 79,7 ± 2,5 25.6 ± 1.4 40.4 ± 3.8 35,9 ± 2,8 58,0± 2,9 5mM BME 78,6 ± 0,9 73,4 ± 2,5 58,2 ± 4,3 78,7 ± 2,3 25.9 ± 1.4 42.1 ± 4.8 38,8 ± 2,2 61,9± 2,8 2mM BME + 5 mm Cisteína 80,4 ± 0,4 71,7 ± 2,3 47,6 ± 3,9 76,5 ± 2,4 24.5 ± 1.6 45.1 ± 3.5 40,8 ± 3,3 55,3± 3,6 5mM BME + 5 mm Cisteína 80,4 ± 0,4 76,0 ± 1,6 51,7 ± 3,4 79,8 ± 2,8 26.0 ± 1.6 42.7 ± 2.9 45,6 ± 2,0 56,6± 3,8 5 mm Cisteína 80,4 ± 0,4 74,0 ± 2,2 47,5 ± 3,7 77,5 ± 2,7 23.9 ± 1.6 38.9 ± 4.0 44,1 ± 1,7 62,0± 3,4 456 457 458 459 BME: β-mercaptoetanol *Médias ± EPM não diferiram (P > 0,05) pela análise de variância, com comparação de médias pelo teste de Tukey para os parâmetros de integridade de membrana e acrossoma antes do congelamento, para os demais parâmetros foi utilizado método não paramétrico de analise de variância por Kruskal-Wallis. 460

36 461 462 Tabela 2: Motilidade espermática de sêmen ovino em dois períodos pós- descongelamento por tratamento Variáveis Motilidade pós-descongelamento (%) Após 1 h Após 2 h Controle 28,2 ± 1,6 19,5 ± 1,3 2 mm BME 28,2 ± 1,6 19,7 ± 1,5 5 mm BME 24.5 ± 1,5 19.3 ± 1,5 2 mm BME + 5 mm Cisteína 24.5 ± 1,5 18.6 ± 1,0 5 mm BME + 5 mm Cisteína 23.4 ± 1,7 18.6 ± 1,3 5mM Cisteína 21.3 ± 1,7 14.7 ± 1,5 463 464 BME: β-mercaptoetanol *Médias ± EPM não diferiram (P > 0,05) 465

37 466 467 Tabela 3: Produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e capacidade antioxidante total (ACAP) de sêmen ovino pós-descongelamento por tratamento Variáveis ROS (Área de fluorescência x 10 7 ) ACAP (1/Área relativa) Controle 1,3 ± 0,1 (1,1) 82,2 ± 7,7 (71,7) 2 mm BME 1,1 ± 0,1 (1,1) 96,2 ± 10,5 (88,4) 5 mm BME 1,1 ± 0,1 (0,9) 113,9 ± 35,5 (71,2) 2 mm BME + 5 mm Cisteína 1,1 ± 0,5 (1,0) 75,3 ± 7,6 (71,7) 5 mm BME + 5 mm Cisteína 1,0 ± 0,1 (0,9) 108,6 ± 14,3 (96,1) 5mM Cisteína 1,2 ± 0,1 (1,1) 82,2 ± 5,7 (75,0) 468 469 BME: β-mercaptoetanol *Médias ± EPM não diferiram (P > 0,05). Valores entre parênteses são as medianas