Meta-ômicas em Ecologia Microbiana

Aula 07-08-2017 Bioinformática aplicada ao estudo de comunidades microbianas Meta-ômicas em Ecologia Microbiana Acacio Aparecido Navarrete 1

Conteúdo - Abordagens Ômicas - Genômica - Transcriptômica - Proteômica - Metabolômica - Conceitos em Ecologia - Níveis de organização da vida - Microbioma - Diversidade - Interações microbianas - Links entre taxonomia e função - Estudos de caso - Diversidade microbiana: abordagens metagenômica e metatranscriptômica - Interações no microbioma do solo na Amazônia: uma abordagem metagenômica - Links entre metabólitos e espécies bacterianas em biofilme oral: uma abordagem multi-analítica - Considerações finais e direções futuras - Integração de dados meta-ômicos em estudos de microbiomas 2

Etimologicamente, ômica significa o estudo global de algo. Bioquímica pósgenômica G E N O M A Transcrição T R A N S C R I T O M A Tradução P R O T E O M A Atividade proteômica B I O Q U Í M I C A D A C É L U L A G E N Ô M I C A Estudo de todos os genes T R A N S C R I T Ô M I C A Estudo de todos os transcritos (DNA/RNA) P R O T E Ô M I C A Estudo de todas as proteínas M E T A B O L Ô M I C A Estudo do perfil 3 metabólico

As ômicas correspondem à análise global dos sistemas biológicos. Ok. Mas se as ômicas abrangem diferentes sistemas biológicos, por que falar de ômicas e Ecologia Microbiana? Apesar da simplicidade biológica, quando comparados com outros sistemas, os sistemas microbiológicos são um domínio de investigação difícil, mas com grande potencial para aplicações fundamentais e industriais. Mas como essa história começou de fato? 4

Microbiologia Ecologia Biologia Molecular 1663 R. Hooke Microscópio 1674 A. van Leeuvenhoek Bactérias, protozoários desenvolvimento do conceito de cadeia alimentar Séc. XVIII A química moderna de Lavoisier 1880 R. Koch Cultivo microrganismos meio sólido 1832 a 1844 - C. Darwin teoria da evolução/seleção natural 1887 S. Winogradsky Metabolismo de populações microbianas 1887 M. Beijerinck Vírus, fixação biol. N e bac. redutoras de sulfato 1890 V.Hensen plâncton e produtividade nos oceanos 1931 R. Hungate Cultivo de bactérias anaeróbias 1953 Watson & Crick Modelo dupla hélice DNA 1965 R. MacArthur métodos estatísticos 1986 Primeiro Sequenciador automático 1977 Primeiro método sequenciamento DNA 1990 C. Woese Filogenia Molecular Três Domínios da Vida 1990 Projeto Genoma Humano 1997 Projeto Genoma FAPESP 2006 Lançamento Illumina 2004 Lançamento Roche 454 2007 Lançamento Life 5

Biologia Molecular dos anos 50 até hoje A dupla hélice do DNA Enzimas de restrição DNA polimerase, DNA ligase Manipulação de moléculas Eletroforese Sequenciamento de DNA Marcadores moleculares Mapas genéticos - RFLP Hibridizações in situ Marcadores radioativos, fosforescentes e fluorescentes PCR Síntese artificial de RNA e DNA Seq. Genomas Reparo de DNA Tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração Bioinformática 50 60 70 80 90 2000 6

Descoberta da célula Robert Hooke - 1663 Descoberta do DNA Watson & Crick - 1953 Ômicas dias atuais Primeira descrição dos microorganismos Antonie van Leeuwenhoek - 1674 7

A C T G A T T T T T T T T T A A A A A A A A A A G G G G G G G G G G G C C C C C C C C C C C G A T G BRCA actin Wnt ras 8

Níveis de organização em Ecologia PAISAGEM ECOSSISTEMA COMUNIDADE POPULAÇÃO ORGANISMO ÓRGÃO TECIDO CÉLULA Adaptado de Barret & Odum, 2005. Fundamentals of Ecology 9

Um nicho ecológico Comunidade Populações 10

Comunidade DNA 11

DNA Comunidade 12

Genômica Transcriptômica Microbioma Proteômica Metabolômica Microbioma: 1. comunidade residente de micro-organismos num ecossistema (Dicionário infopédia da Língua Portuguesa) 2. comunidade microbiana que ocupa um habitat bem definido. O termo não se refere apenas aos micro-organismos envolvidos, mas abrange também as atividades por eles desempenhadas (Burge, 1988). 13

O caminho prático das abordagens ômicas Dados de outras plataformas Resultados de outras análises Hipótese Ecológica / Questão DNA/RNA quality Experimento Diferentes tecnologias Data Análise e armazenamento dos dados Visualização/ Interpretação Validação dos resultados 14

DNA Comunidade 15

DNA Comunidade DIVERSIDADE BIOLÓGICA 16

A diversidade é uma medida da incerteza e depende: - do número de espécies (riqueza de espécies); - de como os indivíduos se distribuem em uma comunidade (equitatividade). N o. de espécies observado N o. de quadrados amostrados A comunidade A tem mais espécies que a comunidade B e, portanto, tem maior riqueza de espécies. 17

A diversidade é uma medida da incerteza e depende: - do número de espécies (riqueza de espécies); - de como os indivíduos se distribuem em uma comunidade (equitatividade). Abundância relativa Maior equitatividade Menor equitatividade Espécies 18

Uma única estimativa da diversidade não é informativa. As medidas de diversidade são fundamentalmente uma disciplina comparativa. Fonte: Magurran, A.E., Measuring Biological Diversity, 2004. 19

Riqueza, diversidade e equitatividade de bactérias em solos da Amazônia Estimativa de riqueza (S.chao1), medidas de heterogeneidade (Shannon, Simpson e Brillouin), número efetivo de espécies, diversidade filogenética de Faith e medida de equitatividade (Sheldon) em sítios de floresta e sítios desmatados de três áreas descontínuas na Amazônia brasileira. Medidas de diversidade Sítio de floresta Área 1 Área 2 Área 3 Estatística Sítio Sítio de Sítio Sítio de Sítio SF vs. SD desmatado floresta desmatado floresta desmatado S.chao1 4,003 (1) a (2) ± 732 (3) 3,395a ± 641 4,031a ± 828 4,465a ± 400 3,532a ± 110 3,891a ± 247 ns (4) Shannon (5) 5.64a ± 0.11 5.83a ± 0.20 5.73a ± 0.03 6.15a ± 0.30 5.42b ± 0.10 6.12a ± 0.10 ** Simpson (6) 0.98a ± 0.001 0.99a ± 0.002 0.98a ± 0.001 0.99a ± 0.003 0.98a ± 0.001 0.99a ± 0.001 *** Brillouin 5.41a ± 0.09 5.59a ± 0.18 5.48a ± 0.05 5.86a ± 0.27 5.20a ± 0.09 5.85b ± 0.09 *** Effective number of species (7) 281.46b ± 1.11 340.35a ± 1.22 307.96b ± 1.03 468.71a ± 1.34 225.87b ± 1.10 454.86a ± 1.10 *** Faith s phylogenetic diversity 8.66a ± 1.69 9.45a ±0.59 8.05a ±0.53 9.15a ± 0.67 8.65a ± 0.03 8.70a ± 0.93 * Sheldon (8) 0.17a ± 0.003 0.21a ± 0.026 0.19a ± 0.026 0.24a ± 0.042 0.15b ± 0.010 0.26a ± 0.015 *** Schao1 (riqueza) Sítios de floresta = Sítios desmatados Sheldon (equitatividade) Sítios de florestas Sítios desmatados Shannon (diversidade) Sítios de floresta Sítios desmatados Fonte: Navarrete et al. Molecular Ecology, 24: 2433 2448, 2015. 20

Riqueza, diversidade e equitatividade de genes funcionais microbianos Assis (Zinc concentration) Serra Azul (Zinc concentration) 0 kg ha -1 5 kg ha -1 10 kg ha -1 20 kg ha -1 0 kg ha -1 5 kg ha -1 10 kg ha -1 20 kg ha -1 Richness estimates Gene sequences detected 12628 ab ± 169 12480 ab ± 100 12249 a ± 611 13366 b ± 721 13653 a ± 280 14024 a ± 157 13105 a ± 139 13393 a ± 275 Gene sequences belonging to gene families correlated with zinc concentration 2632 a ± 40 2577 a ± 10 2547 a ± 131 2783 a ± 159 3007 ab ± 131 3266 b ± 105 2768 a ± 58 2874 ab ± 87 Gene families detected 501 a ± 3 499 a ± 1 500 a ± 8 511 a ± 9 513 a ± 3 519 a ± 3 506 a ± 3 509 a ± 5 Gene families correlated with zinc concentration 70 a ± 7 69 a ± 3 64 a ± 6 77 a ± 6 69 a ± 4 79 a ± 12 67 a ± 9 67 a ± 5 Shannon index Gene families detected 4.81 a ± 0.005 4.80 a ± 0.003 4.80 a ± 0.01 4.81 a ± 0.01 4.82 a ± 0.002 4.83 a ± 0.002 4.81 a ± 0.003 4.82 a ± 0.005 Gene families correlated with zinc concentration 2.97 a ± 0.005 2.98 a ± 0 2.97 a ± 0.01 2.99 a ± 0.01 2.99 a ± 0.01 2.99 a ± 0.005 2.98 a ± 0.01 2.98 a ± 0.005 Inverse Simpson index Gene families detected 41.99 a ± 0.42 41.61 a ± 0.30 41.49 a ± 0.74 42.0 a ± 0.90 43.29 a ± 0.20 43.56 a ± 0.19 42.34 a ± 0.31 43.04 a ± 0.26 Gene families correlated with zinc concentration 12.76 a ± 0.12 12.76 a ± 0.01 12.59 a ± 0.31 13.14 a ± 0.24 13.09 a ± 0.12 13.29 a ± 0.03 12.86 a ± 0.11 13.17 a ± 0.22 Sheldon index Gene families detected 0.77 a ± 0.0002 0.77 a ± 0.0004 0.77 a ± 0.0005 0.77 a ± 0.0003 0.77 a ± 0.0004 0.77 a ± 0.0003 0.77 a ± 0.0003 0.77 a ± 0.0004 Gene families correlated with zinc concentration 0.76 a ± 0.0017 0.76 a ± 0.0016 0.76 a ± 0.0046 0.76 a ± 0.0023 0.76 a ± 0.0018 0.76 a ± 0.0003 0.76 a ± 0.0021 0.76 a ± 0.0016 Não houve diferença estatística significativa. Fonte: Navarrete et al. Agriculture, Ecosystems & Environment, 236: 187 197, 2017. 21

DNA/RNA Comunidade 23

DNA/RNA Comunidade INTERAÇÕES MICROBIANAS 24

Interações bacterianas em um biofilme dental As bactérias colonizadoras primárias aderem a receptores salivares e mais tarde recrutam colonizadores mediante interações específicas. A troca metabólica ocorre em duas direções entre Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola. Ácido láctico produzido por estreptococos como Strep. Gordonii promove o crescimento de Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Veillonella sp. Ao mesmo tempo, o H 2 O 2 de estreptococos desencadeia a produção da enzima de degradação da matriz, a dispersina B. 25 Fonte: Sfam, 2014.

O solo como micro-habitat microbiano 26

O desmatamento na Amazônia altera redes de associação entre bactérias e fatores químicos do solo!! Forest!sites!! Deforested!sites! Networks!! Edges!! Edges! Nodes! Nodes!!! Conexões Total! Positive! positivas Negative! em! solos Total! de Positive! Negative! OTUs!(16S!rDNA!amplicons) (1)!! 489! 1,351!!!909! 442!! 652! 1,537! 988! 549! Matéria floresta (67.28%)! (32.72%)! (64.28%)! (35.72%)! WGS!ensemble (2)!! 273! 1,123! 960!! 163!! 343! 1,216!! 970! 246! (85.48%)! (14.52%)! (79.80%)! (20.20%)! orgânica WGS!MetaPhlAn (3)!! 20! 18!! 15! 3!! 49! 135!! 120! 15! Conexões (83.33%)! negativas 16.67%)! em solos (88.89%)! (11.11%)! 27! Fonte: Navarrete et al. Molecular Ecology, 24: 2433 2448, 2015. desmatados

O desmatamento na Amazônia altera redes de associação entre bactérias e fatores químicos do solo Neste caso as sequências do metagenoma do solo foram anotadas utilizando o banco de dados SEED com o sistema MG- RAST. Fonte: Navarrete et al. Molecular Ecology, 24: 2433 2448, 2015. 28

O desmatamento na Amazônia altera redes de associação entre bactérias e fatores químicos do solo Neste caso as sequências do metagenoma do solo foram anotadas utilizando MetaPhlAn. Fonte: Navarrete et al. Molecular Ecology, 24: 2433 2448, 2015. 29

Espécies microbianas RNA Sequenciamento RNA Anotação de proteínas 32

Espécies microbianas RNA LINKS ENTRE TAXONOMIA E FUNÇÃO Sequenciamento RNA Anotação de proteínas 33

A placa dental é uma das mais bem descritas comunidades microbianas Fonte: McLean et al. (2012) 34

Abordagem multi-analítica: NMR-SIP Combinação de sondas de isótopos estáveis baseadas em ácido nucleico (SIP) com Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS) não-invasiva in situ para associar as medidas de produção de ácido orgânico em tempo real e as espécies 35 bacterianas específicas ativas em biofilmes orais. (McLean, 2014)

Abordagem metagenômica Resposta do microbioma do solo aos efeitos de curto prazo do desmatamento na Amazônia Solos florestais Solos de áreas desmatadas Fonte: Navarrete et al. Molecular Ecology, 24: 2433 2448, 2015. 36

Fonte: Aguiar-Pulido et al. (2016) 37

Em síntese - As abordagens ômicas permitem avaliar a riqueza, equitatividade e diversidade taxonômica e funcional de comunidades microbianas, incluindo informação de membros ainda não cultivados; - Graças à bioinformática, os dados ômicos têm permitido inferir sobre relações teóricas entre micro-organismos e destes com o ambiente, abrindo caminho para validações em ensaios biológicos; - Analisar redes heterogêneas construídas em vários conjuntos de dados ômicos é fundamental para ligar os diferentes níveis de complexidade inerentes aos sistemas biológicos, estabelecendo assim uma compreensão mais abrangente da natureza e dinâmica dos microbiomas. 40

Aula 07-08-2017 Bioinformática aplicada ao estudo de comunidades microbianas Muito obrigado pela atenção acacionavarrete@gmail.com 41