Ciência Veterinária nos Trópicos, Recife-PE, v. 17, n. 1/2 p. 48-53 - janeiro/agosto, 2014 Uso de glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes botusêmen e ACP-105 na integridade de espermatozoides equinos refrigerados Victor Netto MAIA¹, Felipe Costa ALMEIDA², Sildivane Valcácia SILVA³, Gustavo Ferrer CARNEIRO 4, Pierre Castro SOARES 4, Karen Mascaro Gonçalves da SILVA 5, Maria Madalena Pessoa GUERRA 4 * RESUMO 1 UNINASSAU Docente do Curso de Medicina Veterinária; 2 Médico Veterinário; 3 UFPB Docente do Curso de Biotecnologia; 4 UFRPE Docente do Curso de Medicina Veterinária; 5 Médica Veterinária. *Autor para correspondência: mpguerra@dmv.ufrpe.br Visando estudar o efeito da adição de glutationa peroxidase (GPx) e cisteína (Cis) aos diluentes Botu-Sêmen e ACP-105 na viabilidade de espermatozoides equinos, amostras de sêmen foram refrigeradas (14 ºC) e analisadas quanto à motilidade total (MT), vigor, integridade de membrana (im) e de acrossoma (iac), e potencial da membrana mitocondrial (PMM), após 0 (T0), 12 (T12) e 24 (T24) horas de refrigeração. A análise da MT evidenciou no T12 que as amostras de sêmen dos grupos Botu-sêmen (G1) e Botu-sêmen +GPx+Cist (G7) apresentaram maiores (P<0,05) percentuais do que no grupo ACP-105 +Cist (G6). No T24, as amostras do G7 apresentaram maior (P<0,05) MT do que as diluídas em ACP-105 (G2) e ACP-105 +- Cist (G6). O vigor espermático no T12 foi maior (P<0,05) no G7 do que no G2 e G6. No T24, o vigor das amostras do G4 e G7 foi maior (P<0,05) do que nas do G2 e G6. A im e o PMM não diferiram (P>0,05) entre grupos, com exceção do PMM que no T0 foi maior (P<0,05) no G1 do que no G7 e no G8. A iac no T24 foi maior (P<0,05) no G6 do que no G1. Conclui-se que a associação de GPx (5 U) e Cist (5 mm) preserva espermatozoides equinos diluídos em Botu-sêmen refrigerados (14 oc) durante 24 horas. PALAVRAS-CHAVE ACP-105, Botu-sêmen, antioxidantes, refrigeração. Use of glutathione peroxidase and cysteine in Botu-Sêmen and ACP-105 diluents on integrity of chilled equine spermatozoa ABSTRACT Aiming to study the effect of glutathione peroxidase (GPx) and cysteine (Cis) addition in Botu-Sêmen and ACP-105 diluents on integrity of equine spermatozoa, semen samples were cooling (14 C) and analyzed for total motility (TM), vigor, membrane integrity (im) and acrosome (iac), and mitochondrial membrane potential (MMP), after 0 (T0), 12 (T12) and 24 (T24) hours of cooling. Analysis of TM in T12 demonstrated that semen samples diluted in Botu-sêmen (G1) and Botu-sêmen +GPx+ Cis (G7) had higher (P<0.05) percentage than those diluted in ACP-105 + Cis (G6). At T24, samples diluted in G7 had higher MT (P<0.05) than those in G2 and G6. Sperm vigor in T12 was higher (P<0.05) in samples diluted at G7 than in G2 and G6. At T24, the vigor of samples diluted G4 and G7 was higher (P<0.05) than in G2 and G6. No significant difference were observed to im and MMP among groups, except to MMP at T0 was higher (P<0.05) in G1 than G7 and G8. At T24 the iac parameter was higher (P<0.05) in the G6 than in G1. It can be concluded that GPx (5U) and Cis (5mM) in association preserves equine spermatozoa diluted in Botu-sêmen at 14 C during 24 hours. KEYWORDS ACP-105, Botu-sêmen, antioxidants, cryopreservation time. 48
Uso de glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes botu-sêmen e ACP-105 na integridade de espermatozoides equinos refrigerados INTRODUÇÃO O sêmen de garanhões pode tolerar variação de temperatura durante o armazenamento in vitro. Entretanto, temperaturas próximas a 0 ºC são prejudiciais à viabilidade dos espermatozoides desta espécie, quando o tempo de estocagem é prolongado. Assim, o uso de containers para transporte de sêmen pode ser utilizado por 22 horas, desde que a temperatura interna do dispositivo não seja reduzida a menos de 4 ºC (Vidament et al., 2012). Diluentes à base de leite desnatado-glicose são eficazes em preservar a motilidade progressiva (MP) e o vigor espermático durante 24 horas a 6-8 C, resultando em boa capacidade de fertilização (Pugliesi et al., 2012), porém, hoje se busca por produtos que não sejam de origem animal e a água de coco tem se mostrado uma boa alternativa (Sobreira Neto, 2008). Na apresentação em pó, a água de coco (ACP-105 ) proporciona as mesmas vantagens dos diluentes comerciais de origem animal (Silva et al., 2006). Manipulação de sêmen equino durante o processo de resfriamento reduz a viabilidade espermática e fertilidade em consequência, dentre outros, da peroxidação dos lipídeos da membrana, devido ao alto teor de ácidos graxos poliinsaturados, que torna estas células altamente suscetíveis aos radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS) (Cocchia et al. 2011). Estudos têm adicionado substâncias antioxidantes aos diluentes de criopreservação do sêmen, visando preservar a viabilidade dos espermatozoides por mais tempo (Guerra et al., 2012). A enzima glutationa peroxidase (GPx) converte o H 2 O 2 em água pela oxidação da glutationa, protegendo os espermatozoides contra os efeitos das ROS (Maia et al., 2010). Cisteína, um antioxidante não enzimático, impede a peroxidação lipídica, tem a capacidade de penetrar nas membranas celulares (Bilodeau at al., 2001) além de preservam alguns parâmetros cinéticos (Barros et al, 2013). Objetivou-se estudar o efeito da adição da glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes Botu-sêmen e ACP-105 na viabilidade de sêmen refrigerado de equinos. MATERIAL E MÉTODO Com exceção daqueles especificados no texto, os reagentes utilizados no experimento foram obtidos da Sigma Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Quatro Mangalarga Marchador, entre quatro e oito anos, clinicamente sadios, foram submetidos ao mesmo manejo nutricional e sanitário. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética para Experimentação e Uso de Animais da Universidade Federal Rural de Pernambuco (CEUA/DMV 080/2008). Os garanhões foram submetidos a colheitas de sêmen (n=3) com vagina artificial (modelo colorado; 42 ºC), a intervalos de 24 horas, totalizando 12 amostras, sendo utilizada égua em estro. Após colheita, procedeu-se a avaliação macroscópica (coloração, aspecto e volume) e microscópica (MT e vigor espermático) (Mies Filho, 1987). Duas alíquotas (5 ml) de cada ejaculado foram diluídas (10 ml) em Botu-sêmen (Biotech Botucatu, Botucatu-SP, Brasil) ou ACP-105 (ACP Biotecnologia, Fortaleza - CE, Brasil). A seguir, cada amostra de diluente + sêmen foi dividida para formar os grupos experimentais, de acordo com a adição de glutationa peroxidase (GPx; 5 U/mL de diluente) ou cisteína (Cist; 5 mm): G1= Botu-sêmen ; G2= ACP-105 ; G3= Botu-sêmen +GPx; G4= ACP-105 +GPx; G5= Botu-sêmen +Cist; G6= ACP-105 +Cist; G7= Botu-sêmen +- GPx+Cist e G8= ACP-105 + GPx+Cist. Amostras de cada grupo foram colocadas em tubos de microcentrífuga (1 ml), acondicionados em duas caixas de refrigeração de sêmen (Botu-Box, Biotech Botucatu, Botucatu-SP, Brasil). Para controle da temperatura, um termômetro digital foi colocado em cada caixa. As amostras de sêmen foram submetidas à avaliação de MT, vigor, im e iac, e PMM, no tempo 0 ( ), 12 ( ) e 24 horas ( ) de refrigeração a 14 o C. Nas análises com as sondas fluorescentes, um total de 200 células foi avaliado em microscópio de epifluorescência (Carl Zeiss, Göttingen, Germany) para cada teste e grupo. A análise da im foi realizada e classificada pelo método de coloração dupla de acordo com Harrison e Vickers (1990). Para análise da iac, utilizou-se IP e Isotiocíanato de Fluoresceína conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA; Barros et al., 2013). Os espermatozoides foram classificados como portadores de iac, quando corados em verde fluorescente na região acrossomal, e reagidos, quando corados em verde fluorescente na região equatorial ou não apresentaram fluorescência verde. O PMM foi avaliado e classificado através do fluorocromo catiônico lipofílico JC-1, segundo Guthrie e Welch (2006). Os dados foram submetidos à análise de variância (Teste F) que separou como causa de variação o efeito de grupos e tempos de análise do sêmen. Nos casos de significância no teste F, as médias dos tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan. Para avaliação de cada grupo em função do tempo, utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey. Os dados foram analisados no programa Statistical Analysis System (SAS, 2000), usando-se o procedimento GLM (General Linear Model) do SAS. Para todas as análises estatísticas foi adotado P<0,05. O modelo utilizado foi: Y ij = G + T + GT + E ij, onde: Y ij = valor observado; G = efeito dos grupos; T = efeito dos tempos; GT = Interação entre grupo x tempos; E ij = erro. Realizou-se, também, análise de correlação de Pearson para pares de variáveis do sêmen (Little e Hills, 1978). RESULTADOS Os ejaculados apresentaram, em média, volume de 40,4 ml, cor branca opalescente, aspecto leitoso a aquoso, motilidade de 72,92% e vigor de 3,5. Na Tabela 1 o PMM, em cada tempo, diferiu entre os grupos no h, com maior porcentual (P<0,05) de gametas com apmm para o G1, em comparação ao G7 e G8. O G3 apresentou menor porcentual (P<0,05) no em relação ao. O G1, G2, G5 e G6 apresentaram menores porcentuais (P<0,05) no em relação ao. No a MT do G1 e G7 apresentaram maiores (P<0,05) percentuais do que G6. Com exceção do G6, todas as amostras Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p. 48-53 - janeiro/agosto, 2014 49
Victor Netto MAIA et al. diluídas em Botu-sêmen preservaram mais a MT com valores acima de 30%, em comparação aos grupos em que se utilizou o ACP-105, no e no. No amostras do G4 também preservaram a MT com valores acima de 30%. O G2, G3, G5, G6 e G8 apresentaram redução (P<0,05) da MT no, em relação a, enquanto que as amostras do G1 apresentaram redução (P<0,05) apenas no. No o G7 apresentou maior valor (P<0,05) do que aquelas do G1 e G6. No, o G4 e G7 apresentaram maiores valores (P<0,05) do que aqueles observados no G2 e G6. As amostras G2, G4 e G6 apresentaram menores (P<0,05) valores no do que no. No T, valores de vigor 12 acima de 3,0 foram observados no G1, G3, G4 e G7, enquanto que no apenas as do G3, G4 e G7 (Tabela 2). Não houve redução do percentual de gametas com im. No o G6 apresentou maior (P<0,05) porcentual com iac do que do G1. G1 e G7 apresentaram redução dos porcentuais (P<0,05) de gametas com iac no, em relação ao (tabela 3). Alta correlação (p<0,05) foi constatada da MT com vigor (r= 0,83022; p<0.0001) e apmm (r= 0,70658; p<0,0001), assim como do vigor com o apmm (r= 0,70357; p<0,0001). Observou-se moderada correlação da MT com a im (r= 0,39448; p<0,0001); do vigor com a im (r= 0,39356; p<0,0001); do apmm com a im (r= 0,47289; p<0,0001) e a iac (r= 0,34340; p<0,0001). Observou-se, ainda, que a iac apresentou baixa correlação com MT (r= 0,15830; p<0,0743), vigor (r= 0,16194; p<0,0678) e im (r= 0,13976; p<0,1156). DISCUSSÃO A média dos resultados obtidos na avaliação do sêmen no foram considerados satisfatórios no que diz respeito aos parâmetros de MT, im e PMM, visto que neste momento a célula ainda não sofreu estresse oxidativo, uma vez ser indispensável um período de tempo para que os espermatozoides produzam ROS e determinem estresse oxidativo (Soares e Guerra, 2009). O diluente ACP-105 tem sido utilizado na criopreservação de sêmen de equinos, com resultados superiores aos de diluentes à base de leite (Raphael, 2007 e Sobreira Neto, 2008). Todavia, resultados insatisfatórios foram observados por Maia et al. (2010) ao utilizarem a água de coco como diluente de refrigeração a 5 ºC. A refrigeração de amostras de sêmen diluídas em Botu-sêmen e ACP-105 não preservaram a MT dos espermatozoides, embora Vidament et al. (2012) demonstraram tolerância dos espermatozoides equinos à variação de temperatura positiva (5 a 15 ºC) durante o armazenamento por 22 horas ou mais, utilizando INRA 96. Animais podem apresentar sêmen classificado como viável no momento da colheita e após diluição e redução de temperatura, estas amostras podem diminuir a viabilidade. Nesta pesquisa foi observado que o uso do ACP-105 causou redução acentuada da MT no, com exceção do G4, com porcentuais de gametas vivos acima de 30% até, ressaltando o efeito positivo da associação deste diluidor com a GPx, enzima que atua na síntese de proteína, metabolismo e proteção celular (Meister e Anderson, 1983). A água de coco é pobre em fosfolipídeos, assim como o leite desnatado. A proteção conferida pelo leite se baseia nas proteínas e carboidratos presentes em sua composição, sendo a caseína a proteína protetora da célula espermática (Bergeron e Manjunath, 2006). No entanto, os mecanismos de proteção da água de coco na célula espermática ainda não estão bem elucidados. Neste experimento, o uso do ACP-105 não promoveu a manutenção da MT em um período curto de tempo. Pode ser que a membrana plasmática do espermatozoide equino necessite se manter estável durante a redução da temperatura, uma vez que a transição da fase fluída para a fase gel tem início quando a célula espermática atinge a temperatura média de 20,7 ºC (Parks e Lynch, 1992), o que não foi conseguido no G1. Amostras do G4 e G7 evidenciaram o efeito positivo da Tabela 1 - Média ± desvio padrão de espermatozoides equinos diluídos em Botu-Sêmen ou ACP-105, suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteína (5 mm), portadores de alto potencial de membrana mitocondrial durante 24 horas de incubação a 14ºC Grupos Experimentais Botu-Sêmen 79,25±11,51 Aa 64,71±10,65 ab 45,08±26,19 b ACP-105 76,29±11,87 ABa 55,79±20,89 a 45,50±22,74 b Botu-Sêmen +GPx 73,58±11,98 ABa 65,50±15,34 b 57,75±22,14 b ACP-105 +GPx 69,46±19,87 ABa 71,42±7,14 a 58,63±19,97 a Botu-Sêmen +Cist 70,46±13,18 ABa 63,08±15,23 ab 48,25±23,24 b ACP-105 +Cist 71,96±13,85 ABa 53,33±16,41 ab 47,13±18,98 b Botu-Sêmen +GPx+Cist 65,46±10,48 Ba 62,92±8,68 a 56,79±23,68 a ACP-105 +GPx+Cist 63,88±13,74 Ba 59,67±14,02 a 45,96±19,07 a Cist = cisteína; Letras minúsculas distintas na mesma linha indicam P<0,05; letras maiúsculas distintas na mesma coluna indicam P<0,05. 50 Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p. 48-53 - janeiro/agosto, 2014
Uso de glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes botu-sêmen e ACP-105 na integridade de espermatozoides equinos refrigerados Tabela 2 - Média ± desvio padrão da motilidade total (%) e vigor (0-5) de espermatozoides equinos diluídos em Botu-Sêmen ou ACP-105, suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteína (5 mm), durante 24 horas de incubação a 14ºC Grupos Experimentais Motilidade Total (%) Vigor (0-5) Botu-Sêmen 65,00±13,48 a 48,75±15,39 Aab 35,00±21,21 ABb 3,33±0,49 a 3,17±0,39 ABa 2,67±0,98 ABCa ACP-105 47,50±15,74 a 17,08±14,05 ABbc 7,08±9,40 BCc 3,25±0,75 a 2,17±0,83 Bb 1,42±1,00 BCc Botu-Sêmen +GPx 64,58±15,29 a 42,08±26,41 ABbc 33,75±20,90 ABCc 3,50±0,67 a 3,00±1,13 ABa 3,00±1,13 ABa ACP-105 +GPx 54,58±17,12 a 36,00±22,71 ABa 36,25±22,58 ABa 3,50±0,67 a 3,33±0,65 ABb 3,42±0,67 Ab Botu-Sêmen +Cist 56,25±16,67 a 18,33±13,54 ABb 14,17±14,59 ABCb 3,50±0,90 a 2,42±0,90 ABab 2,08±1,16 ABCb ACP-105 +Cist 44,17±17,03 a 8,33±6,51 Bb 4,58±4,98 Cb 3,42±0,79 a 2,25±0,87 Bb 1,58±1,51 BCb Botu-Sêmen +GPx+Cist 57,08±18,64 a 49,58±18,40 Aa 39,58±20,50 Aa 3,67±0,78 a 3,58±0,51 Aa 3,50±0,52 Aa ACP-105 +GPx+Cist 48,75±15,09 a 23,75±10,25 ABb 13,33±12,12 ABCb 3,58±0,67 a 2,92±0,79 ABab 2,25±1,14 ABCb Cist = cisteína; Letras minúsculas distintas na mesma linha indicam P<0,05; letras maiúsculas distintas na mesma coluna indicam P<0,05. Tabela 3 - Média ± desvio padrão de espermatozoides eqüinos diluídos em Botu-Sêmen ou ACP-105, suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteína (5 mm), portadores de membrana plasmática e acrossoma íntegros após 24 horas de incubação a 14ºC Grupos Experimentais Membrana plasmática íntegra (%) Acrossoma íntegro (%) Botu-Sêmen 61,17±14,90 61,29±9,65 60,08±9,39 33,00±19,43 a 20,79±16,23 a 13,83±5,86 Bb ACP-105 64,83±10,04 55,83±18,51 51,79±20,64 38,96±15,80 a 28,38±10,05 ab 31,67±14,61 ABab Botu-Sêmen +GPx 69,25±14,94 62,38±14,81 57,79±15,66 29,58±14,30 a 22,33±12,57 ab 17,63±17,88 ABab ACP-105 +GPx 59,08±11,53 63,08±17,84 62,75±14,47 30,96±19,12 a 25,83±17,38 a 15,67±14,00 ABa Botu-Sêmen +Cist 67,54±15,90 56,00±16,66 44,67±23,20 34,83±15,87 a 30,88±14,07 a 30,17±14,16 ABa ACP-105 +Cist 65,58±12,10 57,25±24,20 48,42±25,23 39,83±20,98 a 38,83±15,83 a 37,75±15,91 Aa Botu-Sêmen +GPx+Cist 66,67±13,86 66,17±16,68 59,50±7,61 36,83±17,41 a 23,58±12,57 a 16,42±15,54 ABb ACP-105 +GPx+Cist 63,75±10,44 56,88±19,15 57,50±19,70 40,33±14,38 a 39,29±20,03 a 33,25±16,83 ABa Cist = cisteína; Letras minúsculas distintas na mesma linha indicam P<0,05; letras maiúsculas distintas na mesma coluna indicam P<0,05 adição de GPx em relação ao vigor no. Provavelmente isto resultou da presença do resíduo de cisteína contendo selênio covalentemente ligado, com ação no transporte de aminoácidos, síntese protéica, redução de cadeias de dissulfito e proteção contra ROS (Bertelsmann et al., 2007). Os porcentuais reduzidos de gametas com iac em todos os grupos no podem ser explicados pelo fato de que em equinos, os padrões de motilidade e vigor espermáticos não são suficientes para classificá-los como bom reprodutor. No entanto, no apenas as amostras do G1, G5, G6 e G8 apresentaram porcentuais de células com iac acima de 30%, mínimo para uso do sêmen na IA. Este resultado possivelmente está relacionado com a técnica de análise, onde o corante se ligaria às lectinas, disponíveis em gema de ovo (Watson, 1995) ou no leite de soja (Bittencourt et al., 2008), não se ligando, prioritariamente, ao acrossoma, por uma questão de biodisponibilidade. Uma hipótese é o fato da água de coco apresentar, em sua composição, o ácido 3-indol-acético (IAA), hormônio que atua no crescimento de vegetais e se liga a proteínas solúveis (Barbier-Brygoo, 1995). Esta associação do IAA às proteínas solúveis pode ter acarretado uma provável alteração do corante utilizado na técnica, já que o mesmo é de origem vegetal. O ajuste da técnica ao diluidor utilizado pode justificar a baixa correlação observada entre os resultados de MT, vigor e im Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p. 48-53 - janeiro/agosto, 2014 51
Victor Netto MAIA et al. com os de iac. Considerações metodológicas são importantes a fim de projetar um protocolo de confiança e reprodutível para o estudo da reação acrossômica. As amostras de sêmen refrigerado apresentaram porcentuais elevados de gametas com apmm até 24 horas, indicando preservação do metabolismo espermático e pouca produção de ROS na peça intermediária durante este período de armazenamento. Podendo ser justificados pelo fato das mitocôndrias serem responsáveis pela produção de energia necessária para a manutenção do movimento (Watson, 1995). Comparando as análises, constatou-se alta correlação da MT com vigor e apmm, assim como do vigor com o apmm. Estes resultados evidenciam que, para esta espécie e nas condições deste experimento, a MT e o vigor foram positivamente influenciados pelo apmm, uma vez que ATPs são requeridos para manter a atividade metabólica da célula espermática (Pozzan e Rudolf, 2009), que no sêmen refrigerado mantém reduzida, porém ativa. Moderada correlação foi observada entre MT e im, vigor e im; apmm e im. Evidenciando que a célula pode apresentar motilidade sem necessariamente apresentar suas estruturas intactas, uma vez que durante os processos de criopreservação existem modificações estruturais nas membranas, ocasionando a criocapacitação, onde se observam células com aumento de motilidade, decorrente de alterações na membrana plasmática, e precoce reação acrossomal (Silva et al., 2009). CONCLUSÕES O diluidor ACP-105 não é uma alternativa eficiente para sêmen equino refrigerado, quando comparado ao Botu-sêmen ; O uso de 5U de GPx, em associação ao Botu-sêmen ou ACP-105 e o uso de 5mM de cisteína, em associação ao Botu-sêmen ou ACP-105 e GPx, preservam a viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados a 14 ºC durante 24 horas. Estudos do uso de diferentes tipos e concentrações de antioxidantes para sêmen nesta espécie são necessários. AGRADECIMENTOS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa; à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARBIER-BRYGOO, H. Tracking auxin receptors using functional approaches. Critical Reviews in Plant Sciences, v. 14, p. 1-25, 1995. BARROS, L.O., SILVA, S.V., ALMEIDA, F.C., SILVA, E.C.B., CARNEI- RO, G.F., GUERRA, M.M.P. Efeito da adição de glutationa peroxidase e cisteína ao diluidor de congelação do sêmen equino. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 65, n. 2, p. 430-438, 2013. BERGERON, A.; MANJUNATH, P. New insights towards understanding the mechanisms of sperm protection by egg yolk and milk. Molecular Reproduction and Development, v. 73, p. 1338-1344, 2006. BERTELSMANN, H.; KUEHBACHER, M.; WESELOH, G., KYRIA- KOPOULOS, A.; BEHNE, D. 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