AVALIAÇÃO DE SÊMEN CONGELADO DE SUÍNOS ATRAVÉS DO TESTE DE PENETRAÇÃO ESPERMÁTICA IN VITRO

Transcrição

1 AVALIAÇÃO DE SÊMEN CONGELADO DE SUÍNOS ATRAVÉS DO TESTE DE PENETRAÇÃO ESPERMÁTICA IN VITRO Autor(es): Apresentador: Orientador: Revisor 1: Revisor 2: Instituição: RAMBO, Gissele; BIANCHI, Ivan; LEON, Priscila Marques Moura de; SANTOS, Elisa Caroline da Silva; CORCINI, Carine Dahl; VARELA Jr., Antonio Sergio; Lucia, Thomaz, Jr.; DESCHAMPS, João Carlos Gissele Rambo João Carlos Deschamps Maria Gabriela T. Rheingantz Marta Gonçalves Amaral Universidade Federal de Pelotas AVALIAÇÃO DE SÊMEN CONGELADO DE SUÍNOS ATRAVÉS DO TESTE DE PENETRAÇÃO ESPERMÁTICA IN VITRO RAMBO, Gissele 1,5 ; BIANCHI, Ivan 5 ; LEON, Priscila Marques Moura de 1 ; SANTOS, Elisa Caroline da Silva 2 ; CORCINI, Carine Dahl 1,5 ; VARELA Jr., Antonio Sergio 3 ; Lucia, Thomaz, Jr. 4,5 ; DESCHAMPS, João Carlos 4,5. 1 Mestrando Pós Graduação Veterinária FACULDADE DE VETERINÁRIA/UFPel 2 Mestrando Pós Graduação Biotecnologia Agrícola UFPel 3 Depto. de Ciências Morfobiológicas FURG 4 Depto. Patologia Animal FACULDADE DE VETERINÁRIA/UFPel 5 PIGPEL: Ensino, Pesquisa e Serviços em Produção de Suíno FACULDADE DE VETERINÁRIA/UFPel Centro de Biotecnologia UFPEL, Campus Universitário s/n, CEP , Pelotas, RS. gisselevet@hotmail.com 1. INTRODUÇÃO Métodos clássicos de avaliação da qualidade do sêmen de suínos, tais como concentração espermática, motilidade progressiva, percentagem de células viáveis e morfologia do acrossoma, apresentam baixa associação com a fertilidade, pois somente amostras de sêmen com qualidade inferior são detectadas (Gadea, 2005). Novos métodos, como a fertilização in vitro, têm sido utilizados para estimar a fertilidade in vivo (Sellés et al., 2003), e também para avaliar os efeitos dos processos de criopreservação, sobre determinadas funções espermáticas (Sellés et al., 2003; Peláez et al, 2006). Segundo Macedo et al. (2006) o teste de penetração in vitro em oócitos homólogos vitrificados, pode ser utilizado como um método de avaliação da capacidade de fertilização dos espermatozóides, submetidos ao processo de criopreservação. Porém, o mesmo autor sugere que devido às dificuldades e custos

2 para realização de testes de fertilidade in vivo, é fundamental aprimorar e simplificar as avaliações através de métodos in vitro. Esses testes podem então ser utilizados para estimar o potencial da fertilidade in vivo do sêmen congelado, visando avaliar novos diluentes, crioprotetores e processos de criopreservação de sêmen suíno. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência do processo de congelamento de sêmen suíno com dois crioprotetores intracelulares (glicerol e dimetilacetamida), comparando os métodos convencionais (motilidade e vigor) com o teste de penetração em oócitos vitrificados, utilizando duas concentrações espermáticas e dois métodos de incubação. 2. MATERIAL E MÉTODOS O sêmen foi coletado de dois suínos cruzados (Landrace x Large White), com motilidade > 70% onde somente a porção do ejaculado com maior concentração espermática foi utilizada (Peña et al., 2006). O ejaculado foi submetido ao processo de criopreservação utilizando dois crioprotetores intracelulares Glicerol (GLI) e a N,N-Dimetilacetamida (DMA) com pesos moleculares de 92,09 e 87,12, respectivamente, (2 machos x 2 tratamentos) em palhetas de 0,5 ml. O processo de criopreservação foi baseado em protocolo convencional (Westendorf et al., 1975; Bordignon et al., 1996), modificado por Bianchi et al. (2005a, 2005b). O descongelamento foi feito a 37 C por 20 s, e o conteúdo da palheta ressuspenso em tubo cônico contendo 10 ml de BTS a 37 C (1:20, v/v) (Peña et al., 2003; Bianchi et al., 2005a). Aos 10 minutos de incubação foi iniciado o processamento do sêmen, quando a motilidade (0 a 100%) e o vigor (escala de 0 a 5) (Corrêa et al., 2001) foram avaliados através da microscopia convencional, e o sêmen foi centrifugado por 3 minutos a 2000 rotações por minuto (RPM). Em seguida o pellet foi ressuspenso em 5mL de BTS a 37 C, a centrifugação foi repetida (modificado de Gil et al., 2004), o pellet formado foi então ressuspenso em meio de préincubação composto de TCM 199 (com sais de Earle e HEPES) e ph 7,8, onde foi incubado por 15 minutos em banho-maria a 39º C (adaptado de Macedo et al., 2006). Para a realização do TPIV foi executada a metodologia descrita por Macedo (2007). Os criotubos contendo os oócitos, meio de fertilização e óleo mineral permaneceram em nitrogênio líquido até a realização do TPIV quando foram descongelados a 60 C por 150 segundos, e em seguida seu conteúdo foi alocado em frasco de vidro com 32 mm de diâmetro. As co-incubações (CI) foram realizadas em frascos de vidro com 32 mm de diâmetro Para a co-incubação na estufa (ES), os frascos permaneceram abertos, para co-incubação em banho-maria (BM), os frascos receberam uma mistura gasosa composta por 5% de dióxido de carbono, 5% de oxigênio e 90 % de nitrogênio, e foram tampados com tampa de borracha, sendo incubados parcialmente imersos em BM, com no mínimo 2 horas de antecedência da inseminação e durante as 18 horas de incubação CI tanto para BM como para ES. Na gota de fecundação contendo os oócitos, foi adicionada a dose inseminante na concentração 2000:1 espermatozóides:oócito (1X) ou de 4000:1 espermatozóides:oócito (2X) permanecendo co-incubados durante 18 horas. Após este período, os oócitos foram recuperados, lavados, submetidos ao corante Hoescht (10µg/mL) e avaliados em microscópio de fluorescência sob 400x de aumento. O número de oócitos que tiveram espermatozóides em seu interior foi contado. Os resultados do TPIV in vitro foram submetidos ao teste de Qui-quadrado do programa Statistix 8.0.

3 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da avaliação in vitro do sêmen após o descongelamento, o número oócitos submetidos ao teste de penetração, os tratamento de congelamento, e os sistemas de incubação estão descritos. O sêmen do macho 9 congelado com DMA, apresentou taxa de penetração de 24% na co-incubação BM e concentração espermática de 1X, 45% na co-incubação BM e concentração espermática de 2X, e 30% na co-incubação ES e concentração espermática de 1X. Não foi observada diferença estatística (P>0,05) entre as diferentes concentrações e os diferentes sistemas de co-incubação. O sêmen do macho 9, congelado com GLI apresentou taxa de penetração de 25% na co-incubação BM e concentração espermática de 1X, 70,6% na coincubação BM e concentração espermática de 2X, e 38,5% na co-incubação ES e concentração espermática de 1X. Foi observada diferença estatística entre as concentrações 1X e 2X para a co-incubação BM, sendo que não houve diferença estatística da co-incubação BM 2X e ES 2X. O sêmen do macho 4 congelado com DMA, apresentou taxa de penetração de 16% na co-incubação BM e concentração espermática de 1X, 21% na co-incubação BM e concentração espermática de 2X, e 30% na co-incubação ES e concentração espermática de 1X. Não foi observada diferença estatística entre as diferentes concentrações e os diferentes sistemas de co-incubação. O sêmen do macho 4 congelado com GLI, apresentou taxa de penetração de 50% na co-incubação BM e concentração espermática de 1X, 57,1% na coincubação BM e concentração espermática de 2X, e 18,1% na co-incubação ES e concentração espermática de 1X. Não foi observada diferença estatística entre as diferentes concentrações e os diferentes sistemas de co-incubação. Quando os dados foram agrupados por tratamento de congelamento, ou seja, agrupando os resultados dos dois machos, o tratamento GLI se mostrou estatisticamente superior ao tratamento DMA. Usando sêmen resfriado de suínos, Macedo et al,(2006), verificaram que o teste de penetração in vitro foi o único método de avaliação do sêmen que identificou a redução da qualidade do sêmen durante o período de armazenamento de 72 horas. Xu et al,(1998), usando técnicas in vitro para verificar qualidade do sêmen e a fertilidade de diferentes machos, demonstrou que o uso da fertilização in vitro pode ser um efetivo indicador de qualidade do sêmen a ser utilizado em Inseminação Artificial. Os autores verificaram a taxa de penetração em oócitos maturos de suínos, sendo possível, através da observação dessa variável, identificar o macho de maior fertilidade e o de menor fertilidade, porém os resultados pareceram ser afetados pela concentração de sêmen utilizada. Em nosso trabalho não houve efeito da concentração e nem do sistema de co-incubação, quando comparados no mesmo tratamento de congelamento para o mesmo macho. Macedo (2007) demonstrou ser possível avaliar sêmen resfriado através da utilização de oócitos vitrificados de suínos no TPIV, em sistema de co-incubação que dispensa o uso da estufa de CO 2. Em nosso trabalho, foi possível verificar que o tratamento GLI alcançou melhores resultados de taxa de penetração no TPIV. Até o momento, nenhum trabalho relatou a utilização do TPIV com oócitos vitrificados para a verificação da qualidade de sêmen congelado de suínos, mesmo que variáveis como taxa de penetração e taxa de polispermia sejam observadas por autores que utilizam a produção in vitro de embriões para tal avaliação.

4 4. CONCLUSÕES O teste de penetração in vitro (TPIV) com oócitos vitrificados, em ambos os sistemas de co-incubação utilizados, foi eficaz para a avaliação da eficiência do processo de congelamento de sêmen suíno com dois crioprotetores intracelulares (glicerol e dimetilacetamida). É possível substituir o uso do sistema de co-incubação em estufa, pela coincubação em banho-maria, usando a concentração de 4000:1 espermatozóides:oócito (2X), o que simplifica a realização do TPIV, avaliando sêmen suíno submetido ao congelamento. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIANCHI, I., CORRÊA, M. N., LUCIA, T. JR., CORRÊA, E. K., PIASSI, L. M., CALDERAM, K., ULGUIM, R. R., MADEIRA, E. M., DESCHAMPS, J. C. Efeito de diferentes crioprotetores no descongelamento de sêmen suíno. In: XII Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em Suínos, Fortaleza. Fortaleza. Associação Brasileira dos Veterinários Especialistas em Suínos, v. 2. p ,2005a. BIANCHI, I., CORRÊA, M. N., PIASSI, L. M., LUCIA, T. JR., CORRÊA, E. K., MADEIRA, E. M., PERONDI, A., CORCINI, C. D., COREZZOLLA, J. L., DESCHAMPS, J. C. Efeito de diferentes métodos de congelamento sobre a motilidade de sêmen suíno. In: XII Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em Suínos Fortaleza. Fortaleza : Associação Brasileira dos Veterinários Especialistas em Suínos, v. 2. p , 2005b. BORDIGNON, V., DESCHAMPS, J.C., SECHIN, A., PALUDO, G., VIVIAN, J.C., NICOLA, E., BOZZATO, J.S., GONSALES, J. A., PIMENTEL, C.A. Efeito da trealose sobre a motilidade, acrossomo e fertilidade do sêmen de suínos. Rev. Bras. Reprod. Anim. 20, n. 2, 54-62, CORRÊA, M.N., MEINCKE, W., LUCIA, T.JR., DESCHAMPS, J.C. Inseminação artificial em suínos. Printpar. Pelotas, RS, 181pp., GADEA, J. Sperm factors related to in vitro and in vivo porcine fertility. Theriogenology. 63: , GIL, M.A., RUIZ, M., VAZQUEZ, J.M., ROCA, J., DAY, B. N., MARTINEZ, E.A. Effect of short periods of sperm oocyte coincubation during in vitro fertilization on embryo development in pigs, Theriogenology, 62: , MACEDO, M.C. Teste de penetração espermática em oócitos in vitro e fertilidade in vivo após inseminação heterospérmica em suínos. Pelotas, f. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, MACEDO, M.C., DESCHAMPS, J.C., LUCIA, T. JR., BORDIGNON, J., SERRET, C.G., RAMBO, G., PIVATO, I., SCHIMITT, E. In vitro penetration of fresh and vitrified swine oocytes by homologous spermatozoa using different incubation systems. Anim. Reprod. Sci. 92: , PELÁEZ, J., BREININGER, E., ALEGRA, B., PENA, F.J., DOMINGUEZ, J.C. In vitro evaluation of the quality and fertilizing capacity of boar semen frozen in 0,25 ml strauss. Reprod. Dom. Anim. 41: , PEÑA, F.J., JOHANNISSON, A., WALLGREN, M., RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H. Assessment of fresh and frozen-thawed boar semen using an Annexin-V assay: a

5 new method of evaluating sperm membrane integrity. Theriogenology, 60: , PEÑA, F.J., SARAVIA, F., NÚÑEZ-MARTINEZ,I., JOHANNISSON, A., WALLGREN, M., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. Do different portions of the boar ejaculate vary in their ability to sustain cryopreservation? Anim. Reprod. Sci. Articles In Press, SELLÉS, E., GADEA, J., ROMAR, R., MATÁS, C., RUÍZ, S. Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reprod. Dom. Anim. 38:66-72, Statistix Statistix 8 Analytical software. Tallahassee, FL. XU, X., POMMIER., S., ARBOV, T., HUTCHINGS,B., SOTTO, W., FOXCROFT,G.R., In vitro maturation and fertilization techniques for assessment of semen quality and boar fertility, J.Anim.Sci. 76: , WESTENDORF, P., RICHTER, L., TREU, H. ZUR Tiefgefrierung von Ebersperma: Labor-und besamungsergebnisse mit dem hülsenberger pailletten-verfähren, Dtsch. Tierarztl. Wschr. 82: ,1975.