UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO CONSELHO DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PATRICIA NANCY ISER BEM

UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO CONSELHO DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PATRICIA NANCY ISER BEM MODULAÇÃO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO EM CÉLULAS JURKAT (LINFÓCITOS T HUMANOS) POR ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 E ESFINGOLIPÍDIOS São Paulo-SP 2010

PATRICIA NANCY ISER BEM MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA MODULAÇÃO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO EM CÉLULAS JURKAT (LINFÓCITOS T HUMANOS) POR ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 E ESFINGOLIPÍDIOS Dissertação apresentada, ao Programa de Mestrado Profissional em Farmácia da Universidade Bandeirante de São Paulo, como requisito para obtenção do título de MESTRE. Orientadora: Profª Dra Renata Gorjão. Celular Área de concentração: Farmacologia São Paulo-SP 2010

Iser Bem, Patricia Nancy Modulação das Vias de Sinalização em Células Jurkat (Linfócitos T Humanos) por Ácidos Graxos Ômega-3 e Esfingolipídios/ Patricia Nancy Iser Bem. São Paulo: [s.n.], 2010. 84 f.: il.; 30 cm. Dissertação de Mestrado Profissional Universidade Bandeirante Brasil, Mestrado Profissional em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Orientadora: Profª. Dra. Renata Gorjão 1. Sinalização celular 2. Linfócitos 3. DHA 4. EPA. 5. Ceramidas

PATRICIA NANCY ISER BEM MODULAÇÃO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO EM CÉLULAS JURKAT (LINFÓCITOS T HUMANOS) POR ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3 E ESFINGOLIPÍDIOS DISSERTAÇÃO APRESENTADA À UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO, COMO EXIGÊNCIA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO NO MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA Presidente e Orientador Nome: Titulação: Instituição: Assinatura: 2ª Examinador Nome: Titulação: Instituição: Assinatura: 3ª Examinador Nome: Titulação: Instituição: Assinatura: NOTA FINAL: Biblioteca Bibliotecário: Assinatura: Data: / / São Paulo, de de 20

A Deus, por ter me apresentado o fascinante mundo da ciência, a Ti seja dada toda Honra e toda Glória.

Aos grandes amores de minha vida, a minha filha Nathalia e ao meu amado esposo Daniel, Mel e Trigo de minha existência, obrigada pela paciência e por acreditarem em mim.

À minha amorosa gata Lola, por me tirar da realidade e me levar por alguns instantes ao seu mundo felino.

Á minha querida orientadora e Amiga Renata Gorjão, muito obrigada pelo conhecimento e sabedoria a mim transmitidos. Meus sinceros agradecimentos pela paciência e carinho em sua arte de ensinar, mesmo quando eu fazia a MESMA pergunta pela DÉCIMA VEZ.

À minha querida amiga e Filósofa Doutora Vera Lúcia Conceição Vassouras, para mim a eterna tia Vera, por ter mesmo que de longe em nossa triste infância, cuidado de nós e por nos ter tirado por alguns instantes da nossa triste realidade. Meus sinceros agradecimentos pelos conselhos e pelas orientações a mim destinados.

AGRADECIMENTOS A aluna de iniciação científica Fernanda Velame de Oliveira pela contribuição parcial destes resultados. A minha querida amiga Alessandra Fagioli pelo incentivo. Ao meu querido sobrinho Enzo que chegou a minha vida em um momento muito especial. Aos meus amigos tão especiais Joelmir Lucena Veiga (Joe) e Verônica Rennò pelo incentivo e dicas sobre sinalização. A minha querida amiga Andréa Ap. Moraes pelas orientações e dicas. À Profª Dra. Tânia pelo espaço e equipamentos de seu laboratório. Ao Profº Dr. Rui Curi pelo espaço e equipamentos no Laboratório de Fisiologia Celular do ICB/USP. À Profª Dra Silvana Bordin por ceder alíquotas dos primers para PCR. Aos técnicos e colaboradores da Uniban Cristina e Roberto por sempre nos atender tão prontamente. Aos técnicos do laboratório de Fisiologia Celular do ICB/USP Tatiana Alba Loureiro, Érica Portioli e José Roberto Mendonça. À Adriana Lambertucci pela ajuda nos experimentos de western blotting.

O amor de Deus é infinito! É poderoso demais. Minha compreensão, muitas vezes, é pequena para entender os desígnios do Senhor. Más para quem tem fé ou, para quem quer Acreditar no Amor Deus, Ele mostra, Ele age, Ele intervém. Para os que crêem no Amor e na verdade Tudo é um milagre Divino, Tudo tem sentido

RESUMO BEM, P.N.I Modulação das Vias de Sinalização em Células Jurkat (Linfócitos T Humanos) por Ácidos Graxos Ômega-3 e Esfingolipídios 2010 84f. Dissertação de Mestrado-Programa de Mestrado Profissional em Farmácia, Universidade Bandeirante de São Paulo, São Paulo, 2010. Os ácidos graxos ômega-3 podem modular a função de leucócitos, como a produção de citocinas, a fagocitose por macrófagos e a proliferação de linfócitos. Os efeitos positivos da suplementação com ácidos graxos ômega-3 estão relacionados aos efeitos imunossupressores nas doenças auto-imunes e inflamatórias, tais como a psoríase, artrite reumatóide e asma. Neste estudo nós avaliamos se o efeito inibitório dos ácidos docosa-hexaenóico (DHA, C22: 6 n-3) e eicosapentaenóico (EPA, C20: 5 n-3) na proliferação de linfócitos estão relacionados à síntese de ceramida pela via de novo. A toxicidade de DHA e de EPA na presença de 10 µm de fumonisina B1 (FB1) em células Jurkat (linhagem de células T leucêmicas) foi determinada por citometria de fluxo. O efeito destes compostos na proliferação de linfócitos foi avaliado pela incorporação de [2-14 C]-Timidina. Posteriormente, nós analisamos o efeito de EPA e DHA na fosforilação das proteínas relacionadas à proliferação de linfócitos (JAK1, Akt e p42/44) na presença e na ausência de FB1. DHA inibiu a proliferação das células Jurkat quando adicionado ao meio em concentrações acima de 25 µm enquanto EPA inibiu já em 12,5 µm. Este efeito, entretanto, foi revertido na presença de FB1. DHA e EPA promoveram um aumento na fragmentação do DNA acima de 25 µm. Na presença de FB1, estes valores foram semelhantes ao controle (sem tratamento) em todas as concentrações. DHA e EPA promoveram uma diminuição da fosforilação de JAK1, p42/44 e de Akt. No entanto, na presença de FB1 este efeito foi revertido. Conseqüentemente, a expressão do gene pró-apoptótico bax foi aumentada por DHA e EPA e a expressão de bcl-2 e do bcl-xl, genes antiapoptóticos, foi diminuída. Na presença de FB1 todos estes efeitos foram

revertidos. Em conclusão, os efeitos inibitórios de DHA e EPA na proliferação de células Jurkat envolvem a via de novo de síntese de ceramida que conduz a uma diminuição da fosforilação de JAK 1, p42/44 e de Akt. Palavras-chave: Sinalização celular, linfócitos, EPA, DHA e ceramida.

ABSTRACT BEM, P.N.I Effect of Omega 3 Fatty Acids in Jurkat cell Intracellular Signaling and the involvement of sphingolipids 2010 84p. Post-Graduate Program in Pharmacy, Bandeirante University, São Paulo, 2010. Omega-3 fatty acids can control leukocyte function such as cytokine production, macrophage phagocytosis and lymphocyte proliferation. The positive effects of omega-3 fatty acid supplementation are related to beneficial effects on autoimmune and inflammatory disorders, such as psoriasis and rheumatoid arthritis. In this study we evaluated if the inhibitory effect of docosahexaenoic acid (DHA, C22:6 n-3) and eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5 n-3) on lymphocyte proliferation is related to ceramide de novo synthesis. The toxicity of DHA and EPA in the presence of 10 µm fumonisin B1 (FB1) in Jurkat cells (leukemic T cells) was determinate by flow cytometry. The effect of these compounds on lymphocyte proliferation was evaluated by thymidine incorporation. Afterwards, we analyzed the effect of EPA and DHA on protein phosphorylation related to lymphocyte proliferation (JAK1, Akt and p42/44) in the presence and absence of FB1. DHA inhibited lymphocyte proliferation when added to the medium at concentrations above 25 µm, whereas EPA inhibited it already at 12,5 µm. This effect, however, was abolished in the presence of FB1. DHA and EPA promoted an increase in DNA fragmentation above 25 µm. In the presence of FB1, this value was similar to control (without treatment) in all concentrations. DHA and EPA promoted a decrease on JAK1, p42/44 and Akt phosphorylation. Otherwise, in the presence of FB1 this effect was abolished. Consequently expression of the pro-apoptotic bax gene was increased by DHA and EPA and expression of the bcl-2 and bcl-xl was decreased. In the presence of FB1 all these effects were reverted. In conclusion, the inhibitory effects of DHA and EPA on Jurkat cell proliferation involve ceramide de novo synthesis leading to a decrease on JAK 1, p42/44 and Akt phosphorylation. Key Words: intracellular signaling, lymphocytes, EPA, DHA and ceramide.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Eventos da sinalização intracelular durante a ativação de linfócitos T.... 2 Figura 2 - Ativação dos fatores de transcrição em linfócitos T... 5 Figura 3 - Sinalização intracelular da apoptose... 16 Figura 4 - Estrutra do Ag ômega-6 Ácido linoléico... 23 Figura 5 - Estrutura dos Ags ômega-3 EPA e DHA... 24 Figura 6 - Conversão do Ag ômega-3 α- linolênico em EPA e DHA... 25 Figura 7- Mecanismos regulados por Ags na via de sinalização de IL-2... 26 Figura 8 - Vias do metabolismo de esfingolipídios... 28 Figura 9 - Estrutura química dos esfingolipídios... 29 Figura 10 - Histogramas representativos da integridade de membrana de células Jurkat... 42 Figura 11 - Efeito de diferentes concentrações do ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a integridade de membrana celular... 44 Figura 12 - Efeito de diferentes concentrações do ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a integridade de membrana celular... 45 Figura 13 - Histogramas representativos da fragmentação de DNA em células Jurkat após tratamento com DHA na presença e ausência de FB1... 46 Figura 14 - Efeito de diferentes concentrações do ácido docosahexaenóico (DHA) sobre a fragmentação de DNA... 48 Figura 15 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fragmentação de DNA... 49 Figura 16 - Efeito de diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a proliferação de Jurkat... 50 Figura 17 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a proliferação de Jurkat... 51 Figura 18 - Efeito de diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fosforilação da proteína Akt em células Jurkat... 53 Figura 19 - Efeito de diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fosforilação da proteína p42/44 em células Jurkat... 54 Figura 20 - Efeito das diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fosforilação da proteína Jak em células Jurkat... 55

Figura 21 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fosforilação da proteína Akt em células Jurkat... 56 Figura 22 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fosforilação da proteína p42/44 em células Jurkat... 57 Figura 23 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fosforilação da proteíns Jak em células Jurkat... 58 Figura 24 - Efeito de DHA sobre a expressão gênica de bax na presença e ausência de FB1... 59 Figura 25 - Efeito de EPA sobre a expressão gênica de bax na presença e ausência de FB1... 60 Figura 26 - Efeito de DHA sobre a expressão gênica de bad na presença e ausência de FB1... 61 Figura 27 - Efeito de EPA sobre a expressão gênica de bad na presença e ausência de FB1... 62 Figura 28 - Efeito do DHA sobre a expressão gênica de bcl-2 na presença e ausência de FB1... 63 Figura 29 - Efeito do EPA sobre a expressão gênica de bcl-2 na presença e ausência de FB1... 64 Figura 30 - Efeito do DHA sobre a expressão gênica de bcl-xl na presença e ausência de FB1... 65 Figura 31 - Efeito do EPA sobre a expressão gênica de bcl-xl na presença e ausência de FB1... 66 Figura 32 - Efeito de DHA e EPA sobre as vias de sinalização relacionadas à proliferação em células Jurkat... 72

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Genes representativos expressos por ativação de linfócitos T... 6 Tabela 2 - Principais diferenças entre apoptose e necrose... 17 Tabela 3 - Parâmetros dos primers utilizados para a reação de PCR em tempo real... 41 Tabela 4 - Concentrações Tóxicas de DHA e EPA... 52 Tabela 5 - Porcentagem de Inibição da Fosforilação de Proteínas por DHA e EPA. 58 Tabela 6 - Expressão de Genes pró e anti-apoptóticos... 66

LISTA DE ABREVIATURAS l- Microlitro g- Micrograma µci-micro-ci µm- Micromolar AA- ácido araquidônico Ags-ácidos graxos AIF-fator de indução da apoptose Akt- agammaglobinaemia tyrosine Kinase AND- translocador nucleotídio adenina AP-1- proteína ativadora 1 Apaf- fator de ativação de protease associada à apoptose APC-célula apresentadora de antígeno FB1- fumonisina B1 C1PP-ceramida-1-fosfato-fosfatase CAD- desoxiribonuclease ativada por caspase Cdk- ciclina dependente de quinase CK-ceramida quinase CPM-contagem por minuto CRS- cerebrosidase CTLL-2- linfócitos T citotóxicos DAG- diacilglicerol DHA- ácido docosa-hexaenóico DNA- Ácido desoxirribunucleico EDTA- ácido etilenodiaminotetracético EPA- ácido eicosapentaenóico ERK- quinase regulada por sinal extracelular GCS- glicosilceramida GH- hormônio do crescimento IAPs- proteínas inibidoras da apoptose ICAD-inibidor da desoxiribonuclease ativada por caspase IL-2- interleucina IP3- Inositol-trifosfato

JAK- Janus quinase LA- ácido linoléico MHC- complexo de histocompatibilidade ml- Mililitro MPF- Fator promotor de maturação NF- fator nuclear OA- ácido oléico PA- ácido palmítico PCR- reação em cadeia polimerase PI- iodeto de propídio PIP2- fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PIP3- fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato PK- proteína quinase PKA- proteína quinase A PKC- - proteína quinase C zeta PLA2- fosfolipase A2 PPAR- receptor ativado por proliferadores de peroxissoma PUFA-ácido graxo poliinsaturado RPM-rotação por minuto SA- ácido esteárico SK- esfingosina quinase Smac/DIABLO- proteínas inibidoras da IAPs SM-esfingomielina SPT- serina palmitoil-transferase SSP- esfingosina-1-fosfato TCR- receptor de célula T TNF- fator de necrose tumoral VDAC- atividade de canais aniônicos voltagem dependente

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 1 CAPÍTULO I 1.1 ATIVAÇÃO DE LINFÓCITOS... 1 1.2 SINALIZAÇÃO INTRACELULAR DOS LINFÓCITOS ATIVADOS... 2 1.3 CITOCINAS... 7 1.3.1 Interleucina-2 (IL-2)... 9 1.4 PROTEÍNA ERK1/2 E AKT... 11 1.4.1 Proteína quinase C (PKC)... 12 1.5 MORTE CELULAR... 13 1.5.1 Necrose... 13 1.5.2 Apoptose... 13 1.6 BCL-2... 18 1.6.1 Bax... 19 1.6.2 Bad... 19 1.7 OS ÁCIDOS GRAXOS... 20 1.8 ÁCIDOS GRAXOS E A FUNÇÃO IMUNE... 21 1.8.1 Ácidos graxos ômega-3... 21 1.8.2 Ácidos graxos ômega-6... 22 1.8.3 Diferenças entre DHA e EPA... 23 1.9 MECANISMOS DE AÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS NA SINALIZAÇÃO INTRACELULAR... 25 1.9.1 Importância dos Esfingolipídios... 27 1.9.2 Ceramidas... 31 CAPÍTULO II 2 JUSTIFICATIVA DO ESTUDO... 33 CAPÍTULO III 3 OBJETIVOS GERAIS... 34 3.1 ESPECÍFICOS... 34

CAPÍTULO IV 4 MATERIAL E MÉTODOS... 35 4.1 CONDIÇÕES DE CULTIVO DAS CÉLULAS JURKAT... 35 4.2 TRATAMENTO DAS CÉLULAS... 35 4.2.1 Incubação com os AGs... 35 4.2.2 Incubação com FB1... 36 4.2.3 Determinação da integridade de membrana celular por citometria de fluxo... 36 4.2.4 Fragmentação de DNA por Citometria de fluxo... 37 4.2.5 Determinação da proliferação celular... 37 4.2.6 Avaliação da fosforilação por western blotting... 38 4.2.7 Avaliação da expressão de genes por PCR em tempo-real... 39 4.2.7.1 Extração do RNA total das células Jurkat... 39 4.2.7.2 Reação de transcrição reversa (RT)... 39 4.3 QUANTIFICAÇÃO DOS mrna... 40 4.3.1 Análise Estatística... 41 CAPÍTULO V 5 RESULTADOS... 42 CAPÍTULO VI 6 DISCUSSÃO... 67 7 CONCLUSÃO... 71 8 REFERÊNCIAS... 74

1 1 INTRODUÇÃO 1.1 ATIVAÇÃO DE LINFÓCITOS A ativação de linfócitos exerce papel importante em muitas patologias, principalmente nas doenças auto-imunes. Porcentagens elevadas de linfócitos T são encontradas no sangue periférico de pacientes com lupus eritematoso (CHAN et al., 1996; TOKANO et al., 1997) e nas articulações inflamadas de pacientes com artrite reumatóide (FERNANDEZ-GUTIERREZ et al., 1995; HIROSE et al., 1990). Drogas que inibem a ativação de linfócitos como a ciclosporina melhoram o quadro de várias doenças auto-imunes (FILACI et al., 1999; ZEIDLER et al., 1998), mostrando a importância do estudo de compostos que inibam a ativação destas células como tratamento auxiliar destas patologias. Os linfócitos T podem ser ativados quando reconhecem peptídeos apresentados pelas células apresentadoras de antígeno. Para o reconhecimento dos antígenos, os linfócitos T têm receptores complexos (TCR) que se ligam aos peptídeos específicos que estão ligados ao complexo de histocompatibilidade (MHC) na superfície das células apresentadoras de antígenos (APC). Os linfócitos T CD8 + reconhecem os peptídeos ligados a MHC classe I e os linfócitos T CD4 + aqueles ligados a MHC classe II. Para a ativação e proliferação de linfócitos T a fim de evitar a apoptose, uma ação co-estimulatória é requerida. Esta estimulação pode ser mediada por receptores diferentes, dentre os quais o CD 28 é o mais proeminente, mas vários outros também foram descritos (CHAMBERS et al., 1999; GREENFIELD, et al., 1998; WATTS et al., 1999). A estimulação das células T por antígenos, anticorpos anti-cd3 ou lectinas mitogênicas levam à produção de IL-2 e expressão dos receptores de alta afinidade para esta citocina na superfície das células (SMITH et al., 1988., STANLEY et al.,1990). A ligação da IL-2 ao seu receptor promove a proliferação e sobrevivência dos linfócitos T (TKACZUK et al., 2002) através da ativação de importantes vias de sinalização como JAK-STAT5, Ras-ERK 1/2 e PI3K Akt. Estas respostas celulares também podem ser induzidas pela ativação das PKCs, resultando na fosforilação de

2 proteínas alvo em resíduos de serina/treonina, modulando, desta forma, diferentes processos celulares (KOBAYASHI et al., 2001; FAN et al., 2000). 1.2 SINALIZAÇÃO INTRACELULAR DOS LINFÓCITOS ATIVADOS Pasetti (2009) descreveu as principais vias de sinalização em linfócitos T ativados. Independente do tipo de linfócito T (CD4 ou CD8), após a ligação do TCR com o complexo MHC, quinases ligadas à porção intracelular do complexo CD3 e das moléculas co-estimulatórias são ativadas e acabam levando à ativação destas células (COOMBS et al., 2002). Figura 1 - Eventos da sinalização intracelular durante a ativação de linfócitos T. A ligação do TCR e de co-receptores (CD4/CD8) ao complexo peptídeo-mhc nas células apresentadoras de antígenos (APCs) inicia a fosforilação da cadeia, ligação e ativação da ZAP-70, fosforilação das proteínas adaptadoras e ativação de várias enzimas celulares. Estas enzimas ativam fatores de transcrição que estimulam a expressão de vários genes envolvidos nas respostas de ativação de linfócitos T. Fonte: adaptado de ABBAS; LICHTMAN; PILLAI (2008). Este evento de sinalização intracelular (Figura 1) começa com a fosforilação de regiões específicas da proteína Lck (associada à porção intracelular do TCR) e de um grupo de complexos protéicos ligados a sequências repetidas de resíduos

3 de tirosinas, as ITAMs, localizados no domínio intracelular das cadeias ζ. A fosforilação das ITAMs conduz ao recrutamento e ativação da quinase ZAP 70, que catalisa a fosforilação da proteína adaptadora LAT levando à ativação de PLC-, Ras e Rac. Estas vias levam à ativação de três fatores de transcrição, AP-1, fator nuclear das células T ativadas (NF-AT) e fator nuclear B (NF- B), que estão envolvidos na proliferação e sobrevivência de células T e na produção de citocinas envolvidas com a ativação destas células (IWASHIMA, 2003). O NF-AT é um fator de transcrição necessário para a expressão dos genes da IL-2, IL-4, TNF, além de outras citocinas (PROKSCH et al., 2005). O NF-AT está no citoplasma dos linfócitos T em repouso na forma inativa, pela fosforilação de uma serina. A fosfatase calmodulina-calcineurina-ca 2+ -dependente desfosforila o NF-AT citoplasmático, permitindo translocar-se para o núcleo (FIEDLER et al., 2002). Uma vez no núcleo, o NF-AT ativo liga-se às regiões promotoras dos genes que codificam as citocinas IL-2, IL-4 e de outras, geralmente em associação com outros fatores de transcrição, como AP-1 (SHAPIRO; MOLLENAUER; WEISS, 1998). O AP-1 é um dímero formado pelas proteínas Fos e Jun e é importante para a progressão do ciclo celular. A transcrição de AP-1 é induzida em resposta a vários estímulos (SHAULIAN; KARIN, 2002). A ZAP-70, que é ativada pela fosforilação da cadeia, cataliza a fosforilação da proteína adaptadora associada à membrana, LAT, levando à conversão da Ras-GDP em Ras-GTP que ativa uma cascata de enzimas, culminando na ativação de um dos componentes de AP-1. A via paralela, Rac, gera o segundo componente ativo da AP-1 (LEE et al., 2000). O NF-қB está presente no citoplasma das células T de forma inativada, complexado a outras proteínas chamadas inibidores de қb (IқB). Estes inibidores ligam-se ao domínio RHD do NF-қB e impedem a translocação nuclear (MAGNANI et al., 2000). Para a ativação do NF-қB, é necessária a degradação das proteínas IқBs. Através dos sinais do TCR, ocorre a fosforilação da proteína IқB, onde a ubiquitina liga-se e, desta forma, sinaliza para sua degradação no proteossoma (TRAENCKNER; WILK; BAEUERLE, 1994). O NF-қB livre responde a sinais extracelulares e transloca-se para o núcleo, onde regula a transcrição de genes específicos, incluindo moléculas de adesão, citocinas inflamatórias, quimiocinas, interferons e proteínas do MHC (MAGNANI et al., 2000). A figura 2 ilustra os fatores de transcrição das células T por várias vias de sinalização que

4 quando ativadas por antígenos estimulam as células T a gerar fatores de transcrição que, por sua vez, estimulam vários genes, dentre eles a IL-2.

5 Figura 2 - Ativação dos fatores de transcrição em linfócitos T - Várias vias de sinalização convergem nas células T estimuladas por antígenos para gerar fatores de transcrição que estimulam a expressão de vários genes (neste caso, o gene da IL-2). A via Ca +2 -calmodulina ativa o NF-AT e as vias Ras e Rac ativam os dois componentes da AP-1. O NF-қB é mostrado como um complexo de duas subunidades (p50 e p65) e a PKC é importante na ativação das células T. Esses fatores de transcrição funcionam coordenadamente para regular a expressão do gene da IL-2. GDP-difosfato de guanosina; GTP-trifosfato de guanosina; PKC-proteína quinase C. Fonte: adaptado de ÀBBAS; LICHTMAN; PILLAI (2008). Com base no tempo de aparecimento após a estimulação, os genes envolvidos com a ativação de linfócitos T podem ser denominados imediatos, precoces ou tardios (Tabela 1). Deste modo, a ativação das células T inclui os seguintes passos: - Eventos de transdução de sinais precoces; - Ativação transcricional de uma variedade de genes; - Expressão de novas proteínas; - Indução da atividade mitótica.

6 Tabela 1 - Genes representativos expressos por ativação de linfócitos T Abreviações: GM-CSF: Fator Estimulante de Colónia Granulócitos e Monócitos; HLA: Antígeno Leucocitário Humano; IFN -: Interferon- ; IL; Interleucina; VLA: Ativação Tardia. Fonte: adaptado de ABBAS; LICHTMAN; PILLAI (2008). A tradução de mrna em proteínas é um importante processo regulado pela ativação dos linfócitos. As células T circulantes estão normalmente quiescentes, com baixas taxas de RNA, proteína e pouca síntese de DNA. Entretanto, quando elas são ativadas, imediatamente ocorre um aumento da síntese proteica, importante para a proliferação (VARESIO; HOLDEN; TARAMELLI, 1980). A transcrição de genes imediatos são assim denominados por não requererem a síntese proteica para sua estimulação, enquanto os genes precoces e tardios requerem, logo após a célula em repouso ser estimulada por sinais extracelulares. Estas distinções ocorrem provavelmente devido à resposta dos genes de expressão imediatos serem pré-formados e poderem ser ativados para a síntese de novas proteínas. Os outros fatores de transcrição, responsáveis pela expressão dos genes precoces precisam ser sintetizados. Os genes imediatos e precoces são transcritos previamente à mitose e os genes tardios depois da proliferação celular (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008).

7 1.3 CITOCINAS As citocinas são um importante grupo de proteínas que funcionam como comunicadores intercelulares. Elas geralmente agem localmente por interação com receptores específicos sobre a superfície das próprias células que as produzem (autócrinas) ou sobre outros tipos celulares (parácrinas). No sistema imunitário, um grande número de citocinas tem um importante papel tanto no desenvolvimento de um sistema imunitário funcional quanto na resposta do organismo à infecção (HOLLOWAY; SHANNON, 2001). As mesmas citocinas são, com freqüência, elaboradas por muitos tipos celulares e as citocinas individualmente podem atuar sobre muitos tipos celulares. As ações de diferentes citocinas são, muitas vezes, redundantes, ou seja, muitas funções originalmente atribuídas a uma citocina têm comprovado ter propriedades compartilhadas por várias citocinas diferentes e ainda exercem influência nas ações de outras citocinas. De modo geral, as citocinas são sintetizadas em resposta a estímulos inflamatórios ou antigênicos e atuam localmente, de modo autócrino ou parácrino, ligando-se a receptores de alta afinidade nas células-alvo. Certas citocinas podem ser produzidas em quantidade suficiente para circular e exercer ações endócrinas. As citocinas servem como fatores de crescimento para muitos tipos celulares. A secreção de citocinas é um evento rápido e autolimitado. Citocinas são frequentemente agrupadas em famílias de acordo com suas funções similares ou de acordo com a sua estrutura protéica (HOLLOWAY; SHANNON, 2001). São elas as hematopoietinas, os interferons (IFN) e a família do fator de necrose tumoral (TNF). Membros da família TNF atuam como trímeros, a maioria dos quais ligados à membrana e muito distintos das outras citocinas por suas propriedades. Apesar disso, eles compartilham algumas propriedades importantes com as citocinas solúveis: eles são sintetizados novamente no momento do reconhecimento do antígeno pela célula T, afetando o comportamento da célulaalvo (JANEWAY et al., 2002). A principal função dos receptores de citocinas é converter um sinal extracelular, como o de uma ligação específica de uma citocina a uma célula-alvo, em um sinal intracelular, como a ativação de uma enzima ou de um fator de transcrição que pode desencadear uma resposta da célula-alvo (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000).

8 As citocinas IL-3, IL-4, IL-5, IL-13 e fator de estimulação de colônia de granulócito e monócito (GM-CSF) são estruturalmente relacionadas. Todas estas citocinas são produzidas por linfócitos TH2 e ligam-se a receptores muito relacionados que compartilham uma cadeia ß comum. Outro subgrupo de receptores é definido por conter as cadeias do receptor de IL-2, que é compartilhado pelos receptores das citocinas: IL-4, IL-7, IL-9 e IL-5. Em geral, o relacionamento genético, estrutural e funcional entre as citocinas e seus receptores sugere que elas divergiram juntas na evolução de suas funções efetoras especializadas (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000). O TNF-alfa, por exemplo, é o principal mediador da resposta a bactérias Gram negativas e pode também exercer um papel nas respostas imunes inatas a outros microrganismos infecciosos. Foi originalmente identificado como um mediador de necrose tumoral que estava presente no soro de animais tratados com lipopolissacarídeos (LPS). O LPS em baixas concentrações estimula as funções dos fagócitos mononucleares e no camundongo age como um ativador policlonal de células B. Quando são produzidas pequenas quantidades, o TNF- age localmente como um regulador parácrino e autócrino dos leucócitos e células endoteliais (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000). O IFN- é uma citocina pleiotrópica com potente efeito imunomodulatório sobre uma variedade de células imunes in vitro e in vivo. Esta citocina possui múltiplas atividades biológicas por controlar tanto positivamente quanto negativamente a expressão de muitos genes e proteínas. Embora IFN- tenha sido originalmente definida como um fator antiviral produzido por linfócitos estimulados sabe-se que esta citocina pode exibir um amplo efeito sobre diversos aspectos do sistema imunitário. O IFN- geralmente leva à ativação de macrófagos e diferenciação de células T no tipo Th-1 (BROWNING; McMICHAEL, 1996). A IL-10 é uma citocina produzida pelos linfócitos T auxiliares, linfócitos B, monócitos e macrófagos. Possui propriedades antiinflamatórias, cuja principal função é a regulação do sistema imunológico, pois inibe de maneira potente a expressão e/ou a produção de citocinas pró-inflamatórias. Exerce seu efeito antiinflamatório no sistema vascular pela inibição das interações endoteliais e leucocitárias, inibição da secreção de citocinas pró-inflamatórias e inibição de

9 diversas funções de macrófagos, células natural killers e linfócitos (ABBAS et al., 2008). 1.3.1 Interleucina-2 (IL-2) Linfócitos T antígeno-específicos não reconhecem antígenos na forma livre ou solúvel, mas ao contrário, reconhecem porções de antígenos protéicos (isto é, peptídeos). Para que esse reconhecimento ocorra, é necessário que determinadas células capturem o antígeno, processe-o e apresente-o à célula T antígenoespecífico, através de uma ligação não covalente dos peptídeos às moléculas denominadas MHC (complexo de histocompatibilidade) (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000). Os três principais tipos de células apresentadoras de antígeno especializadas (APCs) são macrófagos, células dendríticas e Linfócitos B. Cada um desses tipos é especialista em processar e apresentar antígenos de diferentes fontes às células T, além de expressarem as moléculas co-estimuladoras especializadas necessárias para ativação das células T virgens (JANEWAY et al., 2002). Existem dois tipos de moléculas do MHC, chamadas MHC de classe I e MHC de classe II. Tanto as moléculas MHC I e II, quanto, outras proteínas envolvidas no processamento e na apresentação de antígenos são codificadas em uma região de genes altamente polimórficas denominadas complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (PARHAM, 2001). Essas regiões são separadas por uma região central de classe III. A região de classe III também contém genes que codificam proteínas com função importante relacionada à imunidade como proteínas do sistema complemento, fator de necrose tumoral (TNF) e linfotoxinas α e β (BROWNING; McMICHAEL, 1996). Como parte deste enfoque nos antígenos peptídicos como alvos, os sistemas imunológicos dos seres humanos e de outros mamíferos desenvolveram mecanismos para detectar as numerosas proteínas presentes no seu meio ambiente e clivá-las em peptídeos, seqüência conhecida como processamento de antígeno, tornando esses acessíveis para o reconhecimento pela célula T através da apresentação de antígeno (STITES, TERR, 1992). A interleucina-2 é uma citocina secretada pelos linfócitos T quando ocorre estimulação por antígenos, lectinas e anticorpos anti-cd3 que está relacionada com

10 a regulação de aspectos importantes do metabolismo de linfócitos, proliferação e diferenciação. Foi o primeiro fator de crescimento de células T a ser molecularmente clonado, sendo a citocina de escolha para a propagação das células T em cultura (SMITH, 1988). Esta citocina é infundida em pacientes com AIDS para aumentar o número e a função de células T (PAHWA; MORALES, 1998). A produção de IL-2 ocorre quando há estímulo do TCR e ativação de suas vias de sinalização. Outras vias de sinalização que regulam a produção e secreção de IL-2 tem sido descritas nos últimos anos. Algumas das proteínas envolvidas neste processo são as caspases. A incubação de linfócitos humanos com bloqueadores de caspases promove inibição da produção de IL-2 e da atividade do fator de crescimento e da atividade do fator de transcrição NF-ĸB, levando à diminuição da capacidade proliferativa destas células (FALK et al., 2004). A IL-2 liga-se a receptores de superfície nas células (IL-2R) levando à ativação dos linfócitos T (TKACZUK et al., 2002). A ligação da IL-2 ao seu receptor promove o início da proliferação da célula T, regulando a transcrição na fase G1 para a S do ciclo celular (WANG et al., 2004) nos linfócitos ativados. O receptor de IL-2 é composto por três cadeias alfa (CD25), beta (CD 122) e gama (CD 132), que se ligam à IL-2 com diferentes afinidades, sendo que a afinidade máxima ocorre quando as três cadeias estão presentes; afinidade intermediária ocorre quando apenas as cadeias beta e gama estão presentes e pouca afinidade quando apenas a subunidade alfa está presente ( TKACZUK et al., 2002). O IL-2R é modificado pelo estado de ativação da célula T, visto que os linfócitos circulantes inativos, ou seja, em repouso, expressam apenas as cadeias beta e gama (HATAKEYMA et al.,1989). Quando o antígeno é reconhecido pelo TCR, a cadeia alfa é expressa combinando com as cadeias beta e gama para formar o receptor de alta afinidade (KACZEMAREK;1985), ocorrendo aumento da sensibilidade da célula à IL-2. As cadeias beta e gama são responsáveis pela transmissão de sinal desencadeado pela ligação da IL-2 ao receptor, pois a porção citoplasmática destas cadeias apresenta sítios de ligação para outras proteínas.já a cadeia alfa apresenta uma porção citoplasmática curta e não participa da transmissão do sinal sendo apenas fundamental para a ligação da IL-2 ao seu receptor.

11 A principal via de sinalização ativada pela ligação da IL-2 ao seu receptor (IL- 2R) é a JAK/STAT. A sinalização intracelular pelo IL-2R também pode envolver a ativação e outras vias para a ativação completa dos linfócitos, como das proteínas Ras-Raf1-ERK1/2 (SATOH et al., 1991; TURNER et al., 1991; GRAVES et al., 1992 ; KARNITZ et al., 1995) e PI3K-AKT (AUGUSTINE; 1991). Quando os linfócitos são estimulados através do TCR ocorre indução da expressão de JAK3 juntamente com a subunidade CD25 levando à formação do receptor de alta afinidade que responde completamente à ação da IL-2 (ELLERY; NICHOLLS, 2002). 1.4 PROTEÍNA ERK1/2 E AKT As ERKS pertencem à família das MAP quinases e participam da fase final desta via de sinalização. Estas proteínas fosforilam outras quinases e proteínas regulatórias da transcrição (BOULTON et al., 1991; MARSHALL, 1995). As ERKS podem também estar envolvidas com a fosforilação de resíduos de serina de STAT em vários sistemas (DAVID et al., 1995; WEN; DARNELL, 1997; DARNELL, 1996). Na sinalização de GH que também envolve ativação de STAT 5 a via da ERK é fundamental para a atividade transcricional do STAT (PIRCHER et al., 1999; PARK et al., 2001). As ERKS também estão envolvidas com a fosforilação e ativação de fatores de transcrição como Elk-1, Fos, AP-1, NF-AT e c-myc (TREISMAN, 1996; GENOT; CANTRELL, 2000), aumentando a capacidade proliferativa das células. A proteína AKT contém um domínio PH (Pleckstrin homology) que se liga ao PIP3 na membrana. Em seguida, a conformação da AKT pode ser alterada e ativada por processo que requer fosforilação por uma proteína quinase dependente de fosfatidilinositol (PDK). Quando ativada, a AKT retorna para o citoplasma ou migra para o núcleo onde fosforila uma variedade de proteínas envolvidas com o processo de sobrevivência das células. A proteína AKT induz a expressão de genes como bcl-2, bcl-xl e c-myc, que são anti-apoptóticos, e inibe a ativação de proteínas pró-apoptóticas como Bad, Bid, e Bax, promovendo a sobrevivência das células (LORD et al., 2000).

12 1.4.1 Proteína quinase C (PKC) A ativação da PKC pela IL-2 parece ser um mecanismo importante pelo qual esta citocina suprime os sinais de morte celular em linfócitos T. As respostas celulares induzidas pela ativação das PKCs resultam na fosforilação de proteínas alvo em resíduos de serina/treonina, modulando desta forma diferentes processos celulares (FAN; KARNOVSKY, 2000; KOBAYASHI et al., 2001). As famílias das PKCs são classificadas em três grupos de acordo com os co-fatores necessários para a sua ativação. As PKCs convencionais (α, β e ) são ativadas por Ca 2+, DAG e fosfatidilserina, um fosfolipídio de membrana. As PKCs novas (δ, ε e θ) não têm o domínio de ligação ao Ca 2+ e são ativadas por DAG, fosfatidilserina e ácidos graxos insaturados. As PKCs atípicas (ζ, λ e ɩ) não são ativadas por Ca2+ e DAG, mas existem indícios de que são ativadas por fosfatidilserina, fosfatidilinositóis ou ceramidas (NAKANISHI., et al., 1993; SELBIE et al., 1993). DUTIL et al. (1994) demonstraram que a ativação das PKCs também é regulada por fosforilação, sendo este um bom indicador de ativação destas proteínas. A PKC-ζ é fosforilada pela proteína quinase dependente de fosfatidilinosiol 1 (PDK1), mas recentemente observou-se que PIP3 pode ativar a PKC-ζ diretamente (YANEY et al., 2000). A IL-2 também pode ativar PKC sem alterar a sua translocação do citosol para a membrana (LU et al., 1999). Lu et al. (1999) observaram que a ativação da PKC residente na membrana em uma linhagem de linfócitos T citotóxicos (CTLL-2) induzida pela IL-2 não está relacionada com o aumento da atividade de tirosina quinase promovida por esta citocina. Uma porção significativa da PKC presente nas células associa-se à membrana no estado inativo e este pool pode ser especificamente estimulado por fatores de crescimento (como a IL-2) na ausência de translocação para a membrana plasmática. Tanto o ácido araquidônico (AA) como DAG estimulam a atividade de uma família de PKC, de maneira independente de fosfolipídios e Ca 2+ (as novas) (LESTER et al., 1991). A inibição da PLA2, que é responsável pela liberação de AA da membrana, promove inibição da atividade de PKC estimulada por IL-2 (LU; MORLEY; DURKIN, 1999). Portanto, a IL-2 pode ativar dois mecanismos distintos: sinalização envolvendo ativação de tirosina quinase e a estimulação da atividade de PKC resultando em aumento da proliferação celular e inibição do processo de apoptose (GORJÃO et al., 2007).

13 1.5 MORTE CELULAR 1.5.1 Necrose Necrose, na etiologia grega, quer dizer estado de morte e envolve um processo de morte que é resultado de injúria celular irreversível. Este tipo de morte celular geralmente acomete um grupo de células vizinhas e envolve inflamação. As primeiras alterações celulares observadas são: tumefação celular e degeneração em alguns casos, com formação de vacúolos lipídicos no citoplasma. A mitocôndria e o retículo endoplasmático tornam-se tumefeitos e a cromatina se agrega marginalmente no núcleo deixando de ser visualizada (cariólise). A ruptura das organelas antes tumefeitas dá aspecto granuloso ao citoplasma. Com a ruptura dos lisossomos e conseqüente lise das organelas pelas enzimas lisossomais, verifica-se a homogeneização do citoplasma em uma massa acidófila e opaca. Quando toda basofilia é perdida e os limites entre as organelas se tornam indistinguíveis, as células necróticas são chamadas de células fantasmas. As membranas permitem o extravasamento do conteúdo citoplasmático e a entrada do material extracelular. O rompimento celular induz uma resposta inflamatória local e fagocitose do tecido (PROSKURYAKOV; KONOPLYANNIKOV; GABAJ, 2003). 1.5.2 Apoptose Apoptose é um termo de etiologia grega, significa folhas caindo das árvores e foi inicialmente descrita por Kerr et al. (1972). A apoptose é um modelo bem caracterizado de morte celular que pode ocorrer por uma diversidade de estímulos fisiológicos e não fisiológicos. Trata-se de um suicídio celular mediante à ativação de um processo bioquímico controlado, requer energia e não envolve inflamação (GORMAN et al., 1997). O processo apoptótico pode ocorrer em situações fisiológicas adaptativas como na embriogênese, ciclo menstrual, reabsorção de tecido mamário após desmame, menopausa, maturação do sistema nervoso central, morte das células imunes (linfócitos T e B no processo de seleção ou após depleção de citocinas) ou em situações patológicas como citotoxicidade de linfócitos T, deleção de células em proliferação (criptas intestinais e tumores), infecções virais,

14 estímulos nocivos e tratamentos drásticos (hipertermia, grandes variações de ph, radiação, agentes químicos) (JACOBSON; WEIL; RAFF, 1997). As células que morrem por apoptose apresentam condensação de cromatina em grandes corpos granulares que se ligam à carioteca, formando um núcleo picnótico. Em um estágio posterior, ocorre clivagem do DNA internucleossomal, causado pelas endonucleases endógenas, em fragmentos de 180-200 bares de bases ou maiores. A fragmentação nuclear é uma fase irreversível da apoptose (KERR, WYLLIE, CURRIE, 1972; THOMPSON, 1998). Ocorre condensação do citoplasma, com grande aumento da densidade das organelas, as quais mantém sua integridade. Surgem vacúolos citoplasmáticos e ocorrem projeções da membrana celular denominadas blebs. A seguir estas se destacam, dando origem aos corpos apoptóticos, que são rapidamente fagocitados por macrófagos ou por células vizinhas sem indução de inflamação (KERR, WYLLIE, CURRIE, 1972). Em estágios iniciais da apoptose, a membrana plasmática está íntegra e suas funções de transporte estão preservadas, porém a membrana pode sofrer alterações durante este processo como por exemplo, a exposição de fosfatidil-serina (GOMES- ANGELATS, BORTNER, CIDLOWSKI, 2000 ). As caspases são responsáveis pela continuidade do sinal pró-apoptótico, fazem parte de uma família de cisteína proteases, que clivam sequências específicas de aminoácidos que terminam em ácido aspártico (KROEMER, 1998). Atualmente são conhecidas mais de 12 caspases. Estas ativam uma cascata de eventos moleculares que levam a degradação das células. Embora as caspases sejam necessárias para completa manifestação da apoptose, este mecanismo de morte celular pode ocorrer independente das mesmas. Observa-se em células de camundongos e outros mamíferos, o envolvimento de fatores mitocondriais tais como os fatores de indução de apoptose (AIF) e a endonuclease G na indução da apoptose independente de caspases (SUSIN et al., 1999). Considerando-se as diversas etapas do processo de apoptose, podem-se dividí-las em: caspases 8 e 9 como proteínas iniciadoras; as caspases 3 e 7 como proteínas efetoras; a proteína Apaf-1 como uma proteína adaptadora; a família das Bcl-2 como proteínas que subdividem-se em pró e anti-apoptóticas como reguladoras; as proteínas inibidoras da apoptose IAPs (inibidora) e as proteínas Smac/DIABLO, inibidoras das IASPs ( ativadoras). Parte deste intricamento e bem

15 organizado mecanismo de morte celular por indução mitocondrial deve-se às mudanças na permeabilidade da membrana externa da mitôcondria. Tais alterações são essencias para apoptose e permitem a translocação da proteína apoptogênica citocromo C (cit c) para o citoplasma (MURPHY 1999) e o fator de indução de apoptose ( AIF) para o núcleo. A apoptose pode ser ativada pela transdução de sinal via receptores ( death receptor ) da membrana celular e consequente ativação da caspase-8, ou através do retículo endoplasmático pela ativação caspase-12 ou por meio da alteração da permeabilidade da membrana externa da mitocôndria e ativação da caspase-9 (MEHMET et al., 2000). A apoptose que ocorre devido à permeabilização da membrana da mitocôndria com liberação do cit c para o citosol, envolve a molécula adaptadora Apaf-1. Ocorre a dimerização e ativação da pró-enzima caspase-9 que forma o apoptosoma (complexo multimolecular Apaf-1 e caspase-9), que por sua vez ativa a caspase-9 com subsequente ativação da caspase-3, uma das principais caspases efetoras. Esta cliva vários alvos celulares incluindo o inibidor da desoxiribonuclease ativada por caspase (ICAD), que leva à desinibição da CAD e caracteriza a apoptose nuclear pela condensação da cromatina e degradação do DNA oligonucleosomal. A apoptose ativada pela transdução de sinal via receptores de morte celular da membrana celular envolve a ligação de um ligante na membrana celular. Na face interna ocorre a ligação de uma proteína adaptadora que ativa a caspase 8, iniciando-se, assim, a cascata da caspase (MORAES, 2003). Outras vias de apoptose envolvem o estresse do retículo endoplasmático, alteração do cálcio intracelular e ativação da caspase 12 (MEHMET, 2000). A figura 3 resume algumas etapas da sinalização intracelular para a ativação da apoptose (HUNOT; FLAVEL, 2001).

16 Figura 3 Sinalização intracelular da apoptose. À direita, a estimulação da apoptose pela permeabilização da membrana da mitocôndria com a liberação do citocromo c para o citosol, que se liga a molécula adaptadora Apaf-1. Ocorre então dimerização e ativação da pro-enzima caspase-9, que forma o apoptosoma (complexo Apaf-1 e caspase 9). Ocorre a ativação da caspase-9 e subsequente ativação da caspase-3, uma das principais caspases efetores. Esta cliva vários alvos celulares, incluindo o inibidor da desoxiribonuclease ativada por caspase (ICAD) que leva à desinibição da CAD e caracteriza a apoptose nuclear pela condensação da cromatina e degradação do DNA oligonucleosomal. A apoptose dependente de caspase tem um múltiplo sistema regulatório. Ocorre a participação das proteínas anti-apoptóticas (BCL2 e BCL-xl), sendo a BCL2 um membro da família de proteínas que bloqueia a liberação do citocromo C da mitocôndria; o inibidor de apoptose (IAPS) que bloqueia a atividade catalítica das caspases e a proteína mitocondrial Smac/DIABLO que bloqueia as proteínas inibidoras IAPs. À esquerda, a mitocôndria libera uma flavoproteína, fator de indução de apoptose mitocondrial (AIF) no citosol ou

17 endonuclease G, que são os estimuladores que disparam a apoptose independente de caspases. Em certas circunstâncias, AIF pode ativar a liberação do citocromo C envolvendo fatores citosólicos como a endonuclease G, como via independente das caspases. Este processo pode ser mediado pela ação da proteína Bax (CROMPTON, 2000). Fonte: Adaptado HUNOT; FLAVEL, 2001; MEHMET, 2000. A morte por necrose também se caracteriza pela perda da integridade celular. As células e as organelas apresentam-se edemaciadas, a cromatina nuclear condensada irregularmente e a membrana plasmática apresenta regiões de ruptura. Posteriormente, esta membrana rompe-se e libera o conteúdo celular no espaço intercelular, desencadeando a reação inflamatória (CONKEY; ORRENIUS, 1992). A tabela a seguir representa as principais diferenças entre apoptose e necrose. Tabela 2 Principais características da apoptose e necrose (continua) Características Apoptose Necrose Estímulos Fisiológicos e Patológicos indutores patológicos (geralmente injúria) Ocorrência Células isoladas Grupos de células Adesões entre células e a membrana Perdidas (início) Perdidas (fim) basal Morfologia Formação de Intumescimento e a celular copos apoptóticos seguir desintegração Núcleo Fragmentação Desaparecimento de DNA (cariólise) Compactação Cromatina em massas vacuolizações uniformemente densas

18 Características Apoptose Necrose Organelas citoplasmáticas Intumescimento (fase final) Intumescimento ( fase final) Participação das caspases presente ausente Liberação de Enzimas lisossomais ausente presente Translocação de Fosfatidil-serina para a face externa da presente Geralmente ausente membrana plasmática Fagocitose por células adjacentes presente ausente Inflamação exsudativa ausente presente Fonte: Adaptado de CARVALHO, F.; PIMENTEL, S. M. R 2007 1.6 BCL-2 As proteínas da família Bcl-2 são moléculas reguladoras que se localizam no citoplasma e na membrana mitocondrial externa e integram sinais de morte ou de sobrevivência celulares e que podem ativar ou não a apoptose (COTRAN et al., 2000). A família Bcl-2 divide-se em três subfamílias, sendo que duas delas possuem multidomínios BH (Bcl-2 Homology regions) e ação anti-apoptótica (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 e A1/Bfl-1) ou pró-apoptótica (Bax, Bak, Mtd/Bok e Bcl-rambo). A outra subfamília são as pró-apoptóticas que possuem somente o domínio BH3 (Bad, Bid, Bim/Bod, Bmf, Blk, Bnip3/Nix, BiK/Nbk, Bnip3L, Hrk/DP5, Noxa, Puma, p193 e Bcl- G). Esta subfamília ativa membros das pró-apoptóticas que contém multidomínios e/ou inativam as anti-apoptóticas (SHIMIZU et al., 1998). Recentemente foi demonstrado que as proteínas da família Bcl-2 próapoptóticas regulam a liberação do citocromo C, alterando o potencial de membrana mitocondrial pela direta modulação da atividade de canais aniônicos voltagem dependentes (VDAC) em hepatócitos (SHIMITZU et al., 2000). Este processo é inibido pelo domínio (BH4) presente nas proteínas Bcl-2 e Bcl-xl.

19 Através do domínio BH3, a proteína Bax se insere na membrana externa da mitocôndria, formando um polo tetramérico (POLSTER et al., 2001). É importante ressaltar que rotineiramente novos genes/proteínas têm sido revelados como participantes da apoptose. Isto demonstra que a rede regulatória que controla a sobrevivência ou morte celular é bem mais complexo do que previamente se pensava. 1.6.1 Bax O gene bax faz parte da família Bcl-2, sendo um gene pró-apoptótico (COTRAN et al., 2000). Sua proteína ativa uma pró-caspase específica ao liberar citocromo c, proteína essa que ativa a cascata de caspases, induzindo a apoptose (ALBERTS, 2006). Quando ocorre aumento da expressão do gene da Bax é desencadeado o processo de morte celular por apoptose. Na proteína Bax existem regiões homólogas aos da proteína Bcl-2, chamadas de BH1 e BH2 que, ao se interagirem, inibem a apoptose (YIN, OLTVAI, KORSMEYER, 1994). Krajewski et al. (1995) relataram que o gene Bax está expresso no epitélio normal da mama, já no carcinoma in situ e adenocarcinoma invasor, sua expressão está diminuída, sendo essa diminuição relacionada com a progressão mais rápida do tumor, pela perda do controle da apoptose feita por esse gene. 1.6.2 Bad O gene bad faz parte da família Bcl-2. Sendo um gene pró-apoptótico, é promotor da apoptose por ativar a pró-caspase e, consequentemente, a apoptose. O gene bad inativa a inibição da apoptose (ALBERTS et al., 2002).

20 1.7 OS ÁCIDOS GRAXOS Os ácidos graxos são indispensáveis para a manutenção funcional do organismo. Estes compostos podem ser sintetizados pelo próprio organismo ou obtidos da dieta. Os ácidos graxos obtidos somente através da dieta são chamados de essenciais e geralmente são insaturados na terceira (ômega-3) ou sexta posição (ômega-6) a partir do hidrocarboneto final. Dentre os ácidos graxos ômega-6, encontram-se os ácidos linoléico (C18:2 ômega-6) e -linolênico (C18:3 ômega-6) que são precursores do ácido araquidônico (C20:4 ômega-6). Este último ácido graxo é o primeiro componente da cascata de formação dos eicosanóides e apresenta um papel pró-inflamatório (KINSELLA et al.,1990; WEITBERG et al.,1988; WILLIANS et al., 1988). O ácido -linolênico (C18:3) pertence à família ômega-3 e também é um ácido graxo essencial. Este ácido graxo pode ser convertido nos ácidos eicosapentaenóico (EPA, C20: 5) e docosa-hexaenóico (DHA, C22:6). Os ácidos graxos ômega-3, principalmente EPA, são precursores de eicosanóides biologicamente menos ativos. As células animais podem apenas converter o ácido -linolênico em outros ácidos graxos da mesma série, como o EPA e DHA. Assim como o ácido -linolênico e di-homo- -linolênico pode se converter em ácido araquidônico da mesma série ômega-6. Desta forma, ácidos graxos de séries diferentes não se interconvertem. Os ácidos graxos essenciais sofrem apenas processos de elongação com adição de novos átomos de carbono no grupo carboxílico. Muitos estudos têm demonstrado a habilidade dos ácidos ômega-3 em modular a função das proteínas acopladas à membrana como canais iônicos e transportadores de íons (GORJÃO et al., 2009). A incorporação de PUFA (ácidos graxos poliinsaturados) em fosfolipídios de membrana modula as propriedades físicas de maneira similar aos ácidos graxos esterificados (GORJÃO et al., 2009). Onuki et al. (2006) mostraram que os PUFA podem alterar as propriedades fisico-químicas dos fosfolipídios de membrana por reduzir as interações de Van der Walls entre as cadeias acil deste fosfolipídios. A troca de íons por permeabilidade pela membrana tem demonstrado dependência direta com o grau de insaturação dos ácidos graxos que a constituem. Ehringer et al. (1990) mostraram que o DHA tem efeito mais pronunciado na

21 permeabilidade iônica do que o ácido linolênico, efeito similar também se evidencia na fluidez da membrana. 1.8 ÁCIDOS GRAXOS E A FUNÇÃO IMUNE A manutenção, funcionalidade e desenvolvimento do sistema imune dependem de uma nutrição balanceada e adequada. Os ácidos graxos podem atuar como moléculas biologicamente ativas na regulação de várias funções do sistema imune. Os ácidos graxos afetam várias etapas da inflamação como quimiotaxia, adesão celular, diapedese e ativação de leucócitos (GORJÃO et al., 2006). Além disso, os ácidos graxos modulam a função dos linfócitos, controlando a proliferação, produção de citocinas e eicosanóides, adesão celular, metabolismo e morte celular (POMPEIA et al., 2000). Em estudos com linfócitos humanos in vitro foi demonstrado que os ácidos oléico e linoléico podem estimular a proliferação celular em baixas concentrações (12,5 e 25 µm) e diminuí-la em concentrações mais elevadas (a partir de 75 µm) (Gorjão et al., 2007b). Neste mesmo estudo, os ácidos ômega-3 DHA e EPA promoveram diminuição da proliferação celular a partir de 50 µm (GORJÃO et al., 2007b). 1.8.1 Ácidos graxos ômega-3 DHA e EPA são os principais constituintes dos óleos de peixe de regiões frias vendidos comercialmente e que vêm sendo utilizados na clínica terapêutica. DHA e EPA são derivados do ácido graxo essencial -linolênico (18:3). O aumento do consumo do ácido -linolênico pelo período de semanas a meses resulta em um aumento da proporção de EPA nos lipídios plasmáticos, eritrócitos, leucócitos, plaquetas e no leite, mas não existe aumento de DHA (BURDGE, 2002; CALDER, 2007). A produção do DHA a partir do ácido -linolênico é maior em mulheres, possivelmente devido à ação de estrógenos sobre as enzimas que regulam estas vias. Este fato é de grande importância, pois na gestação tal demanda é requerida pelo feto, uma vez que o DHA é muito importante para a formação do sistema nervoso central.

22 O consumo de alimentos ricos em DHA e EPA é muito baixo em populações ocidentais. Por este motivo a suplementação com óleo de peixe rico em ômega-3 tem tanto destaque. Os ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 amenizam os efeitos causados pela reação inflamatória exacerbada, sendo caracterizados como imunossupressores (CALDER, 2003; HUGHES et al., 1995). A suplementação com ômega-3 em humanos e animais promove a diminuição da produção de IL-2 e, conseqüentemente, da ativação de linfócitos T, sendo caracterizada como um agente depressor das funções imunes mediadas por estas células (JOLLY et al., 1998; MOLVIG et al., 1991 ; THIES et al., 2001; SADEGHI et al., 1999 ; ENDRES et al., 1989). Muitos estudos têm descrito os efeitos benéficos dos ácidos graxos ômega-3 nas doenças auto-imunes. Pacientes com artrite reumatóide, psoríase e lúpus eritematoso suplementados com óleo de peixe rico em EPA apresentaram melhora significativa devido à diminuição da função de leucócitos (HUGHES et al., 1995). Alguns estudos também têm demonstrado efeitos benéficos destes ácidos graxos em indivíduos asmáticos (HEALY et al., 2003). 1.8.2 Ácidos graxos Ômega-6 Os ácidos graxos ômega-6 são obtidos a partir de gorduras animais e vegetais. Como são precursores do ácido araquidônico (que dá origem a eicosanóides como prostaglandinas e leucotrienos), tem importante participação na resposta inflamatória, como ativação de leucócitos, vasodilatação, broncoconstrição, entre outros (WEITZBERG, 1988). Na dieta ocidental, o ômega-6 é mais consumido do que o ômega-3 e isso faz com que os produtos do metabolismo de ômega-6, como leucotrienos e prostaglandinas, aumentem em grande quantidade no organismo, podendo levar à formação de ateromas, trombos e doenças inflamatórias (SIMOPOULOS, 1999). O ácido araquidônico (AA), principal poliinsaturado presente nas membranas celulares, é formado a partir do ácido linoléico (LA), através da ação das enzimas delta 6 dessaturase, elongase e delta 5 dessaturase. Essas mesmas enzimas também atuam na formação dos ácidos graxos DHA e EPA a partir de ácido - linolênico (BERQUIN et al., 2008).

23 Ácido linoléico Figura 4 - Estrutura do Ag ômega-6, ácido linoléico. Fonte: Acervo pessoal. 1.8.3 Diferenças entre DHA e EPA Devido à diferença na estrutura química a conformação espacial do DHA e EPA é distinta. Ambos pertencem à família ômega-3. O DHA possui 22 átomos de carbono e 6 insaturações, enquanto o EPA é formado por 20 átomos de carbono e 5 insaturações. Esta diferença pode ser responsável pelos efeitos celulares distintos que estes ácidos graxos podem exercer. Hung et al. (1999) demonstraram diferenças em experimentos realizados a partir de duas preparações contendo óleo de peixe com diferentes concentrações de EPA e DHA, na produção de imunoglobulinas por linfócitos. Os autores observaram que o EPA tem uma atividade antialérgica mais intensa que o DHA. Estudos também demonstram que o DHA e EPA regulam a expressão de diferentes genes em células Jurkat (linhagem leucêmica de linfócitos T). Em estudo comparativo sobre os efeitos de DHA e EPA na expressão de genes envolvidos com diferentes aspectos da função de linfócitos, foi demonstrado que estes dois ácidos graxos podem regular a expressão de genes iguais ou diferentes. Neste estudo, do total de 83 genes analisados, 39 foram modificados por pelo menos um dos ácidos graxos testados. Houve alteração na proporção de 30 % pelo DHA e 26 % pelo EPA. O DHA aumentou a expressão de 24 genes e reduziu a de apenas um. O EPA aumentou a expressão de 13 genes e reduziu a de 9 (VERLENGIA et al., 2004 b). Os estudos que avaliam os efeitos destes dois ácidos graxos de forma isolada são muito importantes para melhorar a aplicação terapêutica dos mesmos. Estudos demonstram que o EPA é mais eficaz como imunossupressor quando comparado ao DHA. Os efeitos da suplementação com menos de 1g/dia do

24 óleo de peixe rico em DHA e EPA altamente purificado sobre a proliferação de linfócitos foram investigados em voluntários saudáveis. O óleo de peixe rico em EPA suprimiu a proliferação de linfócitos, ao passo que o DHA não teve qualquer efeito (VERLENGIA et al., 2004a). A figura 6, descreve a conversão do ácido α-linolênico através de enzimas até a beta oxidação em DHA. A figura mostra as diferenças em número de carbonos e número de insaturações. Figura 5 - Estrutura dos Ags ômega-3 EPA e DHA. Fonte: Acervo pessoal.

25 - linolênico (18:3) 18:4 20:4 EPA (20:5) DPA(22:5) (24:5) (24:6) DHA (22:6) Delta 6 dessaturase Elongase Delta 5 dessaturase Elongase Elongase Delta 6 dessaturase β oxidação Figura 6 - Conversão do Ags ômega-3 α- linolênico em EPA e DHA Fonte: Acervo pessoal Como indicado na figura 6, depois de ingerido, o ácido ALA é convertido em EPA através da ação das enzimas delta 6 dessaturase, elongase e delta 5 dessaturase. Já a conversão de EPA para DHA, além da ação de elongases e da delta 6 dessaturase, há a remoção de 3 carbonos por β-oxidação. A conversão do ácido α-linolênico é ineficiente, isso porque esse ácido graxo é usado principalmente para a obtenção de energia e apenas uma pequena quantidade é convertida em DHA. Essas conversões acontecem no retículo endoplasmático de hepatócitos (BERQUIN et al., 2008). 1.9 MECANISMOS DE AÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS NA SINALIZAÇÃO INTRACELULAR Os ácidos graxos poliinsaturados controlam a resposta imune diretamente, regulando a ativação de fatores transcricionais e indiretamente, promovendo alteração na composição lipídica da membrana celular, resultando em modificações

26 na produção de segundos mensageiros e, assim, permitindo mudanças na expressão gênica (FERNANDES et al., 1998; KELLEY et al., 2001). Os ácidos graxos ômega-3 incorporados na membrana podem afetar a sinalização celular através da produção de diacilglicerol (DAG) após a hidrólise de fosfolipídios (BORDONI et al., 1992; KUROKI et al., 1998). A incorporação de ácidos graxos-6 e ácidos graxos-3 no DAG pode levar a uma alteração da atividade das isoformas de PKC típicas e novas (MADANI et al., 2001). O ácido oléico altera a fosforilação da PKC-, que pertence à família das isoformas independentes de cálcio e DAG (GORJÃO et al., 2007a), mostrando que este ácido graxo pode modular a atividade desta proteína por uma via independente de DAG (Figura 7). A via pela qual o ácido oléico pode ativar esta proteína ainda não é conhecida. DHA, EPA, PA, SA Ras GDP PKC- GTP OA, LA _ + Ras ERK2 fosforilação DHA Shc Gab2 Grb2 PI-3K Sos AKT Inibição de proteínas pró-apoptóticas:bad, caspase 9,GSK-3 P Lipid rafts IL-2 JAK 3 P JAK 1 P P P P - DHA, EPA, PA, SA P STAT5 P NF- B AP-1 NF-AT Fos ELK-1 transcrição Proliferação celular Figura 7- Mecanismos regulados por Ags na via de sinalização de IL-2. Os ácidos docosa-hexaenóico (DHA), eicosapentaenóico (EPA), palmítico (PA) e esteárico (SA) diminuíram a proliferação de linfócitos humanos, efeito que está relacionado com a inibição da fosforilação de JAK 1 e 3, STAT5, ERK 1/2 e Akt. Já o ácido oléico (OA) e linoléico (LA) aumentaram a proliferação de linfócitos, efeito que pode estar ligado ao aumento da fosforilação da PKC- e ERK1/2. Fonte: (Adaptado de: GORJÃO et al., 2009).

27 O mecanismo exato pelo qual os ácidos graxos ômega-3 podem modular a função das células do sistema imune ainda não está bem estabelecido. Existem indícios de que estes ácidos graxos podem alterar a composição de microdomínios da membrana celular, os lipid rafts (FAN et al., 2003, FAN et al., 2004). Os lipid rafts são ricos em esfingolipídios, esfingomielina e colesterol, que é um componente estrutural fundamental. A formação destes lipid rafts na membrana pode ser regulada pelo tipo e concentração de lipídios presentes na bicamada lipídica. Diversas proteínas estão localizadas nestes microdomínios ou são recrutadas para ele durante os processos de ativação de vias de sinalização intracelulares. Um exemplo é o receptor da IL-2, que é o receptor para citocina produzida por linfócitos, auxiliando na expansão clonal e ativação destas células (LI et al., 2006). 1.9.1 Importância dos Esfingolipídios Os esfingolipídios são compostos bioativos presentes em todos os tipos celulares. O primeiro componente deste grupo identificado foi a esfingosina, que é capaz de modular a atividade de diversas proteínas pró-apoptóticas. Tanto a esfingosina como a ceramida exercem um papel muito importante na regulação do ciclo celular e apoptose (HANNUN; OBEID., 2008). As ceramidas são produzidas pela síntese de novo (via), envolvendo a ceramida sintase, através da junção de palmitato e serina, ácido esteárico, ácido oléico e linoléico. A formação de moléculas de ceramida na membrana celular também pode ocorrer por ativação da esfingomielinase (Figura 2). Também são geradas pela ação de redução da enzima ceramidase nas membranas e pela hidrólise da ceramida-1-fosfato (GRASSMÉ et al., 2007). A ceramida e a dihidroceramida podem ser consideradas o centro do metabolismo, pois ocupam a posição central na biosíntese e catabolismo dos esfingolipídios. Em muitos tipos celulares a esfingomielina está presente em concentração maior que a ceramida tornando-a uma reserva intracelular deste composto (HANNUN; OBEID., 2008). A esfingosina, gerada pela desacilação da ceramida, através da ação das ceramidases, é considerada um agente pró-apoptótico, enquanto que a esfingosina- 1-fosfato (SPP), gerada pela fosforilação da esfingosina, mediada pela esfingosina quinase, é importante no crescimento e proliferação celular (Figura 8) (ADAM et al.,

28 2002). Isto sugere que o balanço entre o conteúdo de diferentes esfingolipídios desse conjunto de reações reflete no efeito de sobrevivência ou morte celular. A esfingosina quinase 1 exerce papel fundamental na manutenção desse equilíbrio, uma vez que esta promove diminuição de ceramida e esfingosina e aumento de SPP (TAHA et al., 2006). A esfingosina 1- fosfato tem papel crucial na migração celular e inflamação (HANNUN; OBEID, 2008). Serina + palmitoilcoa SPT 3-ceto esfinganina esfinganina (Diidro)CS Galactosilceramida diidroceramida SMS esfingomielina SMase glicosil-ceramida CRS GCS ceramida CK C1PP Ceramida 1-fosfato esfingosina lactosilceramida SK S1PP glicoesfingolipídio Esfingosina 1- fosfato Figura 8 - Vias do metabolismo de esfingolipídios. As ceramidas podem ser formadas pela síntese de novo (via) ou da hidrólise de esfingomielina. A ceramida pode ser fosforilada pela ceramida quinase formando ceramida 1-fosfato ou pode servir como um substrato para a síntese de esfingomielina ou glicolipídios. A ceramida pode ser metabolizada pela ceramidase dando origem à esfingosina que é fosforilada a esfingosina 1-fosfato. Esta por sua vez pode sofrer ação de fosfatases que regeneram a esfingosina. SPT, serina palmitoiltransferase; CS, ceramida sintase; SMS, esfingomielina sintase; SMase, esfingomielinase; C1PP, ceramida 1-fosfato fosfatase; CK, ceramida quinase; SK, esfingosina quinase; S1PP, esfingosina 1 fosfatase; CRS, cerebrosidase, GCS, glicosilceramida sintase. Fonte: Adaptado de: OGRETMEN; HANNUN, 2004.

29 Na figura 9 encontram-se as diferentes estruturas químicas dos esfingolipídios. A ceramida, esfingosina e esfingosina-1-fosfato possuem uma cabeça polar, já a esfingomielina possui duas cabeças polares. Tanto a esfingomielina como a ceramida apresentam duas cadeias acil. As cadeias lipídicas de ceramidas variam em relação ao tamanho e ao número de insaturações. Estas diferenças podem estar relacionadas as diferentes intensidades de efeitos das ceramidas de tamanhos distintos. Figura 9 - Estrutura química dos esfingolipídios. S1P, esfingosina 1-fosfato, SM, esfingomielina, GlcCer, glicosilceramida. Fonte: Adaptado de: Schnaar et al., 2008. Existem evidências de que a apoptose mediada por esfingolipídios ocorra quando a esfingomielina sintase e glicosilceramidase são suprimidas, pois há um aumento dos níveis de ceramida em detrimento desta diminuição (HANNUN; OBEID., 2008). A investigação dos esfingolipídios pode ser agrupada em dois níveis: a) Nível básico, onde é preciso delinear o mecanismo específico pelo qual o metabolismo dos esfingolipídios é regulado;

30 b) Nível avançado, onde é necessário o conhecimento do lipídio específico, a organização das enzimas envolvidas nestes processos, a localização celular destas enzimas, a localização do lipídio mediador bem como a coordenação e integração destas respostas (HANNUN; OBEID 2008). Como se pode observar nos estudos realizados até o momento, algumas enzimas envolvidas com o metabolismo dos esfingolipídios exercem papel fundamental nas diversas funções celulares, seja relacionada com a sobrevivência ou com a morte celular. Desta forma, para pesquisas futuras é provável que se dê um destaque maior para as seguintes enzimas: esfingomielina sintase, ceramidase, ceramida sintase, glicosilceramidade, CERT, esfingosina 1-fosfato e esfingosina 1- fosfato liase. A ceramida possui um papel importante na ativação e regulação de fosfolipase A2, mitogênese e atividade de macrófago. A glicosilceramida tem importante implicação na resistência à quimioterápicos, pois este grupo de fármacos aumentam a atividade de glicosilceramidades, diminuindo a concentração de ceramida. Os esfingolipídios mediadores também estão presentes em diferentes organelas celulares, mas estudos mais aprofundados ainda são necessários para verificar se as mesmas podem ter comportamento diferenciado dependendo do local em que se encontra. Estima-se que 70% da esfingosina reside na membrana em ph fisiológico e se mantém 30% na fração solúvel. A ativação das proteínas quinases C (PKCs) por ceramidas está envolvida com as alterações no potencial de membrana, inibição da ativação de AKT e indução de apoptose (HANNUN; OBEID, 2008). A S-1P é a mais solúvel dos esfingolipídios e também é capaz de interagir com os receptores acoplados à proteína G na membrana celular (HANNUN; OBEID, 2008). Em experimentos in vitro, observou-se que a ceramida pode induzir grandes mudanças em mitocôndrias isoladas. Gudz et al (1997) mostraram que C2-ceramida pode inibir a fosforilação oxidativa pela interferência no transporte de elétrons no complexo III. Ela também pode aumentar a permeabilidade da membrana externa mitocondrial a proteínas como o citocromo c (MORAES, 2003). A geração de ceramida em mitocôndrias pode levar à morte celular, enquanto que a síntese em outras organelas não gera o mesmo efeito. Outras etapas importantes da morte

31 celular programada envolvem caspases que são ativadas por ceramidas (TAHA et al., 2006). Estudos recentes revelam que o aumento do aporte de palmitato tem grande efeito na acumulação de ceramida estando envolvido com a ativação da fosfatase PP2, resultando na desfosforilação e inativação da AKT, uma proteína chave para a sinalização de mediadores de insulina (HANNUN; OBEID, 2008). Estes efeitos das ceramidas podem resultar na inibição das respostas à insulina e na morte das células, sendo possível que compliquem o estado da diabetes (HANNUN; OBEID, 2008). Outro esfingolipídio bastante estudado recentemente é a esfingosina-1-fosfato no sistema nervoso central. Estudo recente indicou a esfingosina -1-fosfato como moduladora de funções neuromodulatórias do sistema nervoso central (SELLEY et al., 2009). Neste estudo foram identificados 5 tipos de receptores acoplados à proteína G e expressos em regiões distintas do cérebro de camundongos. O estudo revelou que o agonista de SP1, possui ação semelhante aos receptores de canabinóides no controle de: antinocicepção, hipotermia, catalepsia térmica e hipolocomoção. O estudo demonstrou, por exemplo, que ratos com deficiência de receptor de SP1 (S1P2) apresentam déficits auditivo e vestibular e apresentam aumento de excitabilidade de neurônios na região cortical piramidal. Já os receptores de SP1 (S1P1) aumentam a liberação de glutamato hipocampal e inibem a excitabilidade glutamaérgica no córtex (SELLEY e tal., 2009). Estes estudos demonstram a importância e destaque dos esfingolipídios também no sistema nervoso central. 1.9.2 Ceramidas De acordo com Sawai et al. (1999), a ceramida é um esfingolipídio presente na bicamada de membranas celulares, que funciona como segundo mensageiro em resposta a estímulos para indução da apoptose, diferenciação, envelhecimento e parada do crescimento celular. A esfingosina 1-fosfato (S1P), outro tipo de esfingolipídio, possui efeito contrário, induzindo a proliferação de células tumorais. Desse modo, a redução de ceramidas e o aumento de S1P estão relacionados ao desenvolvimento e

32 propagação do câncer, como a metástase e resistência à drogas anti-tumorais (OGRETMEN; HANNUN, 2004; SADDOUGHI et al., 2008). A formação de ceramidas pode ocorrer através da via de síntese de novo de ceramidas, onde novas moléculas são formadas a partir de um ácido graxo. Existem outros caminhos pelos quais as ceramidas podem ser formadas, como a partir da esfingosina-1-fosfato, esfingomielina, glicosilceramida e ceramida-1-fosfato. Todos estes esfingolipidios, além de participarem como intermediários do metabolismo e síntese de ceramidas, também atuam como moléculas efetoras na sinalização intracelular (OGRETMEN; HANNUN, 2004). Segundo Saddoughi (2008), muitos mediadores de apoptose são regulados pelas ceramidas. Portanto, uma diminuição de seus níveis endógenos, como por exemplo, através da inibição da síntese de novo, pode resultar na inibição da apoptose e indução de proliferação de células mutantes. Um efeito contrário ocorre ao aumentar os níveis de ceramidas, onde há parada do ciclo celular e indução de apoptose, demonstrando o importante papel das ceramidas nos processos de morte celular.

33 2 JUSTIFICATIVA DO ESTUDO Muitos efeitos inibitórios das ceramidas sobre a proliferação e progressão do ciclo celular apresentam relação com os efeitos dos ácidos graxos ômega-3, como inibição da Akt, p42/44 (Erk1/2) e ativação da PKC-ζ. Estudos recentes mostram que as ceramidas podem conter em sua porção acil cadeias longas provenientes de ácidos graxos poliinsaturados (ONUKi et al., 2006). A compreensão exata dos mecanismos pelos quais os ácidos graxos ômega- 3 podem regular a função do sistema imune, bem como a diferença entre eles é fundamental para que possamos utilizá-los como ferramenta para o tratamento de diversas doenças relacionadas ao sistema imunológico. Desta forma, precisamos estudar também os possíveis mediadores derivados destes ácidos graxos ou regulados por eles que possam estar envolvidos com estes efeitos.

34 3 OBJETIVOS GERAIS Avaliar o mecanismo pelo qual os ácidos graxos ômega-3 modulam a função de células Jurkat (linhagem leucêmica de linfócitos T) e o possível envolvimento dos esfingolipídios neste processo. 3.1 ESPECÍFICOS Avaliar o efeito dos ácidos graxos ômega-3 sobre a capacidade proliferativa de linfócitos na presença e ausência de um inibidor da síntese de novo de ceramida. Avaliar a fosforilação e expressão total das proteínas envolvidas com proliferação e sobrevivência celular (Jak1, p42/44 e Akt). Analisar a expressão de genes pró e anti-apoptóticos modulada pelos ácidos graxos: bad, bax, bcl-2 e bcl-xl na presença e ausência de um inibidor da síntese de novo de ceramida.

35 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 CONDIÇÕES DE CULTIVO DAS CÉLULAS JURKAT Jurkat são células de leucemia aguda de linfócitos T humanos que foram obtidas do banco de células do Rio de Janeiro. Estas células são classificadas de acordo com estudo de padronização com os seguintes fenótipos principais: CD3, CD28, CD2, CD5 e CD7 (PASETTI, 2009). As células foram mantidas em meio RPMI-1640 enriquecido com glutamina 2 mm, tamponado com bicarbonato de sódio 24 mm, HEPES 20 mm, 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos (10000 U/mL de penicilina e 10000 g/ml de estreptomicina). A cultura foi mantida a 37 o C com 5% de CO 2 e 95% de ar atmosférico. O repique de células foi realizado quando elas atingiam a concentração de 8x10 5 células/ml. 4.2 TRATAMENTO DAS CÉLULAS 4.2.1 Incubação com os ácidos graxos As células foram tratadas com os ácidos graxos EPA e DHA em concentrações que variaram de 12,5 µm a 100 µm. Esta faixa de concentração foi escolhida já que nos estudos realizados com suplementação de óleo de peixe, a concentração plasmática de ômega-3 atingida varia em torno de 20 a 75 µm (GORJÃO, 2007b). Os ácidos graxos foram inicialmente dissolvidos em etanol absoluto antes de serem adicionados à cultura de células. A concentração final de etanol no meio de cultura não excedeu 0,5 %. Esta concentração de etanol não é tóxica para as células como descrito por Siddiqui e colaboradores (2001) e foi utilizada nas células do grupo controle (sem tratamento com ácidos graxos). Após centrifugação (ALC-PK 120, Milão, Itália) por 15 min a 4 C as células foram diluídas em meio de cultura na concentração de 2x10 5 células/ml. Posteriormente, foram cultivadas em placas de 96 escavações contendo 2,0 x 10 5 células/escavação. As células foram tratadas com DHA e EPA nas concentrações acima descritas na presença e ausência de FB1 (10 µm), um inibidor da via de síntese de novo de ceramidas.

36 O período de incubação com os ácidos graxos foi realizado por 48 horas para o ensaio de proliferação, integridade de membrana celular e fragmentação de DNA e por 24 horas para os ensaios envolvendo a expressão das proteínas determinadas. O tempo de incubação dos ácidos graxos para estas avaliações foram determinadas em estudo anterior (GORJÃO et al., 2007). A utilização de períodos de incubação menores para a avaliação da expressão de proteínas é justificado porque a ativação das proteínas e expressão gênica antecede a proliferação celular. 4.2.2 Incubação com FB1 As células foram tratadas com os compostos conforme descrito acima na presença e ausência de 10 µm do inibidor FB1 (inibe ceramida sintase, impedindo a formação da ceramida pela via de síntese de novo). Quando se adiciona o inibidor FB1, ocorre o impedimento da síntese de novas moléculas de ceramida pela via de síntese novo. 4.2.3 Determinação da integridade de membrana celular por citometria de fluxo Inicialmente as células foram tratadas com os ácidos graxos conforme descrito no item 4.2.1 em placas de 24 escavações numa concentração de 4x10 6 células/ml por 48 horas. Para a análise da integridade de membrana foram retirados 500 µl da suspensão e adicionados 50 L de solução de iodeto de propídio (PI) (50 g / ml em PBS). A seguir, as células foram analisadas no citômetro de fluxo FACSCalibur (Bencton Dickinson, San Juan, CA, EUA). O PI é um composto fluorescente altamente solúvel em água que não é capaz de atravessar membranas intactas, o que permite identificar células com perda de integridade de membrana. O PI liga-se ao DNA intercalando-se entre as bases. A fluorescência emitida pelo composto foi determinada no canal FL2 (fluorescência laranja - avermelhada 585/42 nm). Dez mil eventos foram adquiridos por amostra em histogramas que foram analisados através do Cell Quest software (Becton Dickinson). Esta metodologia já foi utilizada em estudo anterior (LIMA et al., 2002). Quanto maior a fluorescência emitida, maior a quantidade de células em morte celular, pois com a membrana rompida o iodeto de propídio penetra na célula e emite fluorescência.

37 Para os ensaios de citometria de fluxo foram avaliadas as médias de três experimentos compostos por três determinações. 4.2.4 Fragmentação de DNA por Citometria de fluxo A fragmentação de DNA foi avaliada utilizando-se citometria de fluxo de acordo com o método descrito por Nicoleti et al., (1991). As células foram tratadas conforme descrito no item 4.2.1 Posteriormente, as células foram coletadas (1,5 ml) e centrifugadas. O precipitado foi ressuspenso em 500 L de uma solução hipotônica contendo iodeto de propídio 50 g/ml, 0,1% de citrato de sódio e 0,1% de Triton X- 100. Os tubos foram cobertos com papel alumínio e incubados por 30 minutos a 25 o C. A fluorescência foi determinada e analisada como descrito acima (LIMA et al., 2002). Quanto menor a fluorescência, maior é o indicativo de fragmentação de DNA (molécula menor, mais DNA fragmentado). Isso porque quanto maior a molécula de DNA maior a quantidade de iodeto de propídio incorporado (fita íntegra). 4.2.5 Determinação da proliferação celular A capacidade proliferativa foi avaliada através da incorporação de [2-14 C]- timidina no DNA das células. Resumidamente, os linfócitos foram ressuspensos em 1 ml de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino contendo antibióticos (penicilina 10.000 U e estreptomicina 10 mg/l de meio). Após a centrifugação, os linfócitos foram cultivados em placas de 96 escavações, contendo 2,5 x 10 5 células por escavação e incubados a 37 o C e atmosfera de 95 % ar 5 % CO 2 com diferentes concentrações dos ácidos graxos (12,5 a 100 µm) na presença e ausência de FB1 por 24 horas. Decorrido o período de 24 h, foi adicionado ao meio [2-14 C]-timidina (0,02 µci - 0,3 µm por escavação) e as células incubadas por mais 24 horas. Posteriormente, foi realizada a coleta automática das células utilizando coletor múltiplo Skatron Combi Multiple Cell Harvester (Sulfolk, UK). Os discos de papel contendo as células com a radioatividade incorporada foram contados em 1 ml de líquido de cintilação em contador Beckman-LS 5000TD (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).

38 Para os ensaios de proliferação foram realizados três experimentos de dez determinações. 4.2.6 Avaliação da fosforilação por western blotting Após o tratamento com os ácidos graxos nas concentrações que induzem apoptose e inibição da proliferação (50 e 75 µm) e na presença e ausência do inibidor por 24 h, as células foram imediatamente homogeneizadas em tampão de extração (Trizma-base 100 mm, ph 7,5; EDTA 10 mm; SDS 10%, fluoreto de sódio 100 mm; pirofosfato de sódio 100 mm; ortovanadato de sódio 10 mm) que foi previamente aquecido a 100 o C. A seguir, as células foram sonicadas durante um minuto com pulsos de 3 segundos (para a destruição das células) e colocadas no gelo. Após a sonicação de todas as amostras, estas foram colocadas em banho maria a 100 o C por 5 minutos seguido de centrifugação em velocidade máxima à 4 o C por 40 minutos. Os sobrenadantes foram submetidos à quantificação protéica pelo método de Bradford (1976), usando curva de albumina como padrão. As amostras das proteínas desnaturadas foram fracionadas em gel desnaturante de SDS-poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. Para o bloqueio de ligações inespecíficas, as membranas foram incubadas com PBS acrescido de 0,1% de tween 20 e 3% de albumina sérica bovina. A identificação das proteínas foi realizada através da utilização de anticorpos anti-fosfo p42/44 ( tyr 204) (1:1000), anti-fosfo Akt (ser 473), anti-fosfo Jak1 ( tyr 980), anti-p42/44, anti-akt e anti-jak1, respectivamente (Cell SignalingTecnology). Também foi aplicada a cada gel uma mistura contendo proteínas de peso molecular conhecido (padrão de peso molecular). Para a detecção foi utilizado um segundo anticorpo (anticorpo monoclonal contra a porção IgG do primeiro anticorpo) conjugado a uma peroxidase. A visualização foi evidenciada pela mistura (1:40) de reagentes do kit ECL Plus (Western blotting detection reagents, Amershan Pharmacia Biotech). Após 1 minuto, a marcação das bandas foi evidenciada através da utilização de filmes de raio-x que são sensíveis à emissão induzida pela mistura ECL. Em relação à avaliação das proteínas foram realizados três experimentos de três determinações. As intensidades das bandas das auto-radiografias foram quantificadas por densitometria óptica, utilizando o programa Image J (National Institutes of Health-

39 NIH). Para a apresentação dos resultados numéricos foi realizada a razão entre a forma fosforilada e total da expressão de cada proteína. 4.2.7 Avaliação da expressão de genes por PCR em tempo-real 4.2.7.1 Extração do RNA total das células Jurkat O RNA total foi extraído de 1x10 7 células (tratadas como descrito anteriormente por 48 h) utilizando o reagente TRIZOL (Invitrogen). As células foram centrifugadas, homogeneizadas com 1 ml do reagente de extração e incubadas à temperatura ambiente por 5 minutos. Após adição de 0,2 ml de clorofórmio, os tubos com as células foram agitados vigorosamente por 15 segundos e incubados à temperatura ambiente por 3 minutos. A separação das fases foi feita por centrifugação a 12.000 g (Eppendorf 5810 R) por 15 minutos à 4 C. O RNA presente na fase aquosa (superior) foi transferido para outro tubo, precipitado pela adição de 0,5 ml de isopropanol e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 12.000 rpm por 10 minutos, à 4 C. O sedimento foi lavado com 1 ml de etanol a 75 %, agitado em com o uso de vórtex, centrifugado a 7000 rpm por 5 minutos, seco a temperatura ambiente e ressuspenso em água contendo DEPC (dietilpirocarbonato). A concentração do RNA foi determinada por espectrofotometria (Pharmacia Biotech, Cambrigde, UK) nos comprimentos de onda de 260 nm (correspondente ao pico de absorção de RNA) e 280 nm (correspondente ao pico de absorção de proteínas). 4.2.7.2 Reação de transcrição reversa (RT) A síntese do DNA complementar (cdna) foi realizada a partir de 2 g de RNA total extraído conforme descrito anteriormente. A síntese do cdna foi realizada utilizando a seguinte mistura de reagentes: 146 ng de random primers e 200 U da enzima transcriptase reversa (RevertAid M-MuLV RT, Fermentas), tampão da enzima Tris-HCl a 50 mm (ph 8.0), KCL 75 mm, MgCl 2 3 mm, DTT a 5 mm, dntp a 500 M] em um volume final de reação de 20 L. Esta mistura final foi incubada

40 por 2 min a 25 C para permitir a hibridização dos oligonucleotídeos randômicos ao RNA, seguida de aquecimento a 42 C por 50 min. O cdna assim obtido foi armazenado a -80 C até a realização da PCR em tempo real. 4.3 QUANTIFICAÇÃO DOS mrna As seqüências dos primers específicos para a análise da expressão gênica de bax, bad, bcl-2 e bcl-xl foram designadas através do uso do banco de dados público GeneBank da National Center for Biotechnology Information (NCBI), acessado via internet (http/www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/entrez). A temperatura de hibridação dos primers e número de ciclos foram avaliados para compor o modelo de ensaio da PCR em tempo real. Os parâmetros utilizados para a realização das análises por PCR estão descritos na Tabela 3. A quantificação do mrna foi determinada utilizando-se o kit Platinum SYBR Green qpcr SuperMix-UDG (Invitrogen) através do equipamento Rotor Gene-3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Inicialmente são adicionados 2 µl da amostra de cdna em 12,5 µl do reagente Platinum SYBR Green qpcr SuperMix- UDG. O volume final é completado com água DEPC para 25 µl. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método comparativo de CT (Ct = threshold cycle; número de ciclo no qual o produto do PCR atinge um limiar de detecção). A seguinte fórmula foi utilizada para calcular a relação entre o transcrito e o gene de referência (β2m): 2 - CT, onde CT é a diferença entre o CT do gene de interesse e o de referência, e CT é igual a média do CT da amostra tratada a média do CT da amostra controle. Em relação à avaliação da expressão gênica foram realizados três experimentos de três determinações (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001; PFAFFL, 2001).

41 Tabela 3 - Parâmetros dos primers utilizados para a reação de PCR em tempo real GENE bax SEQUÊNCIA SENSE 5 GTTCGACTTTCT CTCCTACAAGC 3 SEQUÊNCIA ANTISENSE 5 -ATCCAAACT GCT GCTGTGGC 3 T.A. N.C. 59 0 C 30 bad 5' AGC CAA CCA GCA GCA GCC ATC AT 3 5' CTC CCC CAT CCC TTC GTC GTC 3 60 0 C 40 bcl-2 5'CAAAACGTCCAGAG TGCTACAAAA 3 5' CCC AGT TAA TGA TGC CGT CTT C 3 60 0 C 40 bcl-xl 5 ACAGCCCCGCGGT GAATGCGA 3 5 GAACCACGCCGGC CACAGTCAT 3 62 0 C 40 2M 5 CTC CGT GGC CTT AGC TGT G 3 5 TTT GGA GTA CGC TGG ATA GCC T 3 *T.A., temperatura de anelamento; N.C., número de ciclos. 56 o C 30 4.3.1 Análise Estatística As comparações estatísticas das médias foram realizadas por análise de variância (ANOVA) (One-way) seguida pelo teste de comparações múltiplas Tukey- Kramer. As células tratadas com DHA ou EPA em diferentes concentrações foram comparadas a coluna controle (sem tratamento). Também foram considerados os resultados comparativos entre as células tratadas com FB1 versus células tratadas somente com um dos ácidos graxos ômega-3. Foram considerados significativos os resultados que apresentaram P < 0,05. Para a realização destas análises foi utilizado o Software GraphPad Prism - versão 8.0.

42 5. RESULTADOS Na Figura 10, estão representados os histogramas referentes à perda da integridade de membrana. Pode-se observar que quando a célula perde a integridade de membrana ocorre um aumento da população na região de maior fluorescência. Neste caso, observa-se um deslocamento do pico para a direita (região M2 do histograma). Nas células tratadas a partir de 25 µm de DHA ocorreu aumento da população em M2 indicando que nestas concentrações ocorre morte celular. Na presença de FB1 (inibidor da síntese de ceramida) observa-se que nestas concentrações não ocorreu perda de integridade da membrana tão intensa como na ausência de FB1. Controle 25 µm FB1 25 µm + FB1 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 50 µm 75 µm 50 µm + FB1 75 µm + FB1 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 100 µm 100 µm + FB1 M1 M2 M1 M2 Figura 10 - Histogramas representativos da integridade de membrana de células Jurkat. Após o tratamento com concentrações crescentes de DHA na presença e ausência de FB1. M1 corresponde a porcentagem de células viáveis e M2 a porcentagem de células mortas. Na abcissa está representado a fluorescência emitida pelo iodeto de propídeo e na ordenada uma unidade de contagem arbitrária.

43 Na figura 11 e 12 observa-se a porcentagem de células com membrana íntegra após tratamento com concentrações crescentes de DHA e EPA, respectivamente. Estes ácidos graxos induziram uma diminuição da integridade de membrana a partir de 50 µm. Observou-se que as células tratadas com FB1 e DHA tiveram uma diminuição da integridade de membrana em 50, 75 e 100 µm, mas que na presença somente do DHA a perda de integridade de membrana é maior. Nas células tratadas com EPA na presença de FB1 a partir da concentração de 50 µm o efeito do ácido graxo é revertido retornando a valores próximos ao controle (sem tratamento). Na ausência de FB1, para as células tratadas com DHA, observa-se uma menor porcentagem de células com membrana íntegra (30 a 40% na faixa de concentração avaliada) permanecendo menos viáveis do que quando comparadas com aquelas tratadas com EPA (integridade de membrana de 65 a 82%).

44 Concentração DHA (µm) Figura 11 - Efeito de diferentes concentrações do ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a integridade de membrana celular. Para a avaliação da integridade de membrana, as células Jurkat foram tratadas em placas de 24 escavações numa concentração de 4x10 6 células/ml por 48 horas com DHA (nas concentrações de 25 a 100 µm) na presença e ausência do inibidor da síntese de novo de ceramida, FB1 (10 µm). A seguir, as células foram analisadas no citômetro de fluxo após a exposição ao iodeto de propídio. Os valores são apresentados como a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. *P<0,05 vs controle (0 µm). P < 0,05 vs tratamento com o DHA sem FB1.

45 Figura 12 - Efeito de diferentes concentrações do ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a integridade de membrana celular. Para a avaliação da integridade de membrana, as células Jurkat foram tratadas em placas de 24 escavações numa concentração de 4x10 6 células/ml por 48 horas com EPA (nas concentrações de 12,5 a 100 µm) na presença e ausência do inibidor da síntese de novo de ceramida, FB1 (10 µm). A seguir, as células foram analisadas no citômetro de fluxo após a exposição ao iodeto de propídio. Os valores são apresentados como a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. *P<0,05 vs controle (0 µm). P < 0,05 vs tratamento com o EPA sem FB1. Na Figura 13 estão apresentados os histogramas representativos da avaliação de fragmentação de DNA nas células tratadas com concentrações crescentes de DHA na presença e ausência de FB1. As células com DNA íntegro apresentaram uma maior fluorescência em M2 no tratamento na presença de FB1. No tratamento apenas com o DHA, a maior população de células está presente na região M1, em concentrações acima de 50 µm. Neste caso, ocorre maior fragmentação do DNA e a fluorescência acontece com menor intensidade.

46 Controle 25 µm FB1 25 µm + FB1 M1 M2 50 µm 75 µm 50 µm + FB1 75 µm + FB1 M1 M2 M1 M2 100 µm 100 µm + FB1 M1 M2 Figura 13 Histogramas representativos da fragmentação de DNA em células Jurkat após tratamento com DHA na presença e ausência de FB1. A região M2 dos histogramas corresponde ao número de células com DNA íntegro e a região M1 às células com DNA fragmentado (apoptose). Na abcissa está representado a fluorescência emitida pelo iodeto de propídeo e na ordenada uma unidade de contagem arbitrária. As figuras 14 e 15 mostram a quantificação da porcentagem de células com DNA fragmentado após tratamento com DHA e EPA, respectivamente. As células tratadas somente com o DHA apresentaram fragmentação do DNA significativa, a partir da concentração de 50 µm (15% de células fragmentadas). Este fato é indicativo de morte celular. Quando as células são tratadas com EPA apresentam uma maior fragmentação a partir da concentração de 25 µm (70% de células fragmentadas). Este efeito é revertido na presença de FB1, inibidor de ceramida sintase, onde se observa uma diminuição da porcentagem de células com DNA fragmentado tanto no tratamento com DHA como com EPA.

47 No tratamento com 25 µm de DHA observa-se 85% de células com membrana íntegra e 6% com fragmentação de DNA. Na concentração de 50 µm, observa-se 30% de células com membrana íntegra e 15% com fragmentação de DNA. Nas células tratadas com EPA na concentração de 25 µm, observa-se 80% de integridade de membrana e 70% de DNA fragmentado. Nas células tratadas com EPA ocorre uma elevada fragmentação de DNA, que é superior a perda de integridade de membrana em todas as concentrações analisadas indicando morte por apoptose. Quando a concentração de EPA aumenta para 50 µm, as células apresentam 82% de integridade de membrana e 80% de DNA fragmentado. Comparando os resultados observados para os dois ácidos graxos, observamos que a toxicidade de DHA pode estar relacionada com a ocorrência de necrose, enquanto EPA induz apoptose.

48 (µm) Figura 14 - Efeito de diferentes concentrações do ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fragmentação de DNA. Para a avaliação da fragmentação de DNA, as células Jurkat foram tratadas em placas de 24 escavações numa concentração de 4x10 6 células/ml por 48 horas com DHA (nas concentrações de 25 a 100 µm) na presença e ausência do inibidor da síntese de novo de ceramida, FB1 (10 µm). Posteriormente, as células foram coletadas e centrifugadas. O precipitado foi ressuspenso em uma solução hipotônica contendo iodeto de propídio 50 g/ml, 0,1% de citrato de sódio e 0,1% de Triton X-100 e incubados por 30 minutos a 25 o C. A seguir, as células foram analisadas no citômetro de fluxo. Os valores são apresentados como a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. *P<0,05 vs controle (0 µm). P < 0,05 vs tratamento com o DHA sem FB1.

49 Figura 15 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fragmentação de DNA. Para a avaliação da fragmentação de DNA, as células Jurkat foram tratadas em placas de 24 escavações numa concentração de 4x10 6 células/ml por 48 horas com DHA (nas concentrações de 12,5 a 100 µm) na presença e ausência do inibidor da síntese de novo de ceramida, FB1 (10 µm). Posteriormente, as células foram coletadas e centrifugadas. O precipitado foi ressuspenso em uma solução hipotônica contendo iodeto de propídio 50 g/ml, 0,1% de citrato de sódio e 0,1% de Triton X-100 e incubados por 30 minutos a 25 o C. A seguir, as células foram analisadas no citômetro de fluxo. Os valores são apresentados como a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. *P<0,05 vs controle (0 µm). P < 0,05 vs tratamento com o EPA sem FB1. Na figura 16 pôde-se observar que o DHA promoveu inibição da capacidade proliferativa de células Jurkat a partir de 25 µm. Nas concentrações acima de 50 µm o efeito inibitório deste ácido graxo foi revertido pelo tratamento com FB1. Em 100 µm o DHA promoveu inibição quase total da proliferação e na presença de FB1 este efeito foi acentuadamente revertido. A proliferação das células Jurkat no tratamento com 100 µm + FB1 é 96% maior em relação ao tratamento feito somente com o ácido graxo DHA. Este efeito é justificado pela ausência de ceramida na presença do inibidor FB1.

50 (µm) Figura 16 - Efeito de diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a proliferação de Jurkat. Avaliação da proliferação de células Jurkat após tratamento com DHA na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações crescentes de DHA na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas. Posteriormente, [2-14 C] timidina (1µCi/ml) foi adicionada ao meio e as células incubadas por mais de 24 horas. A radioatividade foi analisada usando um contador de líquido de cintilação. Os valores são apresentados como média ± EPM de 10 determinações de 3 experimentos. * P< 0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o DHA sem FB1. Na figura 17 pode-se observar que o EPA promoveu inibição significativa da capacidade proliferativa de células Jurkat a partir de 12,5 µm. Em todas as concentrações o efeito inibitório deste ácido graxo foi revertido pelo tratamento com FB1. Em 100µM o EPA promoveu inibição quase total da proliferação e na presença de FB1 este efeito foi acentuadamente revertido. A proliferação das células Jurkat no tratamento com 100 µm + FB1 é 83% maior em relação ao tratamento feito somente com o ácido graxo EPA.

51 Figura 17 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a proliferação de Jurkat. Avaliação da proliferação de células Jurkat após tratamento com EPA na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações crescentes de EPA com e sem 10 µm de FB1 por 24 horas. Posteriormente, [2-14 C] timidina (1µCi/ml) foi adicionada ao meio e as células incubadas por mais de 24 horas. A radioatividade foi analisada usando um contador de líquido de cintilação. Os valores são apresentados como média EPM de 10 determinações de 3 experimentos. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o EPA sem FB1. A tabela a seguir (tabela 4) representa as principais diferenças em relação às concentrações tóxicas e de inibição da proliferação celular entre os dois ácidos graxos ômegas-3 avaliados. A tabela indica a concentração mínima significativa para DHA e EPA em relação à avaliação de integridade de membrana, fragmentação de DNA e proliferação celular, respectivamente.

52 Tabela 4 - Concentrações Tóxicas de DHA e EPA Parâmetro avaliado DHA EPA Perda de Integridade 50 µm 100 µm Membrana Aumento da 50 µm 25 µm Fragmentação DNA Inibição da Proliferação 25 µm 12,5 µm As figuras 18 e 19 mostram a avaliação da fosforilação das proteínas Akt e p42/44 por western blotting, nas células tratadas com DHA nas concentrações de 50 e 75 µm. Na ausência do inibidor de síntese de ceramida e presença do DHA, ocorre diminuição da fosforilação destas proteínas. Já quando FB1+DHA são adicionados ao sistema ocorre aumento da fosforilação destas proteínas por inibição da ceramida sintase. Na concentração de 75 µm de DHA, a fosforilação das proteínas Akt e Erk 1/2 é quase totalmente inibida.

53 Figura 18 Efeito de diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fosforilação da proteína Akt em células Jurkat. A avaliação da fosforilação da proteína Akt em ser 473 foi realizada por western blotting após o tratamento com o DHA na concentração de 50 e 75 µm e na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas. Os valores estão apresentados como a razão entre a quantidade fosforilada pela total (média ± EPM de 3 experimentos). A figura mostra blots representativos que foram reproduzidos três vezes. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o DHA sem FB1.

54 Figura 19 - Efeito de diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fosforilação da proteína p42/44 em células Jurkat. A avaliação da fosforilação da proteína p42/44 em tyr204, foi realizada por western blotting após o tratamento com o DHA na concentração de 50 e 75 µm e na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas.os valores estão apresentados como a razão entre a quantidade fosforilada pela total (média ± EPM de 3 experimentos). A figura mostra blots representativos que foram reproduzidos três vezes. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o DHA sem FB1. A figura 20 representa a avaliação da fosforilação da proteína Jak1 por western blotting nas células tratadas com DHA nas concentrações de 50 e 75 µm. Na ausência do inibidor da síntese de ceramida e presença do DHA, ocorre diminuição da fosforilação desta proteína. Quando FB1+DHA são adicionados ao sistema ocorre aumento da fosforilação desta proteína por inibição da ceramida sintase.

55 Figura 20 Efeito das diferentes concentrações de ácido docosa-hexaenóico (DHA) sobre a fosforilação da proteína Jak em células Jurkat. A avaliação da fosforilação da proteína Jak em tyr980 foi realizada por western blotting após o tratamento com o DHA na concentração de 50 e 75 µm e na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas. Os valores estão apresentados como a razão entre a quantidade fosforilada pela total (média ± EPM de 3 experimentos). A figura mostra blots representativos que foram reproduzidos três vezes. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o DHA sem FB1. As figuras 21 e 22 representam a avaliação da fosforilação das proteínas Akt e p42/44 nas células tratadas com EPA nas concentrações de 50 e 75 µm por western blotting. Quando FB1+EPA é adicionado ao sistema ocorre aumento da fosforilação destas proteínas por inibição da ceramida sintase, na ausência do inibidor de ceramida e presença do EPA, ocorre diminuição da fosforilação destas proteínas por aumento de ceramida no sistema. Na concentração de 75 µm de EPA, a proteína Akt e p42/44 quase não são expressas.

56 Figura 21 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fosforilação da proteína Akt em células Jurkat. A avaliação da fosforilação da proteína Akt em ser473 foi realizada por western blotting após o tratamento com o EPA na concentração de 50 e 75 µm e na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas. Os valores estão apresentados como a razão entre a quantidade fosforilada pela total (média ± EPM de 3 experimentos). A figura mostra blots representativos que foram reproduzidos três vezes. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o EPA sem FB1.

57 Figura 22 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fosforilação da proteína p42/44 em células Jurkat. A avaliação da fosforilação da proteína p42/44 foi realizada por western blotting após o tratamento com o EPA na concentração de 50 e 75 µm e na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas. Os valores estão apresentados como a razão entre a quantidade fosforilada pela total (média ± EPM de 3 experimentos). A figura mostra blots representativos que foram reproduzidos três vezes. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o EPA sem FB1. A figura 23 representa a avaliação da fosforilação da proteína Jak1 por western blotting nas células tratadas com concentrações de 50 e 75 µm de EPA. Na ausência do inibidor de ceramida e presença do EPA, ocorre diminuição da fosforilação desta proteína por aumento de ceramida no sistema. Quando FB1 é adicionada este efeito é revertido.

58 Figura 23 - Efeito de diferentes concentrações de ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre a fosforilação de proteínas Jak em células Jurkat. A avaliação da fosforilação da proteína Jak em tyr 980 foi realizada por western blotting após o tratamento com o EPA na concentração de 50 e 75 µm e na presença ou ausência de FB1 (10 µm) por 24 horas. Os valores estão apresentados como a razão entre a quantidade fosforilada pela total (média ± EPM de 3 experimentos). A figura mostra blots representativos que foram reproduzidos três vezes. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratamento com o EPA sem FB1. A tabela a seguir (tabela 5) resume a porcentagem de inibição da fosforilação das proteínas AKT, ERK e JAK1 respectivamente, na concentração de 50 µm por DHA e EPA. Quando foi realizada a análise estatística entre DHA e EPA em relação à fosforilação de proteínas não foi encontrada diferença. Tabela 5 - Porcentagem de Inibição da Fosforilação de Proteínas por DHA e EPA (50 µm) Avaliação Porcentagem Inibição DHA Porcentagem Inibição EPA AKT 58% 48% ERK 53% 53% JAK 1 62% 59%

59 Na figura 24 está representada a expressão do gene bax nas células tratadas com 50 e 75 µm de DHA. De acordo com os resultados obtidos observa-se que nestas concentrações ocorreu aumento da expressão do gene pró-apoptótico bax. Quando FB1 foi adicionada ao sistema ocorreu uma menor expressão do gene que codifica esta proteína. Figura 24 Efeito de DHA sobre a expressão gênica de bax na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de DHA com e sem 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bax foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratados com FB1+ DHA. Na figura 25 está representada a expressão do gene bax nas células tratadas com 50 e 75 µm de EPA. De acordo com os resultados obtidos nas células tratadas com EPA na concentração a partir de 50 µm há um aumento de ceramida e consequentemente, da expressão de bax, que é pró-apoptótico. Quando FB1 foi adicionada ao sistema ocorreu uma menor expressão do gene que codifica a Bax.

60 Figura 25 - Efeito de EPA sobre a expressão gênica de bax na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de EPA na presença e ausência de 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bax foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratados com FB1+DHA. Nas figuras 26 e 27 estão representadas a expressão do gene bad nas células tratadas com 50 e 75 µm de DHA e EPA respectivamente. De acordo com os resultados obtidos não ocorreu alteração na expressão deste gene em nenhum dos tratamentos.

61 Figura 26 - Efeito de DHA sobre a expressão gênica de bad na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de DHA na presença e ausência de 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bad foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações.

62 Figura 27 - Efeito de EPA sobre a expressão gênica de bad na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de EPA com e sem 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bad foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. Nas figuras 28 e 29, observa-se o efeito do tratamento com DHA e EPA respectivamente, na expressão da proteína anti-apoptótica bcl-2. O DHA promoveu diminuição da expressão do gene que codifica a proteína Bcl-2 (anti-apoptótica), Na presença de FB1 este efeito foi revertido e observa-se um aumento da expressão deste gene. O mesmo efeito foi observado nas células tratadas com EPA.

63-2 Figura 28 - Efeito do DHA sobre a expressão gênica de bcl-2 na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de DHA na presença e ausência de 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bcl-2 foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratados sem FB1.

64-2 Figura 29 - Efeito do EPA sobre a expressão gênica de bcl-2 na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de EPA na presença e ausência de 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bcl-2 foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratados sem FB1. Nas figuras 30 e 31, observa-se que o tratamento com DHA e EPA promoveu diminuição da expressão do gene que codifica a proteína Bcl-xl (anti-apoptótica). Na presença de FB1 este efeito foi revertido e observa-se um aumento da expressão deste gene.

65 Figura 30 - Efeito do DHA sobre a expressão gênica de bcl-xl na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de DHA na presença e ausência de 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bcl-xl foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações. * P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratados sem FB1.

66 Figura 31 - Efeito do EPA sobre a expressão gênica de bcl-xl na presença e ausência de FB1. As células foram incubadas com concentrações de 50 e 75 µm de EPA na presença e ausência de 10 µm de FB1 por 24 horas. A expressão do mrna referente à proteína bclxl foi realizada por PCR em tempo real. O valor da quantificação relativa de cada gene alvo foi expresso através do método 2 - CT levando em consideração o gene da proteína 2M. Os resultados representam a média ± EPM de 3 experimentos de 3 determinações.* P<0,05 vs controle (0 µm). P<0,05 vs tratados sem FB1. A tabela 6 mostra a porcentagem de aumento na expressão dos genes (bax e bad) e de diminuição dos genes (bcl-2, bcl-xl) por DHA e EPA na concentração de 50 µm. Na análise comparativa entre os dois ácidos graxos não foi encontrada diferença significativa entre os efeitos exercidos pelos dois ácidos graxos. Tabela 6 - Expressão de Genes pró e anti-apoptóticos (50 µm) Genes DHA EPA bax 173% 180% bad não significativo não significativo bcl-2 28% 36% bcl-xl 62% 66%