Novos Sistemas Terapêuticos
Vantagens dos novos sistemas terapêuticos Vectorização do p.a. Diminuição da dose Diminuição dos efeitos secundários
Vectorização Vectorização Passiva Vectorização Activa
Vectores Lipossomas Nanopartículas Nanoesferas Nanocápsulas
Nanopartículas sensíveis a campos magnéticos
Outras partículas
Vectores virais
Vectores de DNA
Terapia génica do sonho à realidade
Terapia génica Introdução de genes, em células de pacientes, de modo a permitir a modulação ou a correcção de uma doença.
Gene viral (infecção) Gene defeituoso Gene inexistente Subs. de genes defeituosos RNA m Inibição RNA m Proteínas virais Proteína Subs. proteína Inib. proteína Novo virus Manifestações patológicas Sintomas clínicos Tratamento sintomático
A promessa da terapia génica Cura da doença na sua origem, sem efeitos secundários Evita as limitações do uso de proteínas na prática clínica (baixa biodisponibilidade, fraca farmacocinética, elevados custos de fabrico)
Terapia Génica Breve História 1940 gene e DNA 1960 descoberta da estrutura do DNA 1972 1º splicing de DNA 1973 1º experiências de clonagem (Bayer & Cohen) 1975 isolamento de DNA Humano 1989- marcação genética 1993- Estudos de Imunoterapia anti-hiv Estudo de substituição de gene ADA
14 Setembro 1990 Ashanto Desilva 4 anos Imunodeficiência severa combinada Adenosina desaminase - função adequada do sistema autoimune Vulnerável a infecções TERAPIA GÈNICA - NIH Criança com vida normal - 15 anos
Realidade Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo celular Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de material genético Estável na corrente sanguínea Entrega eficiente do material genético às células
Mas Necessário o conhecimento profundo das doenças Descoberta do genoma humano - identificação de genes causadores de doenças ESTRATÉGIA ADEQUADA
Estratégia utilizadas em terapia génica somática O conceito original - substituição de genes defeituosos ou introdução de genes inexistentes Limitada a doenças causadas por um só gene Patologia Gene defeituoso ou inexistente Tecido/célula alvo Fibrose quística - CFTR (gene regulador da condutância transmembranar) Tracto respiratório Anemia de Fanconi (Complementação do grupo C) Células hematopoiéticas SCID (Adenosino desamoinase - ADA) Linfócitos
Estratégias utilizadas em terapia génica somática Uso de genes marcadores - inserção de genes não residentes - monitorização (linfócitos de infiltração tumoral, transplantes de medula ossea em doentes com leucemia); evolução de uma patologia (monitorizar o desenvolvimento de metástases) Utilização de genes terapêuticos Proteínas farmacológicas genes suicidas
Genes que codificam a expressão de proteínas farmacologicamente activas (citoquinas, hormonas ou enzimas deficitárias) IL-2 ou factor de necrose tumoral resposta imunológica a tumores Produção de insulina, factor de coagulação IX.. em órgãos não fisiológicos Produção sistémica de moléculas solúveis de CD4
Inserção de genes suicidas Terapia antiviral e antitumoral Inserção do gene codificador da cadeia A da toxina diftérica controlado pelo promotor do HIV-1 Timidina - quinase do vírus Herpes simplex (HSV-Tk) - permite a bifosfatação do ganciclovir com inibição da síntese do ADN Citosino-desaminase. Permite a conversão do 5-fluorcitosina em 5-fluoruracilo (activação dos genes suicidas depende de promotores específicos das células tumorais)
O uso de oligonucleótidos antisense Formação de estruturas do tipo triplex
O uso de oligonucleótidos antisense Por bloqueamento da acção dos pliceossomas Por ligação complementar do oligonucleótido antisense a uma fracção do ARN m
O uso de ribozimas Moléculas de ARN capases de promover a clivagem específica de outras moléculas de ARN Condicionantes subjacentes à aplicação da terapia génica Condicionantes genéticas Profundo conhecimento da doença Mecanismos de controlo da expressão génica Técnicas e processos que possibilitem o transporte e cedência intracelular de material genético
Transporte e cedência intracelular de material genético Propriedades fisico-químicas do material genético n Macromoléculas hidrofílicas n Elevado peso molecular n Carga superficial negativa n Alteração da biodisponibilidade (nucleases) n Internalização e tráfego intracelular n Translocação para o núcleo
Modificações químicas Propriedades fosfodiester metilfosfonato fosforotioato Estabilidade biológica -- +++ ++ O X H 3 C O NH Uptake celular + ++ +/- Eficácia de hibridização +++ + ++ O P O O N O Activação da RNase H +++ -- +++ Plasmídeos bacterianos {O - Fosfodiester X S - Fosforotioato CH3 - Metilfosfanato Injecção intramuscular Microinjecção directa Introdução forçada de partículas Electroporação Coprecipitação de partículas MAS
Vectores de tipo viral - aprender com a natureza LTR Gene terapêutico LTR Vector retroviral 1 Transdução do vector viral LTR gag pol env Vector construtor LTR pol psigag env 2 Formação de partículas virais Partículas virais recombinantes 3 Infecção das células alvo 4 Integração no ADN hospedeiro produto genético
Retrovírus: RNA transcriptase reversa DNA Falta de especificidade Tradução impossível em células que não se dividem Possibilidade de assumir a forma infecciosa Genes de pequenas dimensões Integração ao acaso pró-oncogenes
Adenovírus: ADN Infectam todas as células Mutagenese limitada e menor patogenicidade Transporte de material genético de grandes dimensões Expressão O transiente CASO DO PACIENTE 18 Imunogenicidade University of Pensylnani s - administração Institute for Human repetida Gene Therapy limitada Jesse Gelsinger 18 anos Ensaio clínico fase 1 Morte Adenovirus ornitina transcarbamilase Metabolização deficiente do nitrogénio existente nos alimentos Resposta do Sistema Imunitário ARDS - Síndrome de stress respiratório no adulto Privação de oxigénio - morte por asfixia
Vectores do tipo não viral Polímeros catiónicos Nanopartículas Lipossomas
Porquê transportadores positivos? Condensação do material genético por anulação das cargas positivas MAS Necessária libertação para ser activo
In vivo Cauda Administração de lipoplexos na veia da cauda Coração Sistema capilar do pulmão Coração Sistema capilar do coração Figado Orgão (tumores)
1ª Barreira - circulação sanguínea Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo celular Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de material genético Estável na corrente sanguínea Entrega eficiente do material genético às células
Distribuição dos lipoplexos na presença de PEG
Ligação específica
Terapia génica Estratégia terapêutica promissora para cura de doenças