Perfil Bioquímico em ovelhas da raça Morada Novanos períodos de gestação, parto e pós parto

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1 Ciência Veterinária nos Trópicos, Recife-PE, v. 17, n. 1/2 p janeiro/agosto, 2014 Perfil Bioquímico em ovelhas da raça Morada Novanos períodos de gestação, parto e pós parto Francicleide Maria de Souza Charll dos SANTOS¹, Pierre Castro SOARES², Emanuela Polimeni de MESQUITA³, Emanuel Felipe de OLIVEIRA FILHO³, Sebastião Inocêncio GUIDO 4, Kilder Henrique Guimarães ALVES 5, Cláudio Coutinho BARTOLOMEU², Marleyne José Afonso Accioly Lins AMORIM 6 RESUMO 1 Graduação em Medicina Veterinária/ Iniciação Científica PIBIC/CNPq/ UFRPE; Zootecnista e Mestre em Produção Animal pelo Departamento de Zootecnia da UFRPE 2 Professor Associado Dr do Departamento de Medicina Veterinária da UFRPE. Departamento de Medicina Veterinária. Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE. CEP: pcastro.pe@gmail.com (Autor para correspondência) Avaliaram-se parâmetros bioquímicos relacionados ao perfil energético, proteico, mineral e atividade enzimática do sangue em ovelhas Morada Nova nos períodos de gestação, parto e pós-parto. Foram utilizadas dez ovelhas, adultas, criados em sistema intensivo. As ovelhas foram sincronizadas e cobertas com reprodutor da mesma raça. A partir do 90 dias de gestação, iniciaram-se as coletas de material biológico para análises laboratoriais, e estas foram efetivadas nos tempos: 60, 30, 15, 7 antes do parto, no dia do parto, 7 e 15 dias pós-parto. Amostras de sangue foram coletadas para determinações bioquímicas. Variações significativas foram observadas em todos os constituintes sanguíneos no período de gestação: proteína total (p<0.0001), albumina (p<0.0001), globulina (p<0.0001), ureia (p=0.0049), creatinina (p=0.0005), glicose plasmática (p<0.0001), colesterol (p<0.0001), triglicerídeos (p=0.0011), frutosamina (p<0.0001), Ca (p<0.0001), P (p<0.0001), Ca:P (p=0.0088), Mg (p<0.0004), AST (p=0.0035), GGT (p=0.0197) e FA (p=0.0336). O período gestacional influencia significativamente no perfil bioquímico de ovelhas no período de transição; podendo esses valores ser utilizados como referência para a raça Morada Nova, além de serem utilizadas como ferramentas de diagnóstico de transtornos nutricionais e metabólicos. 3 Pós-graduação em Ciência Veterinária/UFRPE PALAVRAS-CHAVE: alimentação, metabolismo, raça, sangue, bioquímica clínica 4 Pesquisador Dr do Instituto Agronômico de Pesquisa (IPA) 5 Médico Veterinário, Mestre em Ciência Veterinária/UFRPE 6 Profa. Associada Dra. do Departamento de Morfologia e Fisiologia da UFRPE Clinical biochemistry in Morada Nova ewes during pregnancy, partum and postpartum ABSTRACT Biochemical parameters related to energy, protein, mineral profile and enzymatic blood activity in Morada Nova sheep during periods of pregnancy, childbirth and postpartum were evaluated. Ten sheep, adult, raised in intensive system were used. The sheep were synchronized and covered with the same race player. From the 90 days of gestation, began the biological material collected for laboratory testing, and these were held in times: before delivery, the day of delivery, 7 and 15 postpartum days. Blood samples were collected for biochemical determinations. Significant variations were observed in all blood constituent during pregnancy: total protein (p<0.0001), albumin (p<0.0001), globulin (p<0.0001) urea (p=0.0049), creatinine (p=0.0005), plasma glucose (p<0.0001), cholesterol (p<0.0001), triglycerides (p=0.0011), fructosamine (p<0.0001), Ca (p <0.0001) P (p<0.0001) Ca:P (p=0.0088), Mg (p<0.0004), AST (p=0.0035), GGT (p=0.0197) and AF (p=0.0336). The gestational period significantly influences the biochemical profile of sheep in the transition period; these values can be used as reference for the Morada Nova, besides being used as diagnostic nutritional and metabolic disorders tools. KEYWORDS: nutrition, metabolism, race, blood, clinical biochemistry 24

2 Perfil Bioquímico em ovelhas da raça Morada Novanos períodos de gestação, parto e pós parto INTRODUÇÃO A utilização do perfil metabólico em animais de produção atua como um método auxiliar na avaliação de rebanhos com diferentes índices produtivos e reprodutivos, atuando também como uma importante ferramenta no diagnóstico clínico de doenças relacionadas à grande variabilidade da condição de aporte energético, proteico, mineral, vitamínico e de água no organismo animal (PEIXOTO & OSÓRIO, 2007). Para uma adequada interpretação dos valores encontrados no perfil metabólico, deve-se ter um correto conhecimento da fisiologia e bioquímica clínica animal, além de conhecer a fonte e a função de cada um dos metabólitos avaliados (WITTWER et al., 1993). Segundo Araújo (2014), devido aos diferentes achados experimentais na literatura e aos conflitos de opiniões, muitas dúvidas ainda imperam sobre a utilização de ferramentas de diagnóstico, utilizadas em provas laboratoriais no diagnóstico de distúrbios metabólicos. Embora os metabólitos sanguíneos estejam sujeitos ao grande controle homeostático, a partir de alterações metabólicas e endócrinas que ocorrem no organismo animal, é importante identificar uma ou um conjunto de variáveis que possam auxiliar no diagnóstico de carência ou excesso de nutrientes, daí a importância do perfil metabólico (ARAÚJO et al., 2014; 2003, SOARES et al., 2008). Os mecanismos que promovem variabilidade de metabólitos do perfil energético, proteico e mineral em ovelhas gestantes ainda são pouco estudados (THOMAS et al,. 2001). Considerando diferentes fatores de variabilidade, como aspectos regionais, espécie, manejo nutricional e sistema de produção, tem-se tornado relevante o fator racial, tendo a raça Santa Inês muito utilizada em diferentes delineamentos experimentais (SANTOS et al., 2011; ARAÚJO et al., 2014). Soares et al. (2014) recentemente avaliaram alguns constituintes sanguíneos em ovelhas da raça Dorper, encontrando relevantes dados bioquímicos na gestação e pós-parto. Já em relação às ovelhas da raça Morada Nova, é inexistente dados do perfil bioquímico nos períodos de gestação, parto e pós-parto. Ovelhas Morada Nova têm sido amplamente utilizados em sistemas de criação no semiárido nordestino, por apresentarem boa capacidade de adaptação e manejo, sendo animais de alto índice de prenhez e prolificidade. Sendo escasso dados de bioquímica clínica que possam auxiliar o diagnóstico de enfermidades nutricionais e metabólicas nesta espécie, objetivou-se avaliar o perfil de biomarcadores sanguíneos durante os períodos de gestação, parto e pós-parto. MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizadas dez ovelhas da raça Morada Nova, com idade entre um e cinco anos, criados em sistema intensivo e alimentados duas vezes ao dia com 10 kg de palma forrageira, 50 kg de cana-de-açúcar moída, 10 kg de ração peletizada, sal mineral e água a vontade. O sal mineral e a água eram ofertados em cocho e bebedouro específicos, e separados da ração. As ovelhas foram monitoradas quando ao ciclo reprodutivo, verificando-se os critérios de sincronização de estro, quando serão registrados, em protocolos individuais, datas de cio para o efetivo controle do período provável de parto e, por conseguinte, coleta de material biológico. Todos os animais foram previamente vermifugados após análise parasitológica das fezes e avaliada quanto ao escore corporal, que variou de três a quatro. Os animais foram sincronizados utilizando-se o seguinte protocolo: implante vaginal de progesterona (dia zero). No dia sete, se utilizou 1,0 ml de ecg (200 UI/animal) e 0,4 ml de cloprotenol sódico, por via de aplicação intramuscular. No dia nove, retirada do implante de progesterona e, dias 10 e 11, observação de cio e cobertura com reprodutores da mesma raça. A partir dos 20 dias pós-cobertura as cabras foram submetidas à primeira avaliação com ultrassom em tempo real (USTR), Landwind medicalmodelo C4OVET. Foram realizados exames a cada sete dias até os 60 dias de gestação e, o transdutor utilizado foi o linear com frequência de 7,5 MHz e, posteriormente a partir dos 40 dias utilizou-se o transdutor convexo com frequência de 6,0 MHz, para avaliação de vesícula embrionária, frequência cardíaca (FC), observação da diferenciação cabeça/tronco, placentônios, cordão umbilical, observação dos botões dos membros, comprimento crâniocaudal (CCC), diâmetro biparietal (DBP), diâmetro torácico (DT) e diâmetro abdominal (DA). A partir do 90 dias de gestação, iniciaram-se as coletas de material biológico para análises laboratoriais, e estas foram efetivadas em diferentes tempos, constituindo-se, portanto, os seguintes momentos: 60, 30, 15, 7 antes do parto, dia do parto, 7 e 15 dias pós - parto. Amostras de sangue foram coletadas por venopunção jugular, em tubos siliconizados vacutainer, sem e com os seguintes anticoagulantes, fluoreto e ácido dietileno diamino tetracético EDTA, para obtenção de soro e plasma, respectivamente. As amostras de sangue sem anticoagulante serão mantidas à temperatura ambiente, enquanto que as demais com anticoagulante serão homogeneizadas, prontamente refrigeradas e conduzidas ao laboratório para posterior processamento. Todos esses tubos serão submetidos à centrifugação, por período de 15 minutos a 500 G. As alíquotas de soro e plasma serão, posteriormente, condicionadas em tubos tipo ependorf e armazenadas à temperatura de 20o C. Os biomarcadores avaliados foram: glicose, proteína total, albumina, globulina, ureia, creatinina, frutosamina, colesterol, triglicerídeo, aspartato aminotransferase (AST), glutaminotransferase (GGT), fosfatase alcalina (FA), cálcio, fósforo e magnésio. A concentração de globulina foi determinada pela diferença entre as concentrações séricas de proteína total e albumina. A frutosamina foi determinada utilizando-se kit comercial Roche (Fructosamine Plus), medida a 456 nm pela técnica do nitroblue tetrazolium. A concentração sérica de frutosamina foi corrigida tanto pela proteína sérica total quanto pela albumina sérica, utilizando-se, para tal, a fórmula descrita por Coppo et al. (1996). As determinações bioquímicas sanguíneas foram realizadas em analisador bioquímico automatizado LABMAX 240 (LABTEST), utilizando-se kits bioquímicos LABTEST. Os parâmetros foram testados, inicialmente, quanto à Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

3 Francicleide Maria de Souza Charll dos Santos et al. sua distribuição normal, utilizando-se o teste de Kolmogorov- -Smirnov. Todos os dados atenderam às premissas de normalidade sendo, portanto, processados utilizando-se o procedimento GLM do SAS (SAS, 2000), como medidas repetidas no tempo. Para todas as análises estatísticas realizadas, foi adotado o nível de significância (P) de 5%. Na existência de significância no teste F, as médias foram contrastadas pelo Teste de Student-Newman-Keuls. RESULTADOS E DISCUSSÃO Variações significativas foram observadas em todos os constituintes sanguíneos do perfil de metabólitos protéicos e energéticos, nos diferentes períodos de gestação: proteína total (p<0.0001), albumina (p<0.0001), globulina (p<0.0001), ureia (p=0.0049), creatinina (p=0.0005), glicose plasmática (p<0.0001), colesterol (p<0.0001), triglicerídeos (p=0.0011) e frutosamina (p<0.0001) (Tabela 1). As maiores médias da proteína total sérica foram observadas no período final da gestação em relação ao momento do parto, diminuindo durante o parto e até o tempo de 15 dias após-parto. Em relação à globulina foi observado maior média no tempo de 30 dias no momento pré-parto e um comportamento análogo a proteína total no momento do parto e pós-parto. Menor média da variável albumina foi registrada 60 dias anteriores ao parto (29,39 g/l), sendo que essas médias aumentaram até o parto, apresentando diminuição significativa no parto e pós-parto. Quanto a variável ureia foi observado maior média 30 dias anteriores ao parto e uma diminuição gradual ao longo do término do período de gestação e parto, sendo que as médias foram diminuindo nas semanas subsequentes, inclusive registrando as menores médias no período entre 7 e 15 dias após o parto, respectivamente. Como demonstrado na tabela 1, as concentrações sanguíneas de proteína total, albumina, globulina e ureia apresentam-se dentro dos valores considerados normais para a espécie (CONTRERAS & PHIL, 2000). Para Sandabe et al. (2004) o valor de proteína não é alterado em função da gestação e, para Saut et al. (2009) e Yanaka et al. (2012), esse valor não sofre influência do puerpério. Em contrapartida, Mbassa e Poulsen (1991) afirmam que há diminuição na proteína sérica ao final da gestação, provavelmente causada por uma hemodiluição devido a gestação, que se estende até poucos dias após o parto. No caso das proteínas, os dois principais indicadores do Tabela 1 - Valores médios, desvios-padrão e nível de significância (p) de parâmetros bioquímicos do sangue de ovelhas da raça Morada Nova no pré- -parto, parto e pós-parto Parâmetros Proteína Total (g/l) Albumina (g/l) Globulina (g/l) Uréia (mmol/l) Creatinina (µmol/l) Glicose Plasmática (mmol/l) Colesterol (mmol/l) Triglicerídeos (mmol/l) Frutosamina (µmol/l) Letras minúsculas distintas na mesma linha diferem ao nível de 5% de probabilidade. Períodos da Gestação/Dias Pré-Parto Pós-Parto Parto Perfil de Metabólitos Proteicos e Energéticos 77,41 81,99 77,63 79,34 65,72 65,46 68,91 ±5,01 a ±5,06 a ±4,78 a ±5,11 a ±4,63 b ±5,88 b ±8,53 b 29,39 30,60 30,61 32,14 26,69 25,93 26,48 ±1,40 b ±1,14 ab ±1,16 ab ±1,00 a ±2,28 c ±1,58 c ±2,29 c 48,02 51,39 47,02 47,20 39,03 39,54 42,43 ±5,61 ab ±5,30 a ±4,86 ab ±5,57 ab ±4,03 c ±5,67 c ±10,21 c 7,23 8,16 7,85 7,19 7,04 6,77 6,66 ±0,67 ab ±0,78 a ±0,50 ab ±1,11 ab ±1,34 ab ±0,87 b ±1,01 b 94,27 75,78 78,21 94,84 82,10 74,98 77,47 ±17,89 a ±9,98 b ±7,19 b ±11,08 a ±13,58 b ±12,57 b ±11,57 b 4,65 5,15 4,17 3,83 3,97 3,51 6,27 ±0,35 bc ±0,29 b ±0,46 cd ±0,33 cd ±0,45 cd ±0,33 d ±2,22 a 1,49 1,60 1,54 1,59 1,29 1,35 1,14 ±0,23 ab ±0,24 a ±0,18 ab ±0,22 a ±0,21 bc ±0,23 bc ±0,25 c 0,25 0,29 0,34 0,23 0,28 0,26 0,18 ±0,07 abc ±0,08 ab ±0,09 a ±0,06 bc ±0,08 ab ±0,09 abc ±0,05 c 176,29 183,57 176,45 182,45 135,9 128,91 149,33 ±6,03 a ±8,92 a ±8,27 a ±9,63 a ±,33 c1 ±8,03 c ±13,34 b p Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto, 2014

4 Perfil Bioquímico em ovelhas da raça Morada Novanos períodos de gestação, parto e pós parto metabolismo proteico em ruminantes são os níveis séricos de ureia e albumina; a ureia demonstra o estado proteico do animal em curto prazo, enquanto que a albumina o demonstra em longo prazo (PAYNE & PAYNE, 1987). A albumina tem a função de carrear aos ácidos graxos não esterificados, os quais são utilizados pelos tecidos periféricos como fonte de energia (GONZÁLEZ & SILVA, 2003). Assim, como a sua diminuição, haverá menor aporte de energia para os tecidos e conquentemente menor escore corporal. Conforme Wittwer et al. (1993) a ureia é sintetizada no fígado em quantidades proporcionais à concentração de amônia produzida no rúmen e sua concentração está diretamente relacionada com os níveis proteicos da ração e da relação energia/ proteína da dieta. Os valores das concentrações de ureia estão de acordo com os achados de Mbassa e Poulsen (1991) que relataram valores de ureia diminuídos nos primeiros 60 dias de lactação, elevando-se somente após 90 dias do parto. Segundo Piccione et al. (2009), a ureia de ovelhas não se alterou nas primeiras 5 semanas de lactação. Para as globulinas, as quais diminuíram significativamente, não tem sido encontrada na literatura uma explicação plausível para tal perfil. Maiores médias de creatinina foram registradas 60 (94,27 µmol/l) e 7 dias (94,84 µmol/l) anteriores ao parto, porém, estas médias foram inferiores no tempo de 30 até 15 dias correspondentes ao período pré-parto e análogas ao momento do parto e pós-parto. Para a variável glicose plasmática, foi registrado menor média 7 dias (3,51 mmol/l) após o parto,sendo semelhante aos momentos correspondentes ao terço final da gestação; porém, foi observado na semana seguinte maior média de 6,27 mmol/l. Tais resultados discordam com Piccione et al. (2009), trabalhando com ovelhas, afirmaram que houve uma diminuição no teor de creatinina no terço final da gestação com relação ao período seco. Com relação à lactação os autores não observaram alterações. Segundo Mbassa e Poulsen (1991) a concentração de glicose diminuiu no terço final da gestação e aumentaram logo após o parto. O nível de glicose plasmático é o indicador menos significativo do perfil para avaliar o status energético devido à insensibilidade da glicemia a mudanças nutricionais e à sua sensibilidade ao stress. A glicemia, todavia pode ser de utilidade em condições de déficit severo e em animais e em animais que não estão em gestação e lactação (GONZÁLEZ et al., 2000) Menores concentrações plasmáticas de colesterol foram registradas no momento do parto e no período após o parto, apresentando menor média de 1,14 mmol/l, decorridos15 dias após o parto; porém, as maiores médias foram registradas 30 e 7 dias anteriores ao parto com médias de 1,60 e 1,59 mmol/l respectivamente, e valores semelhantes a estes no período de 60 e 15 anteriores ao parto. González et al. (2000) afirmam que o colesterol nos animais pode ser tanto de origem exógena, oriundos dos alimentos, como endógena, sendo sintetizada a partir do acetil-coa no fígado, nas gônadas no intestino, na adrenal e na pele, e que seus níveis plasmáticos são indicadores adequados do total de lipídeos no plasma, pois corresponde a aproximadamente 30% do total. Sua diminuição está geralmente relacionada aos quadros de insuficiência hepática, dieta carente em energia, hipertireoidismo e pré-parto (SOARES et al., 2014). Pode-se ainda considerar que, além do estado final de gestação, a dieta dos animais tivesse um aporte energético não adequado, justificando a diminuição no período próximo ao parto e pós-parto. Para as concentrações séricas de triglicerídeos, observou-se maior média 15 dias (0,34 mmol/l) antes do parto e comportamento semelhantes nos tempos de 60 e 30 dias anteriores ao parto, parto e 7 dias do pós-parto; entretanto, foi registrado menor média 15 dias (0,18 mmol/l) no período após o parto. Já em relação a variável frutosamina foram observados médias superiores durante todo período correspondente ao terço final de gestação, ocorrendo uma diminuição significativa no parto e após 7 dias com médias de 135,91 µmol/l e 128,91 µmol/l respectivamente, voltando a aumentar no período de 15 dias pós-parto. A diminuição dos triglicerídeos e da frutosamina no decorrer das semanas, no terço final da gestação, parto e pós-parto, é possível dizer que o a gestação exerceu influência significativa sobre tais indicadores. Foram observadas variações significativas em todos os parâmetros sanguíneos em relação ao perfil de atividade enzimática, assim como para o perfil de minerais, nos diferentes períodos de gestação: AST (p=0.0035), GGT (p=0.0197), FA (p=0.0336), Ca (p<0.0001), P (p<0.0001), Ca:P (p=0.0088) e Mg (p<0.0004) ) (Tabela 2). Maior média de AST foi registrada 7 dias antes do parto com média de 115,13 U/L e análogas aos tempos de 30 e 15 dias do pré-parto; observou-se que as menores médias ocorreu nos período de 60 dias no pré-parto e no parto; podendo ser visualizado um aumento da concentrações nos períodos de 7 e 15 dias pós-parto. Para a variável GGT as maiores concentrações ocorreram 7 dias anterior ao parto e 15 dias do pós-parto com médias de 47,81 e 48,77 U/L respectivamente, e com menores médias no período de 60 dias (31,18 U/L) que antecederam o parto. Já para a FA as maiores médias foram registradas nos tempos entre 30 e 15 dias (135,81 e 123,51 U/L, respectivamente) antes do parto, e médias inferiores nos demais momentos analisados. As enzimas AST e GGT apresentaram valores superiores ao mínimo 60 U/L e 20 U/L, já a FA manteve- se abaixo do limite mínimo de 93 a 387 U/L relatados por Kaneko et al., (2008), durante a maior parte dos tempos observados, sendo influenciada pelo parto, voltando a aumentar logo após o parto. Acredita-se que possa ter ocorrido um equilíbrio nutricional pela ausência de transtornos metabólicos, como o que ocorre na toxemia da prenhez. Maior média de Ca foi observado 30 dias (9,86 U/L) do período pré-parto, estas médias foram diminuindo até 7 dias após o parto, onde foi observado a menor concentração (7,14 U/L), voltando a elevar-se 15 dias após o parto. Entre 60 e 15 dias anteriores ao parto foram registrados médias superiores para o P, ocorrendo uma diminuição no período de 7 dias antes do parto e permanecendo até os 15 dias de observação após o parto. O relato de Azab e Abdel-Maksoud (1999) descreve uma diminuição dos valores de cálcio desde quatro semanas antes do parto até a terceira semana de lactação. Segundo os mesmos Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

5 Francicleide Maria de Souza Charll dos Santos et al. Tabela 2: Valores médios, desvios-padrão e nível de significância (p) de parâmetros enzimáticos e minerais do sangue de ovelhas da raça Morada Nova no pré-parto, parto e pós-parto Parâmetros AST (U/L) GGT (U/L) FA (U/L) Ca (mg/dl) P (mg/dl) Ca:P Mg (mg/dl) Períodos da Gestação/Dias Pré-Parto Pós-Parto Parto Perfil de Atividade Enzimática 82,62 105,16 96,92 115,13 86,91 92,71 101,45 ±19,27 b ±11,39 ab ±23,71 ab ±16,96 a ±11,69 b ±22,66 ab ±19,13 ab 31,18 44,40 44,31 47,81 40,66 43,80 48,77 ±8,41 b ±14,62 ab ±13,11 ab ±9,40 a ±8,38 ab ±10,18 ab ±12,50 a 92,97 135,81 123,51 84,26 68,35 75,87 89,13 ±46,26 b ±59,09 a ±67,95 a ±42,50 b ±30,8 0b ±32,93 b ±59,07 b Perfil de Minerais 8,57 9,86 8,83 8,45 7,86 7,14 8,03 ±0,29 bc ±0,35 a ±0,51 b ±0,54 bcd ±0,80 de ±1,04 e ±0,73 cd 7,09 8,19 7,16 5,43 5,87 6,12 5,29 ±1,14 a ±1,24 a ±0,81 a ±0,62 b ±0,74 b ±0,57 b ±1,13 b 0,83 0,83 0,81 0,64 0,75 0,74 0,66 ±0,12 a ±0,12 a ±0,11 ab ±0,06 b ±0,10 ab ±0,22 ab ±0,16 ab 2,33 2,57 2,75 3,13 2,51 2,51 2,37 ±0,30 b ±0,27 b ±0,28 b ±0,72 a ±0,39 b ±0,20 b ±0,34 b Letras minúsculas distintas na mesma linha diferem ao nível de 5% de probabilidade p autores, essa diminuição ocorre na gestação devido ao aumento da demanda de cálcio para a mineralização do esqueleto do feto. Iriadam (2007) observou uma diminuição deste mineral a partir da 18 semana de gestação até a terceira semana após o parto. Durante todos os momentos analisados o P e Mg mantiveram-se acima dos valores de referência 2-9,6 e 1,8-3 U/L, respectivamente descritos por González et al. (2000). O Ca não é um bom indicador do estado nutricional do rebanho, devido ao controle endócrina da calcemia, enquanto que o P e o Mg refletem melhor o nível nutricional mineral (GONZÁLEZ et al., 2000). Em relação a Ca:P foi observado uma menor média no período de 7 dias (0,64 U/L) anteriores ao parto; registraram-se maiores médias nos tempos de 60 e 30 dias do terço final da gestação; demais tempos observados apresentaram concentrações semelhantes. A maior concentração de Mg foi registrada 7 dias antes do parto com valor médio de 3,13 U/L; com relação aos demais tempos foram registrados médias inferiores e semelhantes entre si. Deve-se preocupar no sistema de produção das ovelhas com os minerais necessários, pelo fato que possuem funções essenciais, com na estrutura de tecidos e biomoléculas, no metabolismo animal, participando como cofatores enzimáticos e ativadores de ação hormonal, além de serem responsáveis pela pressão osmótica e equilíbrio ácido básico (GONZÁLEZ et al., 2000). CONCLUSÃO O período gestacional influencia significativamente no perfil de metabólitos de parâmetros bioquímicos séricos proteicos, energéticos, atividade enzimática e de minerais, podendo esses valores ser utilizados como referência para a raça Morada Nova, além de serem utilizadas como ferramentas de diagnóstico de transtornos nutricionais e metabólicos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAUJO, C.A.S.C.; NIKOLAUS, J.P.; MORGADO, A.A.; MONTEI- RO, B.M.; RODRIGUES, F.A.M.L.; VECHIATO, T.A.F.; SOARES, P.C ; SUCUPIRA, M.C.A. Perfil energético e hormonal de ovelhas Santa Inês do terço médio da gestação ao pós-parto. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 34, p , AZAB, M.E.; ABDEL-MAKSOUD, H.A. Changes in some hematological and biochemical parameters during prepartum and postpartum periods in female Baladi goats. Small Ruminant Research., v.35, p.77-85, Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto, 2014

6 Perfil Bioquímico em ovelhas da raça Morada Novanos períodos de gestação, parto e pós parto CONTRERAS, P. A.; WITTWER, F. Uso dos perfis metabólicos no monitoramento nutricional dos ovinos. In: GONZÁLEZ, F. H. D.; OSPINA, H.; BARCELOS, J. O.; RIBEIRO, L.A.O. (Eds.) Perfil metabólico em ruminantes: Seu uso em nutrição e doenças nutricionais. Porto Alegre: Gráfica UFRGS, COPPO, J. A.; COPPO, N. B.; SLANAC, A. L. Ontogenia del médio interno em terneros lactantes cruza cebú. Actas de Ciência e Técnica UNNE, v. 2, p , GONZÁLEZ, F.H.; SILVA, S. C. Introdução à bioquímica clínica veterinária. Porto Alegre: UFRGS, p. GONZÁLES, F.H.D.; BARCELLOS, J.O.; OSPINA, H.; RIBEIRO, L.A.O. Perfil metabólico em ruminantes: seu uso em nutrição e doenças nutricionais. Porto Alegre: Gráfica da UFRGS, p. IRIADAM, M. Variation in certain hematological and biochemical parameters during the peri-partum period in Kilis does. Small Ruminant Research, v.73, p.54-57, KANEKO, J. J.; HARVEY, J. W.; BRUSS, M. L. Clinical biochemistry domestic animals, 6th Ed., San Diego: Academic Pess, 2008, 916p. MBASSA, G. K.; POULSEN, J. S.D. Influence of pregnancy, lactation and environment on clinical chemical reference values in Danish Landrace dairy goats (Capra hircus) of different parity II. Plasma urea, creatinine, bilirubin, cholesterol, glucose and total serum proteins. Comparative Biochemistry Physiology, v.100, n.2, p , PAYNE, J. M.; PAYNE, S. The metabolic profile test. Oxford, oxford University Press PEIXOTO, L. A. O.; O, M. T. M. Perfil metabólico protéico e energético na avaliação do desempenho reprodutivo em ruminantes. Revista Brasileira Agrociência, Pelotas, v.13, n.3, p , PICCIONE, G.; CAOLA, G.; GIANNETTO, C. et al. Selected biochemical serum parameters in ewes during pregnancy, post-parturition, lactation and dry period. Anim. Sci. Pap. Rep., v.27, n.4, p , SANDABE, U. K.; MUSTAPHA, A.R.; SAMBO, E.Y. Effect of pregnancy on some biochemical parameters in Sahel goats in semi-arid zones. Vet. Res. Commun., v.28, p , SAUT, J. P. E.; SOUZA, R. M; BIRGEL, D. B. et al. Influência do puerpério sobre o proteinograma sérico de caprinos da raça Saanen obtido por eletroforese em gel de poliacrilamida. Semina Ciênc. Agrar., v.30, n.3. p , SOARES, P.C.; MARTINELE, I.; D AGOSTO, M.; MARUTA, C.A.; SUCUPIRA, M.C.A.; ANTONELLI, A.C.; MORI, C.S.; ORTOLA- NI, E.L. Effect of na energy-deficient diet on population of ciliate protozoans in bovine rumen. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 60, n. 1, p , SOARES, F.A.P.; NETO, A.V.B.; FREITAS, I.B.; CARVALHO, C.C.D.; BARBOSA, J.D.; SOARES, P.C. Perfil sérico de alguns constituintes sanguíneos de ovelhas da raça Dorper no período gestacional e pós-parto. Revista de Ciências Agrárias, v. 57, n 3, p.1-7, STATISTICAL ANALYSES SISTEM INSTITUTE, Inc SAS/STAT User s Guide, Version 8 Edition SAS Inst., Inc., Cary, NC. THOMAS, L.; WALLACE, J. M.; AITKEN, R. P. Circulating leptin ovine pregnancy in relation to maternal nutrition, body composition and pregnancy outcome. The Journal of Endocrinology, v. 169, n. 3, p , WITTWER, F.; REYES, J. M.; OPITZ, H. et al. Determinación de urea en muestras de leche de rebaños bovinos para El diagnostico de desbalance nutricional. Archivo Medico Veterinário. v. 25, p , YANAKA, R.; CAMARGO, D. G.; SANTOS, W. A. et al. Glicemia, proteinograma e perfil de alguns componentes bioquímicos séricos de cabras da raça Bôer no pós-parto. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.49, n.1, p.39-45, Fonte de financiamento: CNPq, pela concessão de Bolsa de Iniciação Científica; FACEPE, pelo Projeto de Pesquisa aprovado no edital FACEPE/MCT/CNPQ/CT INFRA - PROGRAMA PRIMEIROS PROJETOS; CAPES, pela aprovação da aquisição do equipamento de bioquímica automatizado LABMAX 240 no edital Pró-Equipamentos CAPES/UFRPE. O projeto referente a estudo de perfil bioquímico de fêmeas gestantes foi submetido à avaliação pelo Comitê de Ética (CEUA), N 030/ /2012. SANTOS, F. C. O.; MENDONÇA, C. L.; SILVA FILHO, A. P.; CARVA- LHO, C. C. D.; SOARES P. C.; AFONSO J. A. B. Indicadores bioquímicos e hormonais de casos naturais de toxemia da prenhez em ovelhas. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 11, n. 31, p , Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

7 Ciência Veterinária nos Trópicos, Recife-PE, v. 17, n. 1/2 p janeiro/agosto, 2014 Uso de glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes botusêmen e ACP-105 na integridade de espermatozoides equinos refrigerados Victor Netto MAIA¹, Felipe Costa ALMEIDA², Sildivane Valcácia SILVA³, Gustavo Ferrer CARNEIRO 4, Pierre Castro SOARES 4, Karen Mascaro Gonçalves da SILVA 5, Maria Madalena Pessoa GUERRA 4 * RESUMO 1 UNINASSAU Docente do Curso de Medicina Veterinária; 2 Médico Veterinário; 3 UFPB Docente do Curso de Biotecnologia; 4 UFRPE Docente do Curso de Medicina Veterinária; 5 Médica Veterinária. *Autor para correspondência: mpguerra@dmv.ufrpe.br Visando estudar o efeito da adição de glutationa peroxidase (GPx) e cisteína (Cis) aos diluentes Botu-Sêmen e ACP-105 na viabilidade de espermatozoides equinos, amostras de sêmen foram refrigeradas (14 ºC) e analisadas quanto à motilidade total (MT), vigor, integridade de membrana (im) e de acrossoma (iac), e potencial da membrana mitocondrial (PMM), após 0 (T0), 12 (T12) e 24 (T24) horas de refrigeração. A análise da MT evidenciou no T12 que as amostras de sêmen dos grupos Botu-sêmen (G1) e Botu-sêmen +GPx+Cist (G7) apresentaram maiores (P<0,05) percentuais do que no grupo ACP-105 +Cist (G6). No T24, as amostras do G7 apresentaram maior (P<0,05) MT do que as diluídas em ACP-105 (G2) e ACP Cist (G6). O vigor espermático no T12 foi maior (P<0,05) no G7 do que no G2 e G6. No T24, o vigor das amostras do G4 e G7 foi maior (P<0,05) do que nas do G2 e G6. A im e o PMM não diferiram (P>0,05) entre grupos, com exceção do PMM que no T0 foi maior (P<0,05) no G1 do que no G7 e no G8. A iac no T24 foi maior (P<0,05) no G6 do que no G1. Conclui-se que a associação de GPx (5 U) e Cist (5 mm) preserva espermatozoides equinos diluídos em Botu-sêmen refrigerados (14 oc) durante 24 horas. PALAVRAS-CHAVE ACP-105, Botu-sêmen, antioxidantes, refrigeração. Use of glutathione peroxidase and cysteine in Botu-Sêmen and ACP-105 diluents on integrity of chilled equine spermatozoa ABSTRACT Aiming to study the effect of glutathione peroxidase (GPx) and cysteine (Cis) addition in Botu-Sêmen and ACP-105 diluents on integrity of equine spermatozoa, semen samples were cooling (14 C) and analyzed for total motility (TM), vigor, membrane integrity (im) and acrosome (iac), and mitochondrial membrane potential (MMP), after 0 (T0), 12 (T12) and 24 (T24) hours of cooling. Analysis of TM in T12 demonstrated that semen samples diluted in Botu-sêmen (G1) and Botu-sêmen +GPx+ Cis (G7) had higher (P<0.05) percentage than those diluted in ACP Cis (G6). At T24, samples diluted in G7 had higher MT (P<0.05) than those in G2 and G6. Sperm vigor in T12 was higher (P<0.05) in samples diluted at G7 than in G2 and G6. At T24, the vigor of samples diluted G4 and G7 was higher (P<0.05) than in G2 and G6. No significant difference were observed to im and MMP among groups, except to MMP at T0 was higher (P<0.05) in G1 than G7 and G8. At T24 the iac parameter was higher (P<0.05) in the G6 than in G1. It can be concluded that GPx (5U) and Cis (5mM) in association preserves equine spermatozoa diluted in Botu-sêmen at 14 C during 24 hours. KEYWORDS ACP-105, Botu-sêmen, antioxidants, cryopreservation time. 48

8 Uso de glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes botu-sêmen e ACP-105 na integridade de espermatozoides equinos refrigerados INTRODUÇÃO O sêmen de garanhões pode tolerar variação de temperatura durante o armazenamento in vitro. Entretanto, temperaturas próximas a 0 ºC são prejudiciais à viabilidade dos espermatozoides desta espécie, quando o tempo de estocagem é prolongado. Assim, o uso de containers para transporte de sêmen pode ser utilizado por 22 horas, desde que a temperatura interna do dispositivo não seja reduzida a menos de 4 ºC (Vidament et al., 2012). Diluentes à base de leite desnatado-glicose são eficazes em preservar a motilidade progressiva (MP) e o vigor espermático durante 24 horas a 6-8 C, resultando em boa capacidade de fertilização (Pugliesi et al., 2012), porém, hoje se busca por produtos que não sejam de origem animal e a água de coco tem se mostrado uma boa alternativa (Sobreira Neto, 2008). Na apresentação em pó, a água de coco (ACP-105 ) proporciona as mesmas vantagens dos diluentes comerciais de origem animal (Silva et al., 2006). Manipulação de sêmen equino durante o processo de resfriamento reduz a viabilidade espermática e fertilidade em consequência, dentre outros, da peroxidação dos lipídeos da membrana, devido ao alto teor de ácidos graxos poliinsaturados, que torna estas células altamente suscetíveis aos radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS) (Cocchia et al. 2011). Estudos têm adicionado substâncias antioxidantes aos diluentes de criopreservação do sêmen, visando preservar a viabilidade dos espermatozoides por mais tempo (Guerra et al., 2012). A enzima glutationa peroxidase (GPx) converte o H 2 O 2 em água pela oxidação da glutationa, protegendo os espermatozoides contra os efeitos das ROS (Maia et al., 2010). Cisteína, um antioxidante não enzimático, impede a peroxidação lipídica, tem a capacidade de penetrar nas membranas celulares (Bilodeau at al., 2001) além de preservam alguns parâmetros cinéticos (Barros et al, 2013). Objetivou-se estudar o efeito da adição da glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes Botu-sêmen e ACP-105 na viabilidade de sêmen refrigerado de equinos. MATERIAL E MÉTODO Com exceção daqueles especificados no texto, os reagentes utilizados no experimento foram obtidos da Sigma Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Quatro Mangalarga Marchador, entre quatro e oito anos, clinicamente sadios, foram submetidos ao mesmo manejo nutricional e sanitário. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética para Experimentação e Uso de Animais da Universidade Federal Rural de Pernambuco (CEUA/DMV 080/2008). Os garanhões foram submetidos a colheitas de sêmen (n=3) com vagina artificial (modelo colorado; 42 ºC), a intervalos de 24 horas, totalizando 12 amostras, sendo utilizada égua em estro. Após colheita, procedeu-se a avaliação macroscópica (coloração, aspecto e volume) e microscópica (MT e vigor espermático) (Mies Filho, 1987). Duas alíquotas (5 ml) de cada ejaculado foram diluídas (10 ml) em Botu-sêmen (Biotech Botucatu, Botucatu-SP, Brasil) ou ACP-105 (ACP Biotecnologia, Fortaleza - CE, Brasil). A seguir, cada amostra de diluente + sêmen foi dividida para formar os grupos experimentais, de acordo com a adição de glutationa peroxidase (GPx; 5 U/mL de diluente) ou cisteína (Cist; 5 mm): G1= Botu-sêmen ; G2= ACP-105 ; G3= Botu-sêmen +GPx; G4= ACP-105 +GPx; G5= Botu-sêmen +Cist; G6= ACP-105 +Cist; G7= Botu-sêmen +- GPx+Cist e G8= ACP GPx+Cist. Amostras de cada grupo foram colocadas em tubos de microcentrífuga (1 ml), acondicionados em duas caixas de refrigeração de sêmen (Botu-Box, Biotech Botucatu, Botucatu-SP, Brasil). Para controle da temperatura, um termômetro digital foi colocado em cada caixa. As amostras de sêmen foram submetidas à avaliação de MT, vigor, im e iac, e PMM, no tempo 0 (T 0 ), 12 (T 12 ) e 24 horas (T 24 ) de refrigeração a 14 o C. Nas análises com as sondas fluorescentes, um total de 200 células foi avaliado em microscópio de epifluorescência (Carl Zeiss, Göttingen, Germany) para cada teste e grupo. A análise da im foi realizada e classificada pelo método de coloração dupla de acordo com Harrison e Vickers (1990). Para análise da iac, utilizou-se IP e Isotiocíanato de Fluoresceína conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA; Barros et al., 2013). Os espermatozoides foram classificados como portadores de iac, quando corados em verde fluorescente na região acrossomal, e reagidos, quando corados em verde fluorescente na região equatorial ou não apresentaram fluorescência verde. O PMM foi avaliado e classificado através do fluorocromo catiônico lipofílico JC-1, segundo Guthrie e Welch (2006). Os dados foram submetidos à análise de variância (Teste F) que separou como causa de variação o efeito de grupos e tempos de análise do sêmen. Nos casos de significância no teste F, as médias dos tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan. Para avaliação de cada grupo em função do tempo, utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey. Os dados foram analisados no programa Statistical Analysis System (SAS, 2000), usando-se o procedimento GLM (General Linear Model) do SAS. Para todas as análises estatísticas foi adotado P<0,05. O modelo utilizado foi: Y ij = G + T + GT + E ij, onde: Y ij = valor observado; G = efeito dos grupos; T = efeito dos tempos; GT = Interação entre grupo x tempos; E ij = erro. Realizou-se, também, análise de correlação de Pearson para pares de variáveis do sêmen (Little e Hills, 1978). RESULTADOS Os ejaculados apresentaram, em média, volume de 40,4 ml, cor branca opalescente, aspecto leitoso a aquoso, motilidade de 72,92% e vigor de 3,5. Na Tabela 1 o PMM, em cada tempo, diferiu entre os grupos no T 0h, com maior porcentual (P<0,05) de gametas com apmm para o G1, em comparação ao G7 e G8. O G3 apresentou menor porcentual (P<0,05) no T 12 em relação ao T 0. O G1, G2, G5 e G6 apresentaram menores porcentuais (P<0,05) no T 24 em relação ao T 0. No T 12 a MT do G1 e G7 apresentaram maiores (P<0,05) percentuais do que G6. Com exceção do G6, todas as amostras Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

9 Victor Netto MAIA et al. diluídas em Botu-sêmen preservaram mais a MT com valores acima de 30%, em comparação aos grupos em que se utilizou o ACP-105, no T 12 e no T 24. No T 24 amostras do G4 também preservaram a MT com valores acima de 30%. O G2, G3, G5, G6 e G8 apresentaram redução (P<0,05) da MT no T 12, em relação a T 0, enquanto que as amostras do G1 apresentaram redução (P<0,05) apenas no T 24. No T 12 o G7 apresentou maior valor (P<0,05) do que aquelas do G1 e G6. No T 24, o G4 e G7 apresentaram maiores valores (P<0,05) do que aqueles observados no G2 e G6. As amostras G2, G4 e G6 apresentaram menores (P<0,05) valores no T 12 do que no T 0. No T, valores de vigor 12 acima de 3,0 foram observados no G1, G3, G4 e G7, enquanto que no T 24 apenas as do G3, G4 e G7 (Tabela 2). Não houve redução do percentual de gametas com im. No T 24 o G6 apresentou maior (P<0,05) porcentual com iac do que do G1. G1 e G7 apresentaram redução dos porcentuais (P<0,05) de gametas com iac no T 24, em relação ao T 0 (tabela 3). Alta correlação (p<0,05) foi constatada da MT com vigor (r= 0,83022; p<0.0001) e apmm (r= 0,70658; p<0,0001), assim como do vigor com o apmm (r= 0,70357; p<0,0001). Observou-se moderada correlação da MT com a im (r= 0,39448; p<0,0001); do vigor com a im (r= 0,39356; p<0,0001); do apmm com a im (r= 0,47289; p<0,0001) e a iac (r= 0,34340; p<0,0001). Observou-se, ainda, que a iac apresentou baixa correlação com MT (r= 0,15830; p<0,0743), vigor (r= 0,16194; p<0,0678) e im (r= 0,13976; p<0,1156). DISCUSSÃO A média dos resultados obtidos na avaliação do sêmen no T 0 foram considerados satisfatórios no que diz respeito aos parâmetros de MT, im e PMM, visto que neste momento a célula ainda não sofreu estresse oxidativo, uma vez ser indispensável um período de tempo para que os espermatozoides produzam ROS e determinem estresse oxidativo (Soares e Guerra, 2009). O diluente ACP-105 tem sido utilizado na criopreservação de sêmen de equinos, com resultados superiores aos de diluentes à base de leite (Raphael, 2007 e Sobreira Neto, 2008). Todavia, resultados insatisfatórios foram observados por Maia et al. (2010) ao utilizarem a água de coco como diluente de refrigeração a 5 ºC. A refrigeração de amostras de sêmen diluídas em Botu-sêmen e ACP-105 não preservaram a MT dos espermatozoides, embora Vidament et al. (2012) demonstraram tolerância dos espermatozoides equinos à variação de temperatura positiva (5 a 15 ºC) durante o armazenamento por 22 horas ou mais, utilizando INRA 96. Animais podem apresentar sêmen classificado como viável no momento da colheita e após diluição e redução de temperatura, estas amostras podem diminuir a viabilidade. Nesta pesquisa foi observado que o uso do ACP-105 causou redução acentuada da MT no T 12, com exceção do G4, com porcentuais de gametas vivos acima de 30% até T 24, ressaltando o efeito positivo da associação deste diluidor com a GPx, enzima que atua na síntese de proteína, metabolismo e proteção celular (Meister e Anderson, 1983). A água de coco é pobre em fosfolipídeos, assim como o leite desnatado. A proteção conferida pelo leite se baseia nas proteínas e carboidratos presentes em sua composição, sendo a caseína a proteína protetora da célula espermática (Bergeron e Manjunath, 2006). No entanto, os mecanismos de proteção da água de coco na célula espermática ainda não estão bem elucidados. Neste experimento, o uso do ACP-105 não promoveu a manutenção da MT em um período curto de tempo. Pode ser que a membrana plasmática do espermatozoide equino necessite se manter estável durante a redução da temperatura, uma vez que a transição da fase fluída para a fase gel tem início quando a célula espermática atinge a temperatura média de 20,7 ºC (Parks e Lynch, 1992), o que não foi conseguido no G1. Amostras do G4 e G7 evidenciaram o efeito positivo da Tabela 1 - Média ± desvio padrão de espermatozoides equinos diluídos em Botu-Sêmen ou ACP-105, suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteína (5 mm), portadores de alto potencial de membrana mitocondrial durante 24 horas de incubação a 14ºC Grupos Experimentais Tempo de incubação (horas) T 0 T 12 T 24 Botu-Sêmen 79,25±11,51 Aa 64,71±10,65 ab 45,08±26,19 b ACP ,29±11,87 ABa 55,79±20,89 a 45,50±22,74 b Botu-Sêmen +GPx 73,58±11,98 ABa 65,50±15,34 b 57,75±22,14 b ACP-105 +GPx 69,46±19,87 ABa 71,42±7,14 a 58,63±19,97 a Botu-Sêmen +Cist 70,46±13,18 ABa 63,08±15,23 ab 48,25±23,24 b ACP-105 +Cist 71,96±13,85 ABa 53,33±16,41 ab 47,13±18,98 b Botu-Sêmen +GPx+Cist 65,46±10,48 Ba 62,92±8,68 a 56,79±23,68 a ACP-105 +GPx+Cist 63,88±13,74 Ba 59,67±14,02 a 45,96±19,07 a Cist = cisteína; Letras minúsculas distintas na mesma linha indicam P<0,05; letras maiúsculas distintas na mesma coluna indicam P<0, Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto, 2014

10 Uso de glutationa peroxidase e cisteína aos diluentes botu-sêmen e ACP-105 na integridade de espermatozoides equinos refrigerados Tabela 2 - Média ± desvio padrão da motilidade total (%) e vigor (0-5) de espermatozoides equinos diluídos em Botu-Sêmen ou ACP-105, suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteína (5 mm), durante 24 horas de incubação a 14ºC Grupos Experimentais Motilidade Total (%) Vigor (0-5) Tempo de incubação (horas) Tempo de incubação (horas) T 0 T 12 T 24 T 0 T 12 T 24 Botu-Sêmen 65,00±13,48 a 48,75±15,39 Aab 35,00±21,21 ABb 3,33±0,49 a 3,17±0,39 ABa 2,67±0,98 ABCa ACP ,50±15,74 a 17,08±14,05 ABbc 7,08±9,40 BCc 3,25±0,75 a 2,17±0,83 Bb 1,42±1,00 BCc Botu-Sêmen +GPx 64,58±15,29 a 42,08±26,41 ABbc 33,75±20,90 ABCc 3,50±0,67 a 3,00±1,13 ABa 3,00±1,13 ABa ACP-105 +GPx 54,58±17,12 a 36,00±22,71 ABa 36,25±22,58 ABa 3,50±0,67 a 3,33±0,65 ABb 3,42±0,67 Ab Botu-Sêmen +Cist 56,25±16,67 a 18,33±13,54 ABb 14,17±14,59 ABCb 3,50±0,90 a 2,42±0,90 ABab 2,08±1,16 ABCb ACP-105 +Cist 44,17±17,03 a 8,33±6,51 Bb 4,58±4,98 Cb 3,42±0,79 a 2,25±0,87 Bb 1,58±1,51 BCb Botu-Sêmen +GPx+Cist 57,08±18,64 a 49,58±18,40 Aa 39,58±20,50 Aa 3,67±0,78 a 3,58±0,51 Aa 3,50±0,52 Aa ACP-105 +GPx+Cist 48,75±15,09 a 23,75±10,25 ABb 13,33±12,12 ABCb 3,58±0,67 a 2,92±0,79 ABab 2,25±1,14 ABCb Cist = cisteína; Letras minúsculas distintas na mesma linha indicam P<0,05; letras maiúsculas distintas na mesma coluna indicam P<0,05. Tabela 3 - Média ± desvio padrão de espermatozoides eqüinos diluídos em Botu-Sêmen ou ACP-105, suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteína (5 mm), portadores de membrana plasmática e acrossoma íntegros após 24 horas de incubação a 14ºC Grupos Experimentais Membrana plasmática íntegra (%) Acrossoma íntegro (%) Tempo de incubação (horas) Tempo de incubação (horas) T 0 T 12 T 24 T 0 T 12 T 24 Botu-Sêmen 61,17±14,90 61,29±9,65 60,08±9,39 33,00±19,43 a 20,79±16,23 a 13,83±5,86 Bb ACP ,83±10,04 55,83±18,51 51,79±20,64 38,96±15,80 a 28,38±10,05 ab 31,67±14,61 ABab Botu-Sêmen +GPx 69,25±14,94 62,38±14,81 57,79±15,66 29,58±14,30 a 22,33±12,57 ab 17,63±17,88 ABab ACP-105 +GPx 59,08±11,53 63,08±17,84 62,75±14,47 30,96±19,12 a 25,83±17,38 a 15,67±14,00 ABa Botu-Sêmen +Cist 67,54±15,90 56,00±16,66 44,67±23,20 34,83±15,87 a 30,88±14,07 a 30,17±14,16 ABa ACP-105 +Cist 65,58±12,10 57,25±24,20 48,42±25,23 39,83±20,98 a 38,83±15,83 a 37,75±15,91 Aa Botu-Sêmen +GPx+Cist 66,67±13,86 66,17±16,68 59,50±7,61 36,83±17,41 a 23,58±12,57 a 16,42±15,54 ABb ACP-105 +GPx+Cist 63,75±10,44 56,88±19,15 57,50±19,70 40,33±14,38 a 39,29±20,03 a 33,25±16,83 ABa Cist = cisteína; Letras minúsculas distintas na mesma linha indicam P<0,05; letras maiúsculas distintas na mesma coluna indicam P<0,05 adição de GPx em relação ao vigor no T 24. Provavelmente isto resultou da presença do resíduo de cisteína contendo selênio covalentemente ligado, com ação no transporte de aminoácidos, síntese protéica, redução de cadeias de dissulfito e proteção contra ROS (Bertelsmann et al., 2007). Os porcentuais reduzidos de gametas com iac em todos os grupos no T 0 podem ser explicados pelo fato de que em equinos, os padrões de motilidade e vigor espermáticos não são suficientes para classificá-los como bom reprodutor. No entanto, no T 24 apenas as amostras do G1, G5, G6 e G8 apresentaram porcentuais de células com iac acima de 30%, mínimo para uso do sêmen na IA. Este resultado possivelmente está relacionado com a técnica de análise, onde o corante se ligaria às lectinas, disponíveis em gema de ovo (Watson, 1995) ou no leite de soja (Bittencourt et al., 2008), não se ligando, prioritariamente, ao acrossoma, por uma questão de biodisponibilidade. Uma hipótese é o fato da água de coco apresentar, em sua composição, o ácido 3-indol-acético (IAA), hormônio que atua no crescimento de vegetais e se liga a proteínas solúveis (Barbier-Brygoo, 1995). Esta associação do IAA às proteínas solúveis pode ter acarretado uma provável alteração do corante utilizado na técnica, já que o mesmo é de origem vegetal. O ajuste da técnica ao diluidor utilizado pode justificar a baixa correlação observada entre os resultados de MT, vigor e im Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto,

11 Victor Netto MAIA et al. com os de iac. Considerações metodológicas são importantes a fim de projetar um protocolo de confiança e reprodutível para o estudo da reação acrossômica. As amostras de sêmen refrigerado apresentaram porcentuais elevados de gametas com apmm até 24 horas, indicando preservação do metabolismo espermático e pouca produção de ROS na peça intermediária durante este período de armazenamento. Podendo ser justificados pelo fato das mitocôndrias serem responsáveis pela produção de energia necessária para a manutenção do movimento (Watson, 1995). Comparando as análises, constatou-se alta correlação da MT com vigor e apmm, assim como do vigor com o apmm. Estes resultados evidenciam que, para esta espécie e nas condições deste experimento, a MT e o vigor foram positivamente influenciados pelo apmm, uma vez que ATPs são requeridos para manter a atividade metabólica da célula espermática (Pozzan e Rudolf, 2009), que no sêmen refrigerado mantém reduzida, porém ativa. Moderada correlação foi observada entre MT e im, vigor e im; apmm e im. Evidenciando que a célula pode apresentar motilidade sem necessariamente apresentar suas estruturas intactas, uma vez que durante os processos de criopreservação existem modificações estruturais nas membranas, ocasionando a criocapacitação, onde se observam células com aumento de motilidade, decorrente de alterações na membrana plasmática, e precoce reação acrossomal (Silva et al., 2009). CONCLUSÕES O diluidor ACP-105 não é uma alternativa eficiente para sêmen equino refrigerado, quando comparado ao Botu-sêmen ; O uso de 5U de GPx, em associação ao Botu-sêmen ou ACP-105 e o uso de 5mM de cisteína, em associação ao Botu-sêmen ou ACP-105 e GPx, preservam a viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados a 14 ºC durante 24 horas. Estudos do uso de diferentes tipos e concentrações de antioxidantes para sêmen nesta espécie são necessários. AGRADECIMENTOS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa; à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARBIER-BRYGOO, H. Tracking auxin receptors using functional approaches. Critical Reviews in Plant Sciences, v. 14, p. 1-25, BARROS, L.O., SILVA, S.V., ALMEIDA, F.C., SILVA, E.C.B., CARNEI- RO, G.F., GUERRA, M.M.P. Efeito da adição de glutationa peroxidase e cisteína ao diluidor de congelação do sêmen equino. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 65, n. 2, p , BERGERON, A.; MANJUNATH, P. New insights towards understanding the mechanisms of sperm protection by egg yolk and milk. Molecular Reproduction and Development, v. 73, p , BERTELSMANN, H.; KUEHBACHER, M.; WESELOH, G., KYRIA- KOPOULOS, A.; BEHNE, D. Sperm nuclei glutathione peroxidases and their occurrence in animal species with cysteine-containing protamines. Biochemistry Biophysical Acta, v. 1770, p , BILODEAU, J.F.; BLANCHETTE, S.; GAGNON, C.; SIRAD, M.A. Thiols prevent H2O2 mediated loss of sperm motility in cryopreserved bull semen. Theriogenology, v. 56, p , BITTENCOURT, R.F.; RIBEIRO, A.L.; LIMA, M.C.C.; ALVES S.G.G.; VASCONCELOS M.F.; BISCARDE C.E.; LEAL L.S.; OBA, E. Efeito de um quelante de cálcio, um detergente e da lecitina de soja sobre a qualidade do sêmen caprino congelado-descongelado. Brazilian Journal of Veterinary Research Animal Science, v. 45, n. 4, p , COCCHIA, N.; PASOLINI, M..P.; MANCINI, R.; PETRAZZUOLO, O.; CRISTOFARO, I.; ROSAPANE, I.; SICA, A.; TORTORA, G.; LORIZIO, R.; PARAGGIO, G.; MANCINI, A. Effect of sod (superoxide dismutase) protein supplementation in semen extenders on motility, viability, acrosome status and ERK (extracelular signal-regulated kinase) protein phosphorylation of chilled stallion spermatozoa. Theriogenology, v. 75, p , GUERRA, M.M.P.; CÂMARA, D.R.; SILVA, E.C.B.; SILVA, S.V. Uso de antioxidantes no sêmen ovino. Ciência Animal, v. 22, p , GUTHRIE, H.D.; WELCH G.R. Determination of intracellular reactive oxygen species and high mitochondrial membrane potential in Percoll-treated viable boar sperm using fluorescence-activated flow cytometry. Journal of Animal Science, v. 84, p , HARRISON, R.A.P.; VICKERS, S.E. Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. Journal for Reproduction Fertility, v. 88, p , LITTLE, T.M.; HILLS, F.J. Agricultural experimentation: design and analysis. New York: John Wiley, p. MAIA, V.N.; CARNEIRO, G.F.; SILVA, S.V.; GOMES NETO, O.C.; ALMEIDA, F.C.; SALGUEIRO, C.C.M.; NUNES, J.F.; DEL ÁQUA JR., J.A.; GUERRA, M.M.P. Equine semen extender without animal derived ingredients: Preliminary results. Acta. Scientia Veterinariae. 38 (supl 2): s675-s821. P. s730, abstract 85. Anais, SBTE, MEISTER, A.; ANDERSON, M.E. Glutathione. Annual Review Bio- 52 Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 17, no 1/2, p janeiro/agosto, 2014