AVALIAÇÃO ANATOMO-HISTOPATOLÓGICA DE TECIDOS DE RATAS TRATADAS COM EXTRATO BRUTO DE PSYCHOTRIA COLORATA WILLD DURANTE A FASE DE PRÉ-IMPLANTAÇÃO EMBRIONÁRIA Andressa Karollini e Silva 1 ; Clarissa Amorim Silva de Cordova 2 1 Aluna do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; e-mail: andressa_karollini@hotmail.com PIBIC/CNPq 2 Orientadora do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; e-mail: clarissa@uft.edu.br RESUMO O presente estudo objetivou avaliar os efeitos tóxicos sistêmicos da administração do extrato bruto de Psychotria colorata em ratas Wistar através de exames anatomohistopatológicos, hematologia e bioquímica sérica, elucidando os possíveis efeitos deletérios na reprodução. A P. colorata foi coletada no município de Carmolândia TO. O extrato bruto (EB) foi obtido por meio de trituração das folhas e percolação em etanol 99%, sendo esta solução etanólica evaporada em rotaevaporador. No estudo in vivo, os animais foram divididos em dois grupos, experimental e controle, os quais receberam EB da P. colorata e veículo (óleo vegetal), respectivamente. Os tratamentos foram administrados via gavagem às fêmeas, do primeiro ao quinto dia de gestação, sendo a dose diária média equivalente a 170 mg/kg do EB da P. colorata. No 21º dia de gestação procedeu-se a coleta de sangue para avaliação hematológica e sorológica. Em seguida, realizou-se a eutanásia e necrópsia para avaliação macroscópica dos órgãos, pesagem para cálculo do peso relativo dos mesmos e coleta de fragmentos para avaliação anatomo-histopatológica. Os resultados revelaram toxicidade materna por meio da diminuição nas concentrações de hemoglobina e dos níveis séricos de bilirrubina indireta, direta e total de ratas tratadas, porém, não promoveu alterações no peso relativo, bem como lesões nos órgãos avaliados. Palavras-chave: toxicologia; Psychotria colorata; animais de laboratório; fertilidade. INTRODUÇÃO O número de plantas tóxicas para ruminantes no Brasil vem crescendo consideravelmente. Segundo Tokarnia, Döbereiner e Peixoto (2002), a região norte do Brasil concentra o maior número de mortes decorrentes de intoxicação por plantas. Em recente estudo de investigação de plantas tóxicas no estado do Tocantins
produtores relataram a ocorrência de abortos em vacas associados ao consumo de Psychotria colorata (COSTA, 2009). Estudos prévios mostraram que a administração de 5% de P. colorata na ração de ratos machos por 60 dias induziu toxicidade para os mesmos provocando efeitos deletérios sobre a reprodução dos animais expostos produzindo menor proporção de filhotes machos, redução do peso das fêmeas prenhes e do comprimento da prole. Além disso, os animais apresentaram redução de consumo de água, ração e do ganho de peso, redução dos níveis de colesterol, aumento de creatinina circulante e degeneração vacuolar em hepatócitos (dados não publicados), justificando novas pesquisas relacionadas aos mecanismos de ação dos princípios tóxicos isolados da planta. Assim, visando elucidar os possíveis efeitos deletérios sobre a reprodução provocados pelo consumo de P. colorata, o presente estudo tem por objetivo avaliar a toxicidade reprodutiva do extrato bruto da P. colorata em ratas. MATERIAL E MÉTODOS A Psychotria colorata foi coletada no município de Carmolândia TO nos meses de novembro/2011 a março/2012 e suas folhas foram secas em estufa ventilada 55ºC/72 horas. O extrato bruto (EB) foi obtido após trituração das folhas de P. colorata seguida de percolação em etanol 99% por duas semanas. A solução etanólica obtida foi evaporada sob pressão reduzida em rotaevaporador (Fisatom Mod. 801), com temperatura controlada de 45 C. O EB foi pesado e o seu rendimento calculado considerando a massa do EB obtida após a evaporação do solvente e a massa inicial do material vegetal. No ensaio in vivo, os animais, 25 fêmeas e 25 machos de ratos Wistar, foram divididos em grupos, para cada sexo, sendo 15 animais experimentais e 10 controles. Os animais experimentais receberam via gavagem, uma dose diária média de 170 mk/kg do EB da P. colorata do primeiro ao quinto dia após a confirmação da prenhez. Os grupos controles receberam apenas o veículo (óleo de milho). No DG21 as fêmeas foram anestesiadas e procedeu-se a coleta de sangue para avaliação hematológica e sorológica. Em seguida, realizou-se a eutanásia e necrópsia para avaliação macroscópica dos órgãos, pesagem, cálculo do peso relativo a partir da seguinte fórmula: ((peso do órgão / peso corporal) x 100) e coleta de fragmentos dos rins, fígado, baço, estômago, pulmões, coração, adrenais, linfonodos mesentéricos, porções do intestino delgado, intestino grosso, ovários, útero e encéfalo. Amostras de sangue foram encaminhadas para a contagem de glóbulos
vermelhos, concentração de hemoglobina (Hb), volume corpuscular médio (VCM), hematócrito, hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM). O material encaminhado à sorologia foi centrifugado para obtenção do soro e armazenado congelado em freezer até o momento da análise bioquímica. As amostras de soro foram avaliadas para a determinação de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina, creatinina, fosfatase alcalina, proteína total, ureia, ácido úrico, colesterol, triglicerídeos, glicose e bilirrubina. Para a análise do perfil bioquímico foi utilizada a técnica de ELISA, por meio de conjunto diagnóstico comercial e análise em leitor de ELISA ASYS UVM 340 (Analítica ). As amostras de tecidos para avaliação anatomo-histopatológica foram fixadas por 24 horas e conservadas em solução de formalina a 4 % tamponada. No processamento do material, os fragmentos de tecidos foram desidratados em álcool etílico em concentrações crescentes, diafanizados em xilol, impregnados e incluídos em parafina líquida para a realização dos cortes histológicos com 5μm de espessura, os quais foram submetidos a coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) para posterior avaliação em microscópio óptico e elaboração do laudo histopatológico. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística. RESULTADOS E DISCUSSÃO O tratamento fitoquímico de 200g de material vegetal seco produziu 30g de extrato bruto. A avaliação hematológica e bioquímica revelou respectivamente diminuição nas concentrações de hemoglobina (Tabela 1) e dos níveis séricos de bilirrubina indireta, direta e total (Tabela 2). A bilirrubina é um produto da degradação do heme da hemoglobina pelo sistema retículo-endotelial (CAMPBELL, 2007). Desta forma, a diminuição observada pode estar relacionada com a redução observada na concentração de hemoglobina. O exame anatomohistopatológico do fígado (Figuras 1A e B), rins (Figuras 1C e D), coração (Figuras 1E e F), pulmões (Figuras 1G e H), adrenais, baço, estômago, porções do intestino delgado, intestino grosso, útero e ovários, não detectou alterações relevantes tanto nos animais do grupo controle quanto nos animais do grupo experimental. Além disso, não houve alterações nos pesos relativos dos órgãos avaliados (Tabela 3).
Tabela 1 - Índices hematimétricos de ratas Wistar tratadas do 1 ao 5 dia de gestação com extrato bruto de P. colorata e seu respectivo grupo controle. Eritrócitos (x10 6 µl) 5,00 ± 0,20 5,09 ± 0,16 Hematócrito (%) 30,00 ± 1,01 27,20 ± 1,59 Hemoglobina (g/dl) 19,92 ± 1,55 16,06 ± 1,00* VCM (µ 3 ) 61,05± 3,19 53,46 ± 3,42 HCM (pg) 38,07 ± 3,27 31,44 ± 1,53 CHCM (%) 67,93 ± 6,21 66,03 ± 8,87 São apresentados as médias ± erros padrões. * p<0,05 Teste t de Student. Tabela 2 - Avaliação bioquímica de ratas Wistar tratadas do 1 ao 5 dia de gestação com extrato bruto de P. colorata e seu respectivo grupo controle. Ácido úrico (mg/dl) 5,42 0,49 5,18 0,27 Albumina (g/dl) 3,80 0,01 3,78 0,00 ALT (U/L) 115,69±2,75 109,70±1,75 AST (U/L) 113,13 3,40 106,27 1,80 Bilirrubina total (mg/dl) 8,27 0,77 6,36 0,46* Bilirrubina direta (mg/dl) 9,36 1,20 6,27 0,55* Bilirrubina indireta (mg/dl) 2,24 0,59 0,90 0,23* Colesterol (mg/dl) 110,18 4,54 113,91 5,68 Creatinina (mg/dl) 0,78 0,08 0,60 0,05 Fosfatase alcalina (U/L) 51,90 3,07 47,22 1,89 Glicose (mg/dl) 143,72 9,80 120,77 6,78 Proteína total (g/dl) 7,01 0,60 5,85 0,19 Triglicerídeos (mg/dl) 235,00 35,36 162,12 13,23 Ureia (mg/dl) 66,51 1,33 64,99 1,11 São apresentados as médias ± erros padrões.* p<0,05 Teste t de Student. Tabela 3- Peso relativo de órgãos de ratas Wistar tratadas do 1 ao 5 dia de gestação com extrato bruto de P. colorata e seu respectivo grupo controle. Encéfalo (%) 0,57± 0,02 0,57± 0,01 Timo (%) 0,18± 0,01 0,16± 0,01 Pulmão (%) 0,84± 0,08 0,80± 0,04 Coração (%) 0,27± 0,01 0,28± 0,01 Baço (%) 0,25± 0,01 0,26± 0,01 Fígado (%) 4,29± 0,10 4,25± 0,06 Rim direito (%) 0,32± 0,01 0,31± 0,01 Rim esquerdo (%) 0,30± 0,01 0,30± 0,01 São apresentados as médias ± erros padrões.* p<0,05 Teste t de Student.
Figura 1 Fotomicrografias de órgãos de ratas controle e tratadas com extrato bruto de P. colorata durante o período de pré-implantação embrionária. A: fígado controle; B: fígado experimental; C: rim controle; D: rim experimental; E: coração controle; F: coração experimental; G: pulmão controle; H: pulmão experimental. HE (40X). LITERATURA CITADA TOKARNIA C. H.; DÖBEREINER J. D.; PEIXOTO P. V. Poisonous plants affecting livestock in Brazil, Toxicon, Oxford, v. 40, p.1635-1660, Dec, 2002. COSTA, A. M. D.; MARUO, V. M. Plantas tóxicas de interesse pecuário nas microrregiões de Araguaína e Bico do Papagaio, Norte do Tocantins. 2009. 107f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal Tropical) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins, Araguaína, 2009. CAMPBELL, T. W. Hematologia de mamíferos: animais de laboratório e espécies variadas. In: THRALL, A. M.; BAKER, D. C.; CAMPBELL, T. W.; DENICOLA, D.; FETTMAN, M. J.; LASSEN, E. D.; REBAR, A.; WEISTER, G. Hematologia e bioquímica clínica Veterinária, São Paulo: Roca, 2007. p. 199-214. AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"