EFEITO DA TEMPERATURA E CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO SOBRE A COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS DE Heterochlorella luteoviridis T. Menegol, D. Vargas, E. Rodrigues, R. Rech Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos Caixa Postal 15090 CEP 91501-970 Porto Alegre RS Brasil, e-mail: (rrech@ufrgs.br) RESUMO Este trabalho avaliou a influência da temperatura (22 C, 27 C e 32 C) e da concentração de nitrogênio (75 mg L -1, 150 mg L -1, 225 mg L -1, 300 mg L -1 e 375 mg L -1 de NaNO 3) sobre a formação e a composição de lipídios de Heterochlorella luteoviridis utilizando um delineamento experimental hexagonal. Os teores de lipídios na biomassa variaram entre 63,7 mg g -1 e 90,2 mg g -1. A composição qualitativa dos ácidos graxos foi semelhante em todos os tratamentos. O teor médio de ácidos graxos saturados foi 50,6 ± 1,5 %. Os teores de ácidos graxos monoinsaturados e poli-insaturados variaram de 9,6 a 14,7 % e de 34,4 a 40,7 % do total de ácidos graxos, respectivamente. Os ácidos graxos essenciais, ácido linoleico (LA - ω6) e α-linolênico (ALA ω3) forma os principais constituintes dos ácidos graxos poli-insaturados. Também se observou a presença dos ácidos eicosapentaenoico (EPA) e docosaexaenoico (DHA). ABSTRACT This study evaluated the influence of temperature (22 C, 27 C and 32 C) and nitrogen concentration (75 mg L -1, 150 mg L -1, 225 mg L -1, 300 mg L -1 and 375 mg L -1 de NaNO 3) on the lipid content and composition of Heterochlorella luteoviridis using a hexagonal experimental design. The lipid content in biomass ranged from 63.7 mg g -1 to 90.2 mg g -1. The qualitative composition of fatty acids was similar in all treatments. The content of saturated fatty acids was 50.6 ± 1.5 %. The monounsaturated and polyunsaturated fatty acids content ranged from 9.6 % to 14.7 % and 34.4 % to 40.7 % of total fatty acids, respectively. The essential fatty acids linoleic acid (LA - ω6) and α-linolenic (ALA - ω3) constitute the major components of polyunsaturated fatty acids. The eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) were also found. PALAVRAS-CHAVE: Heterochlorella luteoviridis; ácidos graxos; temperatura; nitrogênio. KEYWORDS: Heterochlorella luteoviridis; fatty acids; temperature; nitrogen. 1. INTRODUÇÃO Microalgas são conhecidas pela produção de compostos alto valor, tais como lipídios, carboidratos, proteínas e compostos bioativos como ácidos graxos e carotenoides. Os lipídios e sua fração de ácidos graxos são componentes intracelulares das microalgas com a função de manter a estrutura e também armazenar energia para célula. Microalgas produzem uma variedade interessante de ácidos graxos insaturados variando de 16 a 22 átomos de carbono e contendo de 1 a 6 ligações duplas na configuração cis, sendo consideradas produtoras dominantes de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) ômega 3 na biosfera (Behrens & Kyle, 1996). Os AGPI ômega 3 incluem o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido
docosaexaenoico (DHA), os quais são considerados gorduras dietéticas que apresentam amplos benefícios a saúde, sendo relacionados à prevenção de doenças cardiovasculares, ao bom desenvolvimento fetal e ao envelhecimento saudável (Swanson, Block, & Mousa, 2012). As características de crescimento e a composição das microalgas são influenciadas diretamente pelas condições de cultivo, tais como temperatura, nutrientes, iluminação, etc. Devido a sua flexibilidade metabólica as microalgas são capazes de produzir altas concentrações de lipídios quando cultivadas sob condições de crescimento limitadas (Maity, Bundschuh, Chen, & Bhattacharya, 2014). A composição também varia entre as espécies de microalgas (Behrens & Kyle, 1996) Informações sobre a versatilidade metabólica da microalga Heterochlorella luteoviridis são poucas e até mesmo inexistentes. Assim, o presente estudo experimental teve o objetivo de avaliar a influência de diferentes temperaturas e concentrações de nitrogênio sobre a formação de lipídios e sua composição da microalga Heterochlorella luteoviridis. 2. MATERIAIS E MÉTODOS A microalga marinha Heterochlorella luteoviridis BE 002 foi obtida do banco de algas no Laboratório de Bioengenharia do ICTA/UFRGS. O meio de cultivo utilizado foi o f/2 (Guillard, 1975) com alterações nas quantidades de nitrato de sódio (75 mg L -1, 150 mg L -1 225 mg L -1, 300 mg L -1 e 375 mg L -1 ). O inóculo foi preparado a uma diluição de 1:10, mantido por 14 dias em estufa rotatória (90 rpm, 28 C) sob iluminação constante de aproximadamente 2,5 klx. Após esse período, iniciou-se o cultivo em fotobiorreator de placa airlif, com capacidade de 2,4 L. A temperatura (22 C, 27 C e 32 C) foi mantida utilizandose banho térmico. Foi aplicado um delineamento experimental hexagonal de 2 fatores com repetições no ponto central totalizando 8 ensaios. Todos os cultivos foram realizados em duplicata. A aeração do sistema foi realizada a vazão de 1 L min -1 de ar comprimido e 0,01 L min -1 de CO2. A iluminação foi fixada em 18,0 klx. Ao final de 7 dias o conteúdo dos biorreatores foi centrifugado, congelado e liofilizado. A biomassa liofilizada foi armazenada a - 22 C para posterior análise. O acompanhamento do crescimento da biomassa foi realizado diariamente por densidade ótica (DO750nm) correlacionada com peso-seco. Os lipídios foram determinados pela metodologia proposta por Bligh e Dyer (Bligh & Dyer, 1959). Todos os ensaios foram realizados em duplicata, os resultados se referem à média dos resultados obtidos das análises de dois cultivos. A determinação dos ácidos graxos foi realizada pelo método descrito por Joseph & Ackman, (1992), onde os ácidos graxos são determinados na forma de ésteres metílicos de ácidos graxos. O perfil de ácidos graxos foi determinado por cromatografia gasosa (GC Modelo 2010, Shimadzu, Kyoto, Japão) utilizando BHT (hidroxitolueno butilado) como padrão interno. A identificação de cada ácido graxo foi realizada comparando o tempo de retenção com uma mistura padrão de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME-MIX 37 padrão Sigma ). A quantificação dos ácidos graxos foi realizada seguindo a metodologia da AOCS (AOCS, 1997). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As baixas concentrações de nitrogênio no meio de cultivo resultaram em maior conteúdo de lipídios totais na biomassa. Neste estudo, os teores de lipídios na biomassa variaram entre 63,7 mg g -1 e 90,2 mg g -1, quando a concentração de nitrogênio diminuiu de 60 mg L -1 para 12 mg L -1 N-NO3 (Tabela 1). A obtenção de maiores teores de lipídios em cultivos com menores concentrações de nitrogênio é bem fundamentada pela literatura (Converti, et al., 2009; Juneja, Ceballos, & Murthy, 2013). A temperatura não demonstrou efeito sobre a síntese de lipídios da H. luteoviridis BE002. A composição qualitativa de ácidos graxos da H. luteoviridis foi semelhante em todas as condições de cultivo testadas (Tabela 1). A concentração de ácidos graxos saturados (AGS) foi cerca de 50 % do total de ácidos graxos totais, sendo o ácido hexadecanoico (C16:0) o principal AGS em todas as condições de cultivo, seguido pelo ácido octadecanoico (C18:0). A síntese do C16:0 foi favorecida em baixas concentrações de nitrogênio e temperatura elevada. As maiores concentrações de C18:0 foram observadas sob altas concentrações de nitratos e em baixas temperaturas. O teor de ácidos graxos monoinsaturados (AGM) variou de 9,6% a 14,7% dos ácidos graxos totais. O principal AGM foi C18:1n-6, seguido por C16:1n-9 e C18:1n-9. Os dois primeiros foram favorecidos a altas temperaturas, enquanto C18:1n9 aumentou na biomassa nos cultivos a baixa temperatura. O teor de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) variou de 34,4% a 40,7% de ácidos graxos totais (Tabela 1), sendo o maior valor observado no cultivo com alta concentração de nitrogênio (60 mg L -1 N-NO3). Este resultado indica a importância de elevar a disponibilidade de nitrogênio no meio de cultivo, para aumentar os níveis de AGPI nesta microalga. Os AGPI são os principais ácidos graxos que constituem a estrutura dos cloroplastos na célula e tem a função de manter a estrutura da membrana em algas verdes. Assim, a redução de AGPI em cultivos com baixas concentrações de nitrogênio, podem estar relacionados com o efeito da privação de nitrogênio no sistema de fotossíntese das algas (Zhu et al., 2014). Os ácidos graxos essenciais, ácido linoleico (LA, C18:2n-6) e α-linolênico (ALA, C18:3n-3) constituem os principais componentes de AGPIs (Tabela 1), outros importantes AGPIs como EPA, (20:5n3) e o DHA (22:6n3) também estão presentes na fração de ácidos graxos poliinsaturados da H. luteoviridis. Observou-se uma tendência para aumentar a síntese dos ácidos graxos poli-insaturados em cultivos a temperatura de 22 C. No entanto, o LA, demonstrou um aumento nos cultivos sob temperatura elevada. A relação entre a temperatura e conteúdo AGM e AGPI pode ser explicada pelas alterações na fluidez dos fosfolipídios das camadas da membrana celular, o que depende do grau de insaturação dos ácidos graxos. O teor de EPA não foi influenciado pela temperatura e sua síntese foi favorecida quando as células foram cultivadas em concentrações elevadas de nitrogênio. A ingestão de ácidos graxos ω3, tais como ALA, EPA e DHA, está associada com baixa incidência de infarto do miocárdio, inflamação crônica, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares. Além de ser rica em ácidos graxos ω3, a H. luteoviridis também apresentou uma baixa relação ω6:ω3 (LA:ALA, Tabela 1), em torno de 2:1. A baixa relação ω6:ω3 na dieta foi associada com uma redução de 45 % das mortes por doenças do coração, enquanto a alta relação de ω6:ω3 pode aumentar o risco de doenças inflamatórias (Russo, 2009; Simopoulos, 2002). Nas últimas décadas houve aumento no consumo de ω6, sendo que a relação ω6:ω3 varia de 16:1 a 20:1 em dietas ocidentais (Simopoulos, 2004). Este aumento no
consumo de ω6 está sobretudo relacionado com o uso de óleos vegetais (Bhattacharya, Sun, Rahman, & Fernandes, 2007; Calder, 2008). Tabela 1 - Composição de ácidos graxos da H. luteoviridis BE 002 cultivada sob diferentes temperaturas e concentrações de nitrogênio. Temperatura ( C) 27 27 22 32 32 22 27 Nitrogênio (mg L -1 ) 12 60 24 24 48 48 36 Lipídios totais (mg g -1 ) 90,2 ± 0,2 a 63,7 ± 0,2 b 73,5 ± 0,1 ab 80,3 ± 0,5 ab 74,8 ± 0,1 ab 71,2 ± 0,4 b 72,6 ± 0,5 b Ácidos graxos saturados (% Total de ácidos graxos) 14:0 1,4 ± 0,1 ab 1,5 ± 0,1 ab 2,0 ± 0,0 a 0,7 ± 0,1 ab 0,8 ± 0,1 b 1,7 ± 0,0 ab 1,4 ± 0,1 ab 16:0 47,6 ± 0,9 a 42,6 ± 0,2 cd 44,1 ± 0,0 bc 46,6 ± 0,2 ab 44,2 ± 0,7 bc 40,9 ± 1,4 d 44,7 ± 1,8 bc 18:0 2,7 ± 0,3 bc 4,8 ± 0,4 a 4,3 ± 0,4 ab 2,0 ± 0,4 c 2,7 ± 0,8 bc 4,8 ± 0,4 a 4,0 ± 1,0 ab 20:0 0,1 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 ab 0,2 ± 0,1 a 0,1 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 b 0,1 ± 0,0 b 0,1 ± 0,0 ab 22:0 0,5 ± 0,0 ab 0,6 ± 0,0 ab 0,7 ± 0,1 a 0,3 ± 0,0 b 0,3 ± 0,1 b 0,5 ± 0,2 ab 0,5 ± 0,2 ab 24:0 0,7 ± 0,0 bc 0,5 ± 0,0 c 1,1 ± 0,0 a 0,4 ± 0,0 d 0,3 ± 0,0 d 1,0 ± 0,3 a 0,8 ± 0,1 b Total 52,9 ± 1,2 a 50,0 ± 0,7 bc 52,2 ± 0,5 ab 50,2 ± 0,7 bc 48,5 ± 0,6 c 49,0 ± 1,2 c 51,4 ± 0,7 ab Ácidos graxos monoinsaturados (% Total de ácidos graxos) 14:1 0,3 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 a 0,3 ± 0,1 b 0,3 ± 0,1 ab 16:1n-9 2,2 ± 0,5 bc 2,6 ± 0,6 bc 1,6 ± 0,2 c 3,1 ± 0,5 ab 3,8 ± 0,4 a 1,7 ± 0,8 c 2,6 ± 0,9 abc 16:1n-7 0,2 ± 0,0 b 0,3 ± 0,0 ab 0,3 ± 0,0 ab 0,3 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 a 0,4 ± 0,2 ab 0,2 ± 0,0 ab 18:1n-6 7,2 ± 0,6 ab 5,4 ± 1,1 bcd 4,0 ± 0,2 cd 8,8 ± 0,4 a 7,2 ± 1,6 ab 3,3 ± 0,8 d 6,0 ± 1,2 bc 18:1n-9 2,7 ± 0,0 b 3,2 ± 0,1 b 3,3 ± 0,1 b 2,7 ± 0,1 b 3,0 ± 0,0 b 4,6 ± 0,7 a 2,8 ± 0,2 b Total 12,5 ± 0,1 abc 11,7 ± 1,6 abc 9,6 ± 0,5 c 15,2 ± 0,9 a 14,7 ± 2,1 ab 10,3 ± 2,7 bc 12,0 ± 2,0 abc Ácidos graxos poli-insaturados (% Total de ácidos graxos) 18:2n-6 20,6 ± 0,9 b 21,0 ± 0,2 b 18,8 ± 0,4 c 23,8 ± 0,4 a 25,3 ± 0,2 a 18,5 ± 0,2 c 20,4 ± 0,8 b 18:3n-6 0,4 ± 0,0 cd 0,8 ± 0,2 b 0,7 ± 0,1 bc 0,4 ± 0,0 d 0,6 ± 0,2 bcd 1,1 ± 0,1 a 0,6 ± 0,2 bcd 18:3n-3 8,3 ± 0,2 b 9,5 ± 0,1 b 11,2 ± 0,5 a 5,1 ± 0,5 c 5,5 ± 0,7 c 12,4 ± 1,1 a 8,8 ± 0,7 b 20:4n-6 1,4 ± 0,1 cd 2,3 ± 0,2 bc 2,8 ± 0,1 ab 1,1 ± 0,1 d 1,3 ± 0,2 d 3,8 ± 0,6 a 2,6 ± 0,9 b 20:3n-3 0,2 ± 0,0 a 0,1 ± 0,0 b 0,2 ± 0,0 a 0,1 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 b 0,2 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 ab 20:5n-3 1,6 ± 0,0 d 2,7 ± 0,0 ab 1,9 ± 0,0 cd 2,4 ± 0,0 abc 2,7 ± 0,4 a 2,6 ± 0,1 ab 2,2 ± 0,3 bc 22:4n-3 1,2 ± 0,1 a 1,4 ± 0,0 a 1,5 ± 0,1 a 1,3 ± 0,1 a 1,2 ± 0,1 a 1,3 ± 0,2 a 1,3 ± 0,4 a 22:6n-3 0,8 ± 0,1 c 0,5 ± 0,0 d 1,2 ± 0,0 a 0,3 ± 0,0 e 0,2 ± 0,0 e 1,0 ± 0,0 b 0,6 ± 0,0 d Total 34,4 ± 1,31 ab 38,3 ± 0,9 ab 38,2 ± 0,5 c 34,6 ± 0,3 a 36,8 ± 1,7 bc 40, 7 ± 1,7 a 36,8 ± 1,5 bc LA:ALA (ω6:ω3) 1,87 1,71 1,40 2,74 2,79 1,35 1,81 Letras diferentes na mesma linha são diferentes significativamente por teste de Tukey (p<0,05). 4. CONCLUSÃO A composição qualitativa de ácidos graxos foi independente das condições de cultivo. O aumento de nitrogênio no meio de cultivo causou aumento na síntese de EPA. A baixa temperatura induziu o aumento na concentração de AGPI, principalmente na síntese dos ácidos graxos 3. A H. luteoviridis mostrou ser uma fonte importante de ácidos graxos poliinsaturados, apresentando uma baixa relação ω6:ω3.
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