ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES E ANTIMICROBIANAS DE TRÊS ESPÉCIES DA FAMÍLIA DAS EUPHORBIACEAES. Hellen Mariana Ferreira 1 ; Josiane Bovi Françóia 1 ; José Hilton Bernardino De Araújo 2 1. Aluna do segundo ano do Curso Técnico integrado em Informática da UTFPR Câmpus Campo Mourão 2. Professor orientador do Câmpus Campo Mourão, UTFPR 1 INTRODUÇÃO As plantas medicinais vêm sendo utilizadas há milênios por povos indígenas com fins medicinais. Diversos desses conhecimentos foram difundidos com o surgimento das civilizações modernas. Nos dias de hoje, os cientistas vem mostrando um grande interesse em comprovar os potenciais curativos de plantas utilizadas e aprovadas pelo conhecimento popular. Por outro lado, devido ao desconhecimento da possível existência da ação tóxica, bem como de sua indicação adequada, as plantas medicinais são muitas vezes usadas de forma incorreta, não produzindo o efeito desejado (PEREIRA et al., 2004). A medicina popular tem alimentado a procura, induzindo pesquisadores a se voltarem para pesquisa, de novas fontes para o conhecimento de princípios ativos capazes de solucionar ou amenizar problemas relacionados à saúde, com a contribuição das informações guardadas por aqueles que a conhecem, podendo haver descobertas promissoras. Tendo em vista que bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos representam um desafio no tratamento de infecções, é notória a necessidade de encontrar novas substâncias com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a esses microrganismos (PEREIRA, 2004). 2 OBJETIVO Este trabalho teve por objetivo comparar a atividade antioxidante e a ação antimicrobiana de soluções do látex de Synadenium grantii Hook. F. (leitosa), Jatropha curcas L. (pinhão manso) e Euphorbia tirucalli L. (aveloz) em diferentes concentrações e sua inibição no crescimento das bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Klebsiella sp. Além disso, comparar o efeito inibitório com um ntibiótico comercial e identificar a presença de compostos fenólicos no látex das plantas. 3 MATERIAL E MÉTODOS - COLETA DAS PLANTAS: As plantas utilizadas nos testes foram coletadas nas dependências da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), campus Campo Mourão PR, que tem um Clima subtropical úmido mesotérmico, nos meses de junho e julho de 2011, entre o outono e o inverno. As coletas eram efetuadas no período da manhã e da tarde. As temperaturas nesse período variaram de 12 a 26ºC. A Synadenium grantii Hook F. foi identificada pelo professor Dr. J. Cordeiro de Barbosa do Museu Botânico Municipal de Curitiba PR (MBM) com número de voucher 8378. O látex da Jatropha curcas L. utilizada nos testes foi coletado de um espécime com três anos de plantio, sendo identificada pelo professor Dr. Marcelo Galeazzi Caxambu, responsável pelo Herbário da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus
Campo Mourão (HCF), com número de voucher 1975. A Euphorbia tirucalli L. também foi identificada pelo professor Marcelo G. Caxambu, com número de voucher 5981. O látex das plantas foi coletado com incisões no caule, recolhendo-se em tubos de ensaio previamente esterilizados, e encaminhados para o laboratório para os testes. - CEPAS ULTILIZADAS NOS TESTES Para os testes de atividade antimicrobiana as linhagens utilizadas foram das bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Klebsiella sp. obtidas junto ao Laboratório de Análises Clínicas São Gabriel localizado no município de Campo Mourão. Para a utilização dos microrganismos nos testes de atividade antimicrobiana, a cepa foi repicada para tubos de ensaio contendo caldo nutriente e incubadas em estufa bacteriológica por 24 horas à 37ºC para serem reativadas. - PREPARO DO MEIO DE CULTURA: O meio de cultivo foi preparado no laboratório de microbiologia do campus, de acordo com as indicações do Manual Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos, elabora pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2002). Foi utilizado o Ágar Mueller- Hinton como meio de cultura devido a sua excelência de crescimento das bactérias utilizadas nos testes, relatado em vários artigos e por ser o mais usado em laboratórios de microbiologia devido sua eficiência. Os fatores de diluição foram combinados com a turvação da escala 0,5 de Mc Farland (aproximadamente 10-8 UFC/mL) e em seguida 0,2mL de cada solução contendo o microrganismo, já obedecendo os padrões de turbidez, foi espalhado na superfície da placa de petri com o auxílio da alça de drigalsky durante um tempo de 5 a 10 minutos, suficiente para que a alíquota fosse absorvida e a superfície ficasse em igualdade de crescimento microbiano. - PREPARO DA SOLUÇÃO DOS LÁTEX: Foram efetuados três testes para cada concentração de látex diluído em água destilada esterilizada, além disso, cada teste foi realizado em triplicata. As concentrações utilizadas foram: 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 e 1,00% (v/v). O látex era coletado em água destilada à 4ºC em erlenmeyer no mesmo dia de sua utilização para evitar-se coagulação do mesmo. - PREPARO E INSERÇÃO DOS DISCOS CONTENDO O LÁTEX: Foi utilizando a metodologia de Kirby-Bauer citado por Okura e Rende (2008), que se pode proporcionar a constatação da atividade antimicrobiana do látex. Embebeu-se a solução diluída de látex em papel filtro recortado com diâmetro de 5mm (área total de 20mm2) previamente esterilizados. Para a absorção do liquido excedente nos discos, os mesmos foram dispostos sobre uma placa de Petri contendo filtro de papel estéril, em seguida colocado nas placas contendo os inóculos e levados para incubação por 24h a 37ºC. Discos contendo apenas água destilada e esterilizada também foram testados como controle negativo. Ao final os discos de papel de área equivalente a 20mm2 receberam 20 µl das soluções do extrato resultando nas concentrações de 0,001mg.mm-2, 0,002mg.mm-2, 0,005mg.mm-2, 0,01mg.mm-2 e 0,02mg.mm-2 que posteriormente foram aplicadas às placas e incubadas a 37 ºC durante 24 horas em posição invertida. Após o período de incubação foram realizadas leituras visuais observando-se os halos de inibição de crescimento bacteriano e quantificado em milímetros com o auxílio de paquímetro. Foram realizados três ensaios independentes para cada um dos três testes de atividade antimicrobiana, ou seja, três placas para cada concentração da solução do látex para cada um dos três testes realizados. - CONTROLE COM ANTIBIÓTICO: As soluções do antibiótico amoxicilina fabricado pelo laboratório Multilab foram preparadas na mesma concentração que a do látex da planta, sendo dissolvidos em água destilada estéril e posteriormente testadas.
- PREPARO FENÓLICOS DO LÁTEX PARA IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS A análise de cromatografia líquida de alta eficiência é utilizada para quantificar a presença de compostos fenólicos individuais. Foi utilizado um sistema Dionex Ultimate 3000 HPLC (Dionex, Idstein, Alemanha) equipado com uma bomba Ultimate 3000, coluna do compartimento de amostra Ultimate 3000, detector de fotodiodo Ultimate 3000 e software Chromeleon para qualificação e quantificação dos compostos fenólicos. Foi utilizado uma coluna de fase reversa Acclaim 120, C18 5 mm 120 A (4,6 mm x 250 mm) para a separação dos compostos fenólicos. A coluna foi mantida a 40 C durante toda a análise e a detecção realizada em três comprimentos de onda (280, 300 e 320 nm). O volume de injeção das amostras foi de 10,0 µl. A fase móvel (A) foi composta de água acidificada com ácido fosfórico 1% e metanol fase (B). A eluição dos compostos fenólicos foi realizada através de gradiente entre as duas fases móveis, onde no tempo de 45 minutos a coluna foi mantida com 100% de fase móvel B por 5 minutos. Após este período, a fase (B) foi reduzida gradualmente até as condições iniciais de injeção para o condicionamento da coluna (95% A e 5% B), trabalhando-se com uma vazão de 1,0 ml/min. Os padrões de ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafêico, ácido p-cumárico, ácido ferrúlico, rutina, catequina, miricetina, quercetina e kaempferol foram utilizados para a identificação e quantificação dos compostos fenólicos. O látex das plantas foi centrifugado para retirar as impurezas. O sobrenadante, então, foi retirado e congelado para posteriormente ser analisado por cromatografia em HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Antes de ser injetado no aparelho o látex foi descongelado e dele, foi retirado uma alíquota de 1,0 ml que foi filtrado através de uma membrana porosa, para ser determinado os compostos fenólicos presentes. - DETERMINAÇÃO DA CURVA DO DPPH: Para o preparo da solução de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) foi dissolvido 2,4 mg de DPPH em 100 ml de alcool metílico absoluto, que foi homogeneizado e trasnferido para um frasco de vidro âmbar, devidamente etiquetado. A determinação da curva do DPPH foi feita a partir da solução inicial de DPPH (60 µm). Em seguida foi transferida uma alíquota de 3,5 ml de cada solução de DPPH para cubetas de vidro e realizada a leitura em espectrofotômetro a 515 nm. Foi utilizado o álcool metílico, como branco, para calibrar o espectrofotômetro. - DETERMINÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE: A atividade antioxidante (AA) total foi avaliada através do radical DPPH (1,1- difenil-2- picrilhidrazil) de acordo com o método descrito por Mensor et al. (2001) com modificações, onde o meio reacional (látex + solução de DPPH + metanol absoluto) foi de um volume de 3,5 ml. Para cada amostra, foi realizado em paralelo, para a correção de uma possível contribuição da coloração dos látex, um teste branco consistindo do volume do extrato (0,1 ml) e 3,4 de metanol absoluto. O controle foi preparado misturando 1,0 ml de solução de DPPH (0,06 mm) com 2,5 ml de metanol absoluto. Após um período de 45 minutos de incubação no escuro em temperatura ambiente, as absorbâncias das amostras foram registradas contra um branco em 515 nm. Os testes foram realizados em triplicata. A inibição do radical livre DPPH (em %) foi calculada pela seguinte equação: AA% = 100 [(Aa Ab) x 100] / Ac. 4 RESULTADO E DISCUSSÃO - INIBIÇÃO MICROBIANA: A atividade antimicrobiana in vitro mostrou que as espécies botânicas Synadenium grantii Hook F., Jatropha curcas L., e Euphorbia tirucalli testadas nos três microrganismos, apresentaram ação inibitória reduzida. Os melhores resultados foram observados na inibição do crescimento da Escherichia coli.. O
aveloz também demonstrou efeito inibitório para a Staphylococcus aureus, nos demais casos, a inibição não foi verificada. O antibiótico usado como controle apresentou inibição para todas as bactérias testadas. A atividade antimicrobiana in vitro mostrou que as espécies botânicas Synadenium grantii Hook F., Jatropha curcas L., e Euphorbia tirucalli testadas nos três microrganismos, apresentaram ação inibitória reduzida. Os melhores resultados foram observados na inibição do crescimento da Escherichia coli.. O aveloz também demonstrou efeito inibitório para a Staphylococcus aureus, nos demais casos, a inibição não foi verificada. O antibiótico usado como controle apresentou inibição para todas as bactérias testadas. - IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS Após a análise cromatográfica pela técnica de HPLC, no látex de Jatropha curcas L. observou-se a presença de rutina. Para a Synadenium grantii. Hook F, e Euphorbia tirucalli L. a análise cromatográfica não demonstrou a presença de nenhum dos compostos fenólicos testados no látex. Os cromatogramas do látex das plantas mostraram que poucos compostos fenólicos estão presentes, sendo apenas quantificada a rutina na Jatropha curcas L., que é um biflavonóide, conhecido também como vitamina P, mesmo assim, em pequena quantidade. No entanto, outros picos não identificados podem ser observados, estes podem sugerir compostos que apresentam ação antioxidante, ou podem ser responsáveis pela ação antimicrobiana, ou que justifiquem seu uso na medicina popular como agente cancerígeno, ou no combate a diversos tipos de doenças. Outros estudos devem ser realizados para analisar e quantificar esses picos e verificar se são eles os responsáveis pela ação no combate as doenças, ou se apresentam alguma ação que possa indicar seu uso na produção de fármacos ou outros medicamentos. - DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE A partir destes resultados é possível afirmar que o látex do pinhão manso possui um potencial de atividade antioxidante elevado, devido à média obtida de 274,8%. O látex da leitosa também apresenta índice bastante elevado com média de 204,8. O látex do aveloz também apresentou um elevado potencial antioxidante, com média de 214,2%. Quando comparamos o potencial antioxidante das soluções do látex das três plantas percebemos que o maior potencial antioxidante observado foi para o do pinhão manso, em seguida, o látex do aveloz e por último o látex da leitosa. 5 CONCLUSÃO Neste trabalho verificamos que as soluções contendo o látex de Synadenium grantii Hook. F. e de Jatropha curcas L. inibiram de forma satisfatória o crescimento do microrganismo Escherichia coli, não observando o mesmo efeito inibitório para as bactérias Staphylococcus aureus, e Klebsiella sp. O látex de Euphorbia tirucalli inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli e Staphylococcus aureus, não tendo o mesmo efeito para a bactéria Klebsiella sp. Vale ressaltar que o látex das plantas estudadas encontrava-se em estado bruto, não sendo purificado de nenhuma forma, por isso, faz-se necessário realizarem-se novas pesquisas para separação dos compostos do látex e verificar qual deles é o principal responsável pelo efeito inibitório do crescimento das bactérias. Também se confirmou o potencial antioxidante do látex das três plantas. Além disso, por meio de cromatografia HPLC, pode-se verificar a presença do composto fenólico rutina no látex do pinhão mando (Jatropha curcas L.), não se observando a presença de nenhum dos dez compostos fenólicos analisados no látex das outras plantas Synadenium grantii Hook F. e Euphorbia tirucalli L. Mas, diversos picos no cromatograma foram verificados, e que devem ser analisados com outros padrões fenólicos, por cromatografia HPLC ou por espectrometria de massa em outros trabalhos. O látex da leitosa, do pinhão manso e do aveloz se mostrou eficiente para os testes antimicrobianos
realizados, dessa forma, podemos considerar esse resultado positivo, mas sem deixar de salientar que se deve tomar uma série de precauções para a utilização do látex, pois se sabe que seres humanos consomem esse composto por via oral a fim de diminuir ou acabar com dores gástricas, entre outras doenças e, portanto podem estar diante de um risco para a saúde quando o ingerem, por isso devem-se realizar novas pesquisas com o mesmo rigor científico e seriedade para estudar a toxicidade da planta para que a população em geral, e não apenas a científica, saibam dos riscos e benefícios em se consumir remédios fitoterápicos como as plantas em questão. Também se confirmou o potencial antioxidante das plantas estudadas, em especial, o pinhão manso. A atividade antioxidante elevada do látex auxilia na neutralização dos radicais livres, prejudiciais à saúde humana. 6 REFERENCIAS AGRA, M. F.; SILVA, K. N.; BASÍLIO, I. J. L. D.; FRANÇA, P. F.; BARBOSA-FILHO, J. M., 2008. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil. Revista Brasileira de Farmacognosia [online], João Pessoa, v. 18, n. 3, ago. 2008. ANVISA. Descrição dos Meios Microbiológicos. Módulo IV. 2002. CAETANO, N.; SARAIVA, A.; PEREIRA, R.; CARVALHO, D.; PIMENTEL, M. C. B.; MAIA, M. B. S.; Determinação de atividades antimicrobiana de extratos de plantas de uso popular como antiflamatório. Rev Bras Farmacognosia 12(Supl.): 132-135, 2002. CAPASSO, R.; IZZO, A. A.; PINTO, L.; BIFULCO, T.; VITOBELLO, C.; MASCOLO, N., 2000. Phytotherapy and quality of herbal medicines. Journal of Phytotherapy [online], v. 71, n. 1, ago. 2000. SILVEIRA, P. F.; BANDEIRA, M. A. M.; ARRAIS, P. S. D., 2008. Farmacovigilância e reações adversas às plantas medicinais e fitoterápicos: uma realidade. Revista Brasileira de Farmacognosia. Vol. 18, n 4, 2008 SPANOS, A.; WROLSTAD, E., HEATHERBELL, A., 1990. Influence of procedure and storage on the phenolic composition apple juice. J. Sci. Food Agric., 38, 1572-1579. TARR, P. I. Escherichia coli: Overview of clinical and epidemiological issues. Journal of Food Protection, v. 57, n.. 7, p. 632-636, 1994. TRABULSI, L. R. Typical and atypical enteropathogenic Escherichia coli. Emerging Infectious Diseases, Vol 8, n 5, 2002. TUROLLA, M. S. R.; NASCIMENTO, E. S., 2006. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos utilizados no Brasil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. Vol 42, n 2, 289-306, 2006. AGRADECIMENTOS À Fundação Araucária pela concessão de bolsas do Programa de Iniciação Científica do Ensino Médio.