Edital lfsc-07/2013 Concurso Público Especialista em Laboratório RESPOSTAS DA PROVA DISSERTATIVA Questão 1 a) O photobleaching é a destruição do fotossensibilizador para terapia fotodinâmica por processos foto-induzidos. Esses processos são variados, sendo o principal a oxidação na presença de agentes reativos produzidos. A luz excita o fotossensibilizador que transfere energia e resulta na produção de espécies reativas. Essas espécies reativas promovem modificações na molécula do fotossensibilizador, resultando na sua destruição. Após essa modificação, o fotossensibilizador para de interagir com a luz, interrompendo a foto-reação. b) Sim, o photobleaching deve depender da quantidade de oxigênio molecular livre presente na vizinhança. Para a maioria dos fotossensibilizadores atuais, o principal mecanismo fotdinâmico ocorre com a formação de oxigênio ou espécies reativas de oxigênio, assim, o photobleaching é do tipo oxidativo. Assim, uma maior quantidade de oxigênio molecular livre na vizinhança, considerando os outros parâmetros fixos da terapia fotodinâmica, resultará em um maior photobleaching. Questão 2 a) Para excitação na região de 400 nm, os principais absorvedores biológicos são hemoglobina e melanina e os principais fluoróforos, triptofano,m colágeno, elastina, nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH), flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e porfirinas. b) A profundidade de análise é bastante pequena, sendo variável dependendo das propriedades ópticas do tecido investigado, especialmente considerando os coeficientes de absorção e espalhamento nessa região de excitação e de emissão de fluorescência. Os fenômenos de absorção e espalhamento da luz na região de 400 nm são bastante relevantes nos tecidos biológicos e contribuem para o espectro final da fluorescência coletado (formato e intensidade). Nesse sentido, um tecido que apresente uma maior concentração de absorvedores e/ou com maior coeficiente de espalhamento, a profundidade de análise será comparativamente menor a de um outro tecido com esses parâmetros. Na maioria dos tecidos biológicos, a profundidade de análise será inferior a 1 mm de espessura. Questão 3 A terapia fotodinâmica de dois fótons ocorre quando a molécula do fotossensibilizador absorve 2 fótons, geralmente com comprimento de onda na região do infravermelho, indo para um nível eletrônico capaz de transferir energia ao oxigênio. A iluminação do tumor na região do infravermelho resulta em uma maior penetração no tecido biológico. No entanto, existem grandes limitantes da técnica: pequena sessão de choque de absorção de 2 fótons dos fotossensibilizadores atuais, necessidade de excitação com altas intensidades,
volume de tratamento bastante reduzido e indução de outros efeitos não-lineares e lineares com grande liberação de calor e danos indesejáveis. Questão 4 A lei de Planck explica o espectro da radiação emitida por um corpo aquecido a uma certa temperatura T. A sua coincidência com dados experimentais é muito boa e para que ela explique o espectro, é necessário considerar um modelo no qual, para cada componente espectral, a energia é representada por pacotes mínimos de energia de valor ħ. Esses pacotes de energia fornecem à radiação uma característica corpuscular, onde cada um recebe o nome de fóton e corresponde ao chamado quantum de luz. A essência da lei de Planck é portanto a existência do quantum de luz. Questão 5 Ao incidirmos radiação sobre a matéria temos dois fenômenos que ocorrem: espalhamento ressonante e não-ressonante. O espalhamento ressonante corresponde à troca de energia entre a radiação e os graus de liberdade internos dos átomos e moléculas. Na região de micro-ondas, a principal excitação são os estados rotacionais das moléculas. No infravermelho, temos os estados vibracionais, já começando com algumas excitações dos estados eletrônicos, que são intensificadas na região do visível e do ultravioleta. Nestas excitações, a distribuição eletrônica é modificada. Ainda no UV, a chamada foto=ionização com remoção de carga pode ocorrer. Após o UV vem o raio-x, que essencialmente promove ionização da matéria, podendo interagir com estruturas nucleares ressonantes. Quando a radiação está com energia longe dos estados descritos acima, ocorre o chamado espalhamento não-ressonante sendo os principais, o espalhamento Rayleigh e o Thompson. Questão 6 = á = 40 4 (W/cm2 ) para r em metros Quando =0,2 / = 0,2 10 (W/m 2 ) 0,2 10 4 = r 2 = 3/0,2 10-4 15 10-4 m
r 4 cm Neste ponto, =!" =4 10 # $ /% & =3,0 10 ( /) * " =2! " =0,2 10.2.3,010( ).4 10 # $ /%, -. =/,0 /- 1 /,. /- 2 34=/. 3/54 Questão 7) A óptica de um microscópio confocal e de absorção por 2 fótons utilizam praticamente a mesma óptica de um microscópio de varredura convencional, mas diferem no aspecto da introdução de uma fenda (pinhole) para o microscópio confocal (fenda bloqueia a luz fora do plano focal), enquanto para o microscópio por 2 fótons a excitação é limitada ao plano focal definido pelo fato de que a probabilidade de excitação do cromóforo é proporcional ao quadrado da intensidade do laser (um alto fluxo de fótons se faz necessário, o que pode ser fornecido por um laser pulsado em femtosegundos). Microscopia Vantagens Desvantagens Confocal Melhor resolução (fator 2 1/2 ) - Excitação no visível e UV => baixa penetração no tecido; - Amostras finas (menor penetração); 2 fótons - Baixo Espalhamento (menos espalhamento Rayleigh); - Maior penetração (uso de laser no IR); - Fotodegradação mínima fora do plano focal; - Mais baixa resolução; - Alto custo (laser 2P); - Altas intensidades promovem fotodegradação no plano focal (menor absorção maior potência no foco)
Questão 8: a) E T =?? do gráfico de decaimento da emissão, dois pontos (t 1 ;I 1 ) e (t 2 ;I 2 ) são escolhidos de forma que k o = ln I t ln I t 2 1 2 1 Para os pontos (0;0,5) e (7,8;0,01), temos que k o =0,5x10 9 s -1 ; Para os pontos (0;2) e (1,6;0,01), temos que k o =3,3x10 9 s -1 ; Portanto, 3,3 E T = = 87% 3,3 + 0,5 b) ( R ) 6 o R =k T /k o =6,6 c) N fret /N o = I fret /I o = I 1 /I 2 do gráfico I 1 =2 e I 2 =0,5, logo N fret /N o =4; d) Valores típicos Coeficiente de extinção (cm -1 M -1 ) > 10 5 ; - Eficiência quântica > 80 %; - Deslocamento Stokes entre fluorescência e absorção (nm) > 40 nm (largura média dos picos de emissão e emissão da ordem de 20 nm); - Eficiência quântica de fotodegradação < 0,0001%; -Faixa espectral de emissão (nm): 400 nm < λ< 700 nm (Visível); Questão 9: a) 1) Fabricante Zeiss; 2) Fluar = lentes de fluorita que transmite luz no visível e UV.
3) 100x = ampliação nominal da lente; 4) 1.30 = Abertura numérica (NA); determina a resolução e quantidade de luz recolhida; 5) Oil = meio de imersão a ser utilizado; 6) = objetiva corrigida para o infinito; 7) 0,17 = espessura da lamínula especificada para 170 µm; b) Para microscópio confocal a resolução lateral da objetiva pode ser dada por 0,4λ R NA Para comprimento de onda no meio do visível (550 nm), R 169 nm Questão 10: a) Tempo por pixel= 3ms/512=5,85 µs; b) Número de pulsos do laser por pixel=5,85 µs/25 ns=234; c) A taxa de contagem de fótons por segundo 4 counts/750 ns=5,3x10 6 counts/s d) Número de fótons coletados por pixel=(224 repetiçõesx4 fótons)/30 repetições=31 fótons; e) Todos os fótons coletados no intervalo de tempo 3617,55 µs<t<3623,40 µs pertencem ao pixel 3 da segunda linha;