13 de setembro de 2013 -UERJ Biorremediação de ambientes contaminados por petróleo e derivados Alexandre Soares Rosado Unidade de Ecologia microbiana e biotecnologia do Petróleo do polo de Biotecnologia BIOINOVAR - UFRJ
Origem do Petróleo O petróleo é originado de grandes deposições fósseis, é uma mistura bastante complexa de compostos orgânicos e com um alto conteúdo de energia. Rocha geradora
Tipos de hidrocarbonetos encontrados no Petróleo) Fração saturada Parafinas ( n-alcanos, alcanos ramificados) e Naftenos ( cicloalcanos) Fração insaturada (aromáticos, oleofinas, diolefinas e acetilênicos) Compostos não hidrocarbônicos, como os ácidos naftênicos e sulfurados
Toxicidade Os efeitos tóxicos imediatos Moléculas de baixa massa molecular Os efeitos crônicos da poluição com petróleo são pouco conhecidos. Moléculas de alta massa molecular
Diminuição da diversidade de espécies Efeitos carcinogênicos e citogenéticos de longo prazo
Petróleo A principal fonte de energia do planeta, de distribuíção não homogênea entre os países e um recurso não-renovável A sociedade atual é extremamente dependente da utilização de petróleo para o seu desenvolvimento.
Petróleo O Petróleo se tornou provavelmente a mais importante substância negociada entre países e corporações levando a guerras, massacres e extermínios. Crise do petróleo na década de 1970 A Primeira Guerra do Golfo Diferentes guerras entre os países árabes, inclusive a Guerra Irã-Iraque A luta pela independência da Chechênia Guerra Iraque-Estados Unidos (Invasão do Iraque)
FONTES DE POLUIÇÃO DE HIDROCARBONETOS NO MAR Esgoto Industrial e Urbano 62% Navios não Petroleiros 15% Fonte Natural 10% Operação de Petroleiros 7% Acidentes com Petroleiros 3% Exploração & Produção 2% Terminais / Refinarias 1%
Biodegradação Utilização de hidrocarbonetos por microrganismos: ZoBell, 1946, observou a capacidade degradativa de bactérias pertencentes a 30 gêneros Ampla distribuição na natureza. Utilização dependente da natureza química e das condições ambientais.
HIDROCARBONETOS O 2 O 2 Ataque inicial por oxigenases Degradação por vias periféricas PO 4 3- SO 4 2- Ciclo TCA Fe 3+ NH 4 = O 2 CO 2 H 2 O Biomassa celular Multiplicação
http://earthstar2000.com/ebay/microtube.jpg http://www.miamisci.org/microbes/images/soil-bacteria.gif http://www.umcpegypt.umd.edu/img/dna2.jpg http://archive.globe.gov/sda/tg97/soil/img/big/forest_soil.jpg http://plantbio.berkeley.edu/~volkman/courses/dendrogram.gif http://www.santarosa.edu/lifesciences/ensatree.gif http://www.bio.ic.ac.uk/research/rhac/gel020706-3.gif http://www.stanford.edu/group/cfrl/chromatogram.jpg DIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA MICROBIANA PROMOVENDO SUSTENTABILIDADE
O que procuramos? Estudos sobre a diversidade e Bioprospecção microbiana Uso de Tecnologias Limpas Aplicação de ações que levem ao desenvolvimento sustentável
Estratégias de Remediação Quantidade do contaminante Características do ambiente Seleção Tecnologias mais Melhor relação custo-benefício Tempo de tratamento adequadas
Processo Promissor Biorremediação Aceitação Agências Reguladoras Opinião pública FORMA NATURAL DE TRATAMENTO
Custos de técnicas de remediação Países (11) da CEE Técnica de remediação Euro/m 3 Incineração Ex-situ 785 Aterro Ex-situ 231 Lavagem/Trat. térm. 226-229 Fitorremediação 122 (22-222) Imobilização In/Ex-Situ 112-139 Air Sparging/Bomb. Trat. 91-71 Biorremediação-Landfarming 62-73 Muros reativos/de contenção 50-55 Atenuação natural monitorada 20 Fonte: www.cordis.lu (junho, 2006)
TÉCNICAS DE TRATAMENTO BIOLÓGICO Bioestimulação Correção de fatores e/ou adição de nutrientes específicos para garantir a quantidade e a qualidade da microbiota nativa Bioaumento Adição de linhagens microbianas compatíveis com o local contaminado
EMM
Também conhecidos como florestas de mangue ou simplesmente mangues, estes ecossistemas costeiros, situam-se na faixa tropical e subtropical do mundo. No Brasil, estes ambientes distribuem-se ao longo da costa desde o Estado do Amapá até Santa Catarina, perfazendo uma área total de 25.000 Km2 (Vergara-Filho, 1993). Manguezais no Brasil:
Avaliação de diferentes estratégias para biorremediação de manguezais I. Avaliação Pré-tratamento II. Experimento de microcosmo III. Experimento Piloto
Amostra de manguezal Análise físico-química Análise da profundidade de penetração do óleo e potencial Redox Análise textural Análise microbiológica Etapa I Técnicas convencionais Isolamento e Contagem de Rizosfera e sedimentos Técnicas Moleculares Rizosfera e sedimentos Caracterização dos isolados e Potencial de biodegradação Perfil genético da comunidade microbiana (PCR/DGGE) Biblioteca de clones Seleção dos isolados degradadores
Etapa II Planejamento fatorial Microcosmos Sem a planta Com a planta
Etapa III Experimento Piloto Químico (TPH, óleo residual) Monitoramento Físico químico Toxicológico Ecológico
Diagnóstico do ambiente Portão 3m 3m 3m Efluente Amostra composta controle 1 Amostra composta controle 2 Amostra composta controle 3
120 100 80 60 Gama proteobacteria alpha proteobacteria delta proteobacteria beta proteobacteria 40 20 0 Gama proteobacteria alpha proteobacteria delta proteobacteria beta proteobacteria
c a d b Bacteria (a); Pseudomonas (b); Actinobacteria (c); Betaproteobacteria (d) and; Alphaproteobacteria (e). O manguezal é representado por nove pontos (1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C) e o manguezal de referência é representado pela sigla cab. S e R indicam amostras de sedimento ou rizosfera, respectivamente. e
log CFU/ml log CFU/ml
Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de óleo Amostras Contagem (NMP de mo. Deg.de óleo/ 100mL) R ctr 23 X 10 2 R3A 43 X 10 2 R3B 24 X 10 3 R3C 21 X 10 3 R2A 23 X 10 2 R2B 23 X 10 2 R2C 93 X 10 2 R1A 23 X 10 2 R1B < 3 X 10 2 R1C 15 X 10 2 S ctr < 3 X 10 2 S1 comp. 4 X 10 2 S2 comp. 9 X 10 2 S3 comp. 2,3 X 10 3 1 2 3 4 A B C D E F
Produção de Biossurfactantes
Inoculação das estirpes degradadoras em meio BH líquido acrescido de óleo a 0,1% para acompanhamento do perfil de degradação.
Compostos alvo (µg/l, Controle Estirpe R1C -2A % de degradação n C10 ppb) 825,02 21,09 97,44 n C11 1186,84 5,6 99,52 n C12 1401,15 3,25 99,77 n C13 1954,97 40,58 97,92 n C14 2211,94 47,21 97,86 n C15 2471,63 3,1 99,88 n C16 2452,62 1,68 99,93 n C17 3220,89 28,75 99,1 n C18 1961,78 50,58 97,42 n C19 1631,63 1,1 99,93 n C20 1440,83 1,6 99,99 n C21 1388,57 5,61 99,59 n C22 1193,70 8,05 99,32 n C23 1123,38 10,74 99,04 n C24 1046,75 18,62 98,22 n C25 1040,54 2,42 99,77 n C26 849,03 31,54 96,28 n C27 783,62 2,45 99,7 n C28 550,06 16,09 97,07 n C29 480,66 15,37 96,8 n C30 376,32 18,83 95 n C31 526,44 31,52 94 n C32 383,55 27,80 92,75 n C33 288,29 22,84 92,07 n C34 185,65 12,67 93,17 n C35 144,77 9,72 93,28 n C36 114,29 14,40 87,4 Total 333.521,8 1.287,56 99,61
Montagem do Consórcio Utilização de bomba peristáltica para formação de células em grânulos
Microcosmos
Montagem do Experimento de campo Produção e plantio das mudas
Montagem do Experimento de campo
Experimento de biorremediação Campo e Viveiro Crescimento Vegetal
Fisiologia Vegetal Taxa de atividade fotossintética das mudas no viveiro e no manguezal
Produção de pigmentos pelas mudas no viveiro e no campo
Taxa de atividade fotossintética das mudas do campo e no viveiro submetidas aos diferentes tratamentos de biorremediação
Análise de teores de nutrientes em amostras foliares
Análises microbiológicas Sedimento Campo -9 meses após inoculação
Análises microbiológicas Rizosfera Campo Antes da inoculação e 3 meses após inoculação L. racemosa
Análises microbiológicas Rizosfera Viveiro 3 meses após inoculação L. racemosa
Análises microbiológicas Rizosfera Campo 6 meses após inoculação R. mangle
Conclusões, Considerações finais e Recomendações O projeto intitulado Avaliação de diferentes estratégias para biorremediação de manguezais contribuiu de maneira bastante abrangente para guiar futuros estudos de biorremediação de manguezais. Além de ter contribuído com um extenso levantamento acerca da diversidade microbiana de um manguezal brasileiro, esse trabalho pioneiro, utilizou pela primeira vez diferentes estratégias de biorremediação in situ em manguezal brasileiro e técnicas moleculares de monitoramento microbiano.
Esse é o primeiro estudo a realizar esse tipo de mapeamento e correlação entre a diversidade microbiana (utilizando-se métodos convencionais e moleculares) e a estrutura heterogênea química de manguezais, demonstrando que essa diversidade corresponde às variações químicas de diferentes nichos dentro de um mesmo ambiente. DNA Barcoding Indicadores de qualidade
Montagem do consórcio bacteriano de degradação de óleo a ser aplicado nos experimentos de biorremediação Nesse ponto, a equipe se deparou com um dos desafios desse projeto; Montar uma estratégia que permitisse a manutenção do consórcio microbiano e do fertilizante (Bioestímulo) em campo ao longo do tempo, sem que houvesse uma lavagem desses inóculos devido à ação da maré. Solução encontrada-fertilizantes: Fertilizantes de liberação lenta, enterrados no sedimento contido
Solução desenvolvida Consórcio: As bactérias do consórcio foram encapsuladas em uma matriz que além de permitir a manutenção física das bactérias no campo, permitiu ainda a liberação desses organismos gradativamente.
Dessa forma, desenvolvemos e utilizamos uma estratégia utilizando os microrganismos e fertilizantes associados às mudas do replantio, garantindo não apenas a manutenção dos inóculos em campo como ainda o estabelecimento desses nas rizosferas das mudas. Assim, além da aplicação na degradação do óleo no sedimento, as próprias mudas puderam utilizar esses inóculos, que por sua vez permitiram um melhor e mais rápido desenvolvimento das plantas.
Segundo obstáculo A grande heterogeneidade da distribuição do óleo em manguezais (não permite uma avaliação clara dos resultados das análises de HTP e HPA) Nossa recomendação é que em estudos de biorremediação de manguezais outros parâmetros sejam levados em conta para avaliar a recuperação do ambiente, entre eles, o uso de indicadores biológicos de recuperação como a diversidade microbiana e as respostas vegetais.
Microrganismos já são propostos na literatura como excelentes indicadores de alterações e recuperação ambiental; Quanto aos vegetais, eles são uma das bases do ecossistema manguezal. Dessa forma, havendo recuperação das espécies vegetais em manguezais, outros organismos tendem a retornar a esse ambiente e todo o ecossistema tende a se reestruturar e recuperar.
O monitoramento microbiológico e do desenvolvimento de plantas revelou o eficiente estabelecimento dos inóculos através da observação das alterações dos perfis microbianos de áreas sob diferentes tratamentos (microrganismos indicadores de alterações, no caso, dos tipos de tratamento estabelecidos); O tratamento de Bioestímulo + Bioaumento proporcionou melhor desenvolvimento das espécies vegetais (tanto L. racemosa quanto R. mangle).
EMM Resultado... Estimulo no crescimento das plantas, degradação de hidrocarbonetos, manutenção da microbiota nativa = Recuperação do ambiente sem causar impactos secundários
Exploring our microbial collection potential
Agradecimentos: Raquel Peixoto, Norma Rumjanek, Andrew Macrae, Heitor Coutinho asrosado@micro.ufrj.br Flavia Freitas, Gina Vasques, Staffan Kjellberg Fábio Mota & Lucy Seldin Petrobras Embrapa CNPq