UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ Departamento de Biologia Celular e Genética Biologia Molecular Tópicos de estudo Prof a Dr a Maria Aparecida Fernandez 2003 1
Unidade I Estrutura dos Ácidos Nucléicos Estrutura primária do DNA. - Nucleosídeos e Nucleotídeos. Dupla hélice do DNA. RNA Tipos: hnrna; snrna; mrna; rrna; trna 2
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Prática I - Extração de DNA bacteriano Nesta atividade o objetivo é extrair DNA cromossômico da bactéria E. coli, e discutir os procedimentos necessários para a extração de ácidos nucléicos dos mais variados materiais biológicos. Introdução A preparação do DNA de qualquer tipo celular envolve os mesmos procedimentos básicos, que são: 1) lisar inicialmente as células e se necessário o núcleo (este pode ser lisado em etapas posteriores); 2) remover proteínas e outros fragmentos de material do DNA; 3) realizar uma purificação final; 4) precipitar o DNA; 5) resuspender em solução tampão e/ou outro meio aquoso requerido. A substância utilizada para lisar as células e núcleos são os detergentes, já que as membranas são compostas de proteínas e lipídeos. Tratamento adicional pode ser requerido quando da extração do DNA de células vegetais e mesmo de bactérias, onde enzimas específicas são utilizadas para a digestão de paredes celulares, ou mesmo a trituração e/ou homogeneização de tecidos e/ou organismos podem ser necessárias. Após a lise, o próximo passo necessário é a purificação, com a remoção de proteínas dos ácidos nucléicos. Os métodos mais comuns envolvem a digestão com proteases e a extração com solventes orgânicos como o fenol. Após a purificação o DNA pode ser precipitado em etanol, já que o mesmo é insolúvel nessa substância. O procedimento que irão realizar proporciona a obtenção de um DNA impuro, mas a visualização da massa de DNA cromossômico bacteriano é bastante ilustrativa. Procedimento - Agitar o tubo com 2 ml de uma cultura de E. coli gentilmente por rotação vertival para que as células que estiverem depositadas no fundo do tubo sejam ressuspendidas; - adicionar 0,2 ml de uma solução de SDS 10% (dodecil sulfato de sódio) ou 1,5 ml de uma solução de detergente comercial a 50%; - misturar o conteúdo até que fique homogêneo; 4
- incubar o tubo em banho-maria à uma temperatura entre 60 a 70 0 C por 15 minutos; - resfrie o tubo em banho de gelo; - gotejar lentamente 3-6 ml de etanol 95%; atenção o etanol não deve ser misturado na solução e sim formar uma nova fase, sendo que na interface deverá ser observado o DNA precipitado. Meios de crescimento para bactérias L.B. (Luria-Bertani) Para um litro: Tryptona...10 g Extrato de Levedo...5 g NaCl...10g Para meio sólido adicionar: Agar...10g/L Ajustar o ph para 7 com NaOH. Ajustar o volume da solução para um litro com água deionizada. Esterilize em autoclave por 20 min T.B. (Terrific Brotn) Para um litro: Tryptona...12 g Extrato de Levedo...24g Glicerol...4mL Agitar até que o soluto tenha dissolvido e esterilizar em autoclave por 20 min. Para cada 900 ml, para o uso do meio adiciona-se 10 ml de KH 2 PO 4 0,72M. Para preparar a solução acima adicionar 2,31 g de KH 2 PO 4 e 12,54 g de K 2 HPO 4 em 90mL de água deionizada, ajustar o volume para 100 ml. Esterilizar a solução em autoclave por 20 min. 5
Unidade II Organização gênica de procariotos Cromossomo de E. coli. - Organização dos genes em operons. - Coorientação da transcrição e da replicação dos genes. - Posicionamento dos genes evolutivamente relacionados em sítios diametralmente opostos do mapa genético circular. - Localização preferencial dos genes em sítios próximos à origem de replicação. Atividade prática: texto página 125 e 126 6
Plasmídeos. - Classificação. - Funções codificadas por plasmídeos. Cosmídeos. - Organização. 7
Bacteriófagos. - Ciclo lítico. - Ciclo lisogênico. - Transdução. Cápsula Cromossomo viral Fago T4 Proteína OmpC Ciclo lítico/lisogênico profago Membrana externa E.coli cabeça DNA viral cauda Fibras da cauda contração Centro da cauda 112 nm 225 nm 8
Organização gênica de eucariotos Tamanho dos genomas eucarióticos. Diferentes classes de seqüências presentes em genomas eucarióticos. - DNA não repetitivo. - DNA repetitivo: Genes estruturais que fazem parte do DNA repetitivo; Amplificação gênica; Genes interrompidos; Famílias de genes; Genomas de organelas. 9
Prática II - Eletroforese de ácidos nucléicos Moléculas e fragmentos de DNA e RNA podem ser separadas em um campo elétrico utilizando como suporte géis de agarose ou de poliacrilamida. A migração dessas moléculas é inversamente proporcional ao logaritmo de seu tamanho, isto é, moléculas grandes migram menos que moléculas pequenas e o seu comportamento, através dos diferentes géis, é influenciado por: a) concentração e tipo de gel. Por exemplo, o gel de agarose a 0,9% é usado para separar moléculas de 0,5 a 7kb, enquanto gel à 8% de poliacrilamida, que apresenta matriz altamente organizada e porosidade fina, é utilizado para separar fragmentos de 0,1 a 3 kb; b) conformação do ácido nuclêico a ser separado. DNA dupla fita, em solução, geralmente está presente em três diferentes conformações, com mobilidades relativas decrescentes: - DNA circulares covalentemente fechados superenrolados; - DNAs lineares; - DNAs circulares abertos devido à clivagem em uma de suas fitas; c) força do campo elétrico; d) temperatura; e) ph do tampão do gel. As bandas de DNA em gel de agarose e/ou poliacrilamida podem ser visualizadas à luz ultravioleta* após coloração com brometo de etídeo*, agente intercalante que, quando excitado com luz ultravioleta, emite luz no comprimento do visível, o que nos possibilita localizar os diferentes fragmentos no gel. As moléculas de RNA devem ser separadas em gel de agarose em condições desnaturantes (uréia e formamida) para que essas moléculas percam a sua forma tridimensional, com a qual a sua migração seria totalmente dependente de sua estrutura e não de seu tamanho. *Atenção especial deve ser tomada quando da visualização do gel com a luz ultravioleta, pois a mesma é nociva para a retina podendo cegar uma pessoa. Só devemos visualizar protegidos com anteparo de acrílico ou capacetes e/ou óculos especiais. O brometo de etídeo é tido como agente carcinogênico e por isso devemos manipular a solução e géis corados somente com luvas de proteção. Prática Um gel de agarose à 0,7% será realizado com tampão TBE (tris-ácido bórico 89 mm, ph 8,3 e 2 mm de EDTA) 10
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Unidade III Técnicas de DNA recombinante A - Enzimas de restrição / construção de um mapa de restrição Sistema de proteção por metilação. Seqüências de reconhecimento. Nomenclatura. Como as enzimas cortam as cadeias de DNA. - Extremidades coesivas e abruptas. Prática: textos página 134,135 e 289 / Textos: páginas 136-139 e 291 e 293 Endonucleases de restrição Gênero EcoRI Espécie Ordem de descoberta Linhagem Enzima Organismo Sequência b AluI Arthrobacter luteus 5 AG CT BamHI Bacillus amyloliquefasciens H 5 G GATCC HaeIII Haemophilus aegyptius 5 GG CC HindIII Haemophilus influenzae Rd 5 A AGCTT b O sítio de clivagem é apresentado para apenas uma das fitas e no sentido 5 3. A, Adenina; C, Citosina; T, Timina e G, Guanina. 12
B - Vetores de clonagem Características ideais de vetores. Plasmídeos. Plasmídeos mais utilizados na clonagem molecular. - pbr322; puc19 Bacteriófagos utilizados no desenvolvimento de vetores. - bacteriófago λ. - bacteriófago M13. Vetores de expressão Vetores de expressão procarióticos. Vetores de expressão eucarióticos. Prática: textos páginas 149-151 13
C - Bibliotecas de DNA recombinante Bibliotecas genômicas. Bibliotecas de cdna. Diferenças entre clones genômicos e clones de cdna. 14
D - Técnicas de hibridação Desnaturação e renaturação. Tm ( C) = 69,3 + 0,41 (GC%) C = 1 C o 1+K 2 C o t 15
Técnicas de hibridação molecular Hibridação em colônia. Southern blot. Northern blot. l HindIIIa b c d e f g h i l HindIII a b c d e f g h i pb 23130 9416 6557 4361 2322 2027 A B 28S Prática: Textos páginas 152-156 e páginas 299; 301; 303 e 305 16
E - Hibridação in situ Princípios gerais. Tipos de amostras e alvos. Fixação e permeabilidade à sonda. Tipos de sondas. Marcação e detecção da sonda. Condições de hibridação. 17
F - Técnicas especiais amplificação Reação de Polimerização em Cadeia PCR Conceito. Otimização do método. Prática: texto páginas 162-165 DESNATURAÇÃO 94 C AC GT T GCA ACG T C CGT G C T GCAG ANELAMENTO 30-65 C G GCA AC GT ACG T T G CA CCGT T GC C A T GC C A GGCA C CGT EXTENSÃO 65-75 C GGCA C CG T ACG T T GCAG C G GCA GGC A C CGT 1 CICLO AMPLIFICAÇÃO 2 CICLO... 18
G - Técnicas especiais Seqüência Seqüenciamento de DNA Método de Sanger. Método de Maxam e Gilbert. Prática: páginas 157-161 e 307 19