Gabarito exercícios 2, 3 e 4

Gabarito exercícios 2, 3 e 4

Exercício 2 As curvas padrão abaixo foram construídas com os dados das tabelas 1, 2 e 3. DNS TGO FS abs 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,0027x + 0,0009 R 2 = 1 0 0 200 400 600 micrograma abs 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,022x + 0,0064 R 2 = 0,9997 0 0 10 20 30 40 50 micrograma abs 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,0212x + 0,0104 R 2 = 0,9993 0 0 20 40 60 80 micrograma

Nota-se na tabela 4 que apenas o método do fenol-sulfúrico (FS) detectou a presença de carboidratos nas amostras. As leituras dos demais métodos são variações em torno do zero (oscilações da leitura). Utilizando as leituras para FS e a curva padrão deste método (página anterior) foram feitos os seguintes cálculos: Usando a equação da curva padrão as absorbâncias foram convertidas em massa de carboidrato (coluna micrograma). Considerando que estas massas de carboidratos estavam presentes em 0,1 ml de amostra (ver coluna amostra na tabela 4), basta dividir a coluna micrograma por 0,1 ml e será obtida a concentração de carboidratos solúveis (coluna µg/µl) dos diferentes homogeneizados. Em seguida, sabendo que as amostras usadas nos testes haviam sido previamente diluídas, devemos multiplicar a coluna µg/µl pela coluna diluição e teremos a concentração de carboidratos solúveis dos homogeneizados originais (sem diluir). Sabendo que todos os homogeneizados tinham 10 ml, basta multiplicar a coluna mg/ml para obtermos a massa total (mg) de carboidratos nos homogeneizados. Em seguida, considerando que estes carboidratos foram obtidos a partir de diferentes massas de cana (coluna massa usada), fazendo a divisão teremos o rendimento de carboidrato por massa de cana (última coluna). Nota-se que a linhagem 7 é aquela de maior rendimento. Curva padrão / volume (0,1 ml) x diluição x 10 ml / massa = conc. s/diluir massa total (mg) massa (g) amostra abs micrograma µg/µl diluição mg/ml no sobrenad. usada mg/g 1 0,812 37,8 0,38 100 37,8 378,1 10 37,8 2 1,525 71,4 0,71 20 14,3 142,9 5 28,6 3 1,21 56,6 0,57 30 17,0 169,8 7 24,3 4 0,994 46,4 0,46 5 2,3 23,2 2 11,6 5 0,853 39,7 0,40 200 79,5 794,9 25 31,8 6 1,112 52,0 0,52 100 52,0 519,6 12 43,3 7 1,215 56,8 0,57 100 56,8 568,2 8 71,0 8 1,336 62,5 0,63 100 62,5 625,3 10 62,5 9 1,201 56,2 0,56 15 8,4 84,2 4 21,1 10 1,487 69,7 0,70 2 1,4 13,9 1 13,9 açucar sol./ massa de cana

Respondendo resumidamente as questões. O melhor método para avaliar a concentração de carboidratos (sacarose) no homogeneizado de caule de cana é o fenolsulfúrico (FS). O método de DNS nada detecta, pois a amostra não contém carboidratos redutores, enquanto que o método de glicose-oxidase (TGO) também é ineficiente porque a amostra não contém glicose. As concentrações de carboidratos são apresentadas na página anterior. A linhagem 7 é aquela mais indicada para produção de sacarose, pois apresentou o maior rendimento (g de carboidrato/massa de caule de cana). Questão 3 A medida de atividade enzimática depende da detecção da formação de produtos ou consumo de substrato de uma reação. Considerando que a reação em questão é a hidrólise de sacarose levando à formação de glicose e frutose, podemos afirmar que o método de glicose-oxidase (TGO) é apropriado, pois detecta a formação de um dos produtos, glicose. O método de DNS também é apropriado, pois os produtos formados são açucares redutores, enquanto que o substrato não. Assim, percebe-se com este método exclusivamente a formação de produtos. O método FS não é apropriado, pois detecta tanto o substrato como os produtos da reação. Logo, seria difícil perceber variações na absorbância pelo consumo de S ou formação de P, devido à mútua interferência.

Exercício 4 - As absorbâncias (420 nm) foram convertidas em nanomols (s) usando a curva padrão presente na apostila de aulas práticas (experimento 4). Considerando estas quantidades de produto (p-nitrofenolato) e os tempos de incubação foi montada a tabela abaixo para cada linhagem de levedura (A até F) e então a partir dela foram construídos os gráficos ( x ). As inclinações das retas obtidas representa a velocidade da reação de hidrólise do p-nitrofenil alfaglicosídeo e será usada para calculo da concentração de atividade de alfa-glicosidase no lisado de cada linhagem de levedura. a b c d e f 15 6,6 11,5 39,4 14,8 0,0 10,7 30 14,8 24,6 80,4 31,2 1,7 23,0 45 23,0 37,8 121,4 47,6 3,3 35,3 60 31,2 50,9 162,3 64,0 5,0 47,6 35.0 3 25.0 2 15.0 1 5.0 y = 0.5464x - 1.5902 R² = 1 6 y = 0.8743x - 1.5902 5 R² = 1 4 3 2 1 A B C 18 16 14 12 10 8 6 4 2 y = 2.7322x - 1.5902 R² = 1 7y = 1.0929x - 1.5902 6 R² = 1 5 4 3 2 1 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 y = 0.1093x - 1.5902 R² = 1 D E F y = 0.8197x - 1.5902 5 R² = 1 45.0 4 35.0 3 25.0 2 15.0 1 5.0

Incialmente devemos lembrar que 1 U de atividade enzimática corresponde a formação de 1 micromol de produto/. Portanto, considerando que as velocidades foram registradas em nanomol de produto por uto, então esta velocidade corresponderia à miliunidades (mu). A seguir, considerando que a quantidade de alfa-glicosidase no ensaio (mu) foi adicionada no lisado diluído, basta dividir a coluna mu pela coluna volume de lisado (vol; ml), para obtermos a concentração de alfa-glicosidase no ensaio (coluna mu/ml). Lembrando que o lisado foi diluído antes de ser adicionado nos tubos de ensaio, devemos multiplicar a coluna um/ml para obter a concentração de alfa-glicosidase no lisado original (sem diluir). Este resultado está na coluna conc. At. Enz. em azul. Sabendo que os lisados de todas as linhagens tem 10 ml, basta multiplicar a coluna conc. At. Enz. para obter a atividade total de alfa-glicosidase em cada lisado, ou seja, o número total de mu de alfa-glicosidase em cada lisado (coluna ativ. Total ). Finalmente sabendo que todos os lisados foram preparados com 1g de levedura, basta dividir a coluna ativ. Total por 1 e obtemos o rendimento de mu de alfa-glicosidase por grama de levedura para cada linhagem. Caso não seja necessário purificar a alfa-glicosidase, a linhagem B (em amarelo) seria a mais produtiva e portanto mais interessante para produção desta enzima. igual x 10 / 1 dividir mu conc. At.enz. ativ. Total igual / mu/ml vol (ml) diluição s/ diluir mu/ml no lisado mu/g a 0,54 5,4 0,1 100 540 5400 5400 b 0,87 43,5 0,02 50 2175 21750 21750 c 2,73 54,6 0,05 8 436,8 4368 4368 d 1,08 5,4 0,2 70 378 3780 3780 e 0,1 0,5 0,2 500 250 2500 2500 f 0,81 4,05 0,2 200 810 8100 8100 x

Curva padrão de proteínas 0 0,01 2 0,08 4 0,16 6 0,24 8 0,32 10 0,4 A partir da terceira tabela do exercício 4 é possível preparar uma curva padrão para a detecção de proteínas com o reagente de Bradford (microgramas de proteína padrão versus absorbância em 595 nm). Esta curva padrão será usada para calcular a concentração de proteína total no lisado de cada uma das linhagens de levedura. 12 0,48 14 0,56 16 0,64 18 0,72 20 0,8 abs 595nm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,0398x + 0,0032 R 2 = 0,9999 0 5 10 15 20 25 m icrogram as

Usando os dados de absorbância em 595 nm presentes na segunda tabela do exercício 4 é possível fazer os cálculos abaixo. Considerando a equação da curva padrão (ver página anterior) as abs595 são convertidas em microgramas de proteína total (coluna µg/tb). Esta massa de proteína encontrada em cada tubo (tb) foi ali adicionada na pipetagem do lisado. Logo, dividindo a coluna µg/tb pelo volume de lisado usado (coluna vol; µl) temos a concentração de proteína total no lisado diluído que foi usado nos testes. Posteriormente, lembrando que o lisado havia sido diluído, basta multiplicar a coluna mg/ml ) pela coluna diluição e teremos a concentração de proteínas totais no lisado sem diluir (coluna sem diluir mg/ml ). Por fim, dividindo a coluna conc. At. Enz. mu/ml sem diluir (ver duas páginas atrás) pela coluna sem diluir mg/ml, teremos a atividade específica de alfa-glicosidase no lisado de cada linhagem de levedura (coluna ativ. Espec.; mu/mg). Lembrando que a atividade específica é um indicador da riqueza de um material em uma deterada enzima, podemos assumir que o lisado da linhagem D é aquele que contém mais alfa-glicosidase por massa de proteína total. Assim, este lisado teria uma maior quantidade de alfa-glicosidase frente às proteínas contaantes e seria mais fácil a purificação desta enzima a partir deste lisado. Curva padrão diluído sem diluir ativ. Espec. linhagem abs595 vol (µl) diluição µg/tb mg/ml mg/ml mu/mg a 0,265 100 20 6,6 0,066 1,32 410,47 b 0,32 20 50 8,0 0,398 19,90 109,30 c 0,55 50 10 13,7 0,275 2,75 158,97 d 0,105 80 20 2,6 0,032 0,64 591,14 e 0,75 10 5 18,8 1,876 9,38 26,65 f 0,415 100 80 10,3 0,103 8,28 97,86 Dividir por vol multiplicar por diluição