Fluídos Biológicos 2 Análise do Fluído Seminal e Espermograma Prof. Dr. Luís Gustavo R. Fernandes
Espermatogênese Revisão dos tipos celulares dos túbulos seminíferos e do espaço intersticial
VISÃO MICROSCÓPICA DO TESTÍCULO extraído, enquanto dispnível, de: http://academic.pgcc.edu/~aimholtz/aandp/206_online/repro/malerepro1.html
Tipos celulares nos túbulos seminíferos Células reprodutoras (espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozóides) e células sustentaculares (Sertoli) extraído, enquanto disponível, de: http://academic.pgcc.edu/~aimholtz/aandp/206_online/repro/malerepro1.html
TÚBULO SEMINÍFERO E TIPOS CELULARES membrana basal espermatócitos primários células sustentaculares (Sertoli) espermatogônias espermatócitos secundários espermátides Seminiferous tubules form the mass of the testes and are the sites of spermatogenesis. Seminiferous tubules are composed of a thick layer of spermatogenic cells (most numerous) and sustentacular (Sertoli) cells which rest on a basement membrane. The spermatogenic cells-spermatogonia, primary spermatocytes, secondary spermatocytes, spermatids and spermatozoa--represent different cell stages in spermatogenesis (setas amarelas). The outlines of sustentacular cells are not distinct. Maturing spermatozoa are found embedded, head first, in the sustentacular cells, which provide mechanical support, protection and possibly nutrition for the developing spermatozoa. extraído, enquanto disponível, de: http://trc.ucdavis.edu/mjguinan/apc100/modules/reproductive/mammal/testis3/test is6.html
Espermatogênese É o processo pelo qual as células-tronco se desenvolvem em espermatozóides maduros. Existem 3 fases: (1) Espermatocitogênese, (2) Meiose, and (3) Espermiogênese. 1. Espermatocitogênese (também chamada mitose): células-tronco (espermatogônia do Tipo A) dividemse mitoticamente e produzem as células que irã se diferenciar (espermatogônia do Tipo B). compartimento basal http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mm_curr/histology/mr/himrp4.htm
Espermatogênese É o processo pelo qual as células-tronco se desenvolvem em espermatozóides maduros. Existem 3 fases: (1) Espermatocitogênese, (2) Meiose, and (3) Espermiogênese. 2. Meiose: Células em prófase da 1ª divisão meiótica são os espermatócitos primários. Estes, ao completarem a divisão meiótica são chamados espermatócitos secundários. Rapidamente ocorre a 2ª divisão meiótica, originando as espermátides. compartimento basal compartimento apical ou adluminal http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mm_curr/histology/mr/himrp4.htm
Espermatogênese É o processo pelo qual as células-tronco se desenvolvem em espermatozóides maduros. Existem 3 fases: (1) Espermatocitogênese, (2) Meiose, and (3) Espermiogênese. 3. Espermiogênese: é a metamorfose das espermátides esféricas a espermatozóides alongados. Durante a espermiogênese é formado o acrossoma e o flagelo. compartimento basal compartimento apical ou adluminal http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mm_curr/histology/mr/himrp4.htm
Espermiogênese As mudanças durante a espermiogênese envolvem transformações da espermátide esférica a espermatozóide maduro: (1) formação do acrossoma, (2) mudanças nucleares, (3) desenvolvimento do flagelo, (4) reorganização do citoplasma e organelas celulares e (5) o processo de liberação da cél. de Sertoli (espermiação). http://www.endotext.org/male/male1/maleframe1.htm
Espermiogênese As mudanças durante a espermiogênese envolvem transformações da espermátide esférica a espermatozóide maduro: (1) formação do acrossoma, (2) mudanças nucleares, (3) desenvolvimento do flagelo, (4) reorganização do citoplasma e organelas celulares e (5) o processo de liberação da cél. de Sertoli (espermiação). extraído, enquanto disponível, de: http://rbp.fmrp.usp.br/didatico/embriologia-propedeutico/embrio propedeutico%202004_tema1.pdf
Espermatogênese extraído, enquanto disponível, de: http://academic.pgcc.edu/~aimholtz/aandp/206_online/repro/malerepro1.html
EPIDÍDIMO http://fisiologia.med.up.pt/teoricoprtc.html
Epidídimo EPIDÍDIMO http://microanatomy.net/male_reproductive/lecture_40_male_reproductive_childs_4_slides_per_page.pdf
CAPACITAÇÃO DO ESPERMATOZÓIDE ALTERAÇÃO FUNCIONAL DO ESPERMATOZÓIDE QUE OCORRE NA TROMPA UTERINA. REQUER UM TEMPO PARA QUE OCORRA (2 OU ATÉ >6 HORAS). PELO MENOS DOIS FÊNOMENOS SÃO IMPORTANTES: O AUMENTO DA TAXA DE BATIMENTO DO FLAGELO E A ACELERAÇÃO MOVIMENTO DO ESPERMATOZÓIDE DO REAÇÃO ACROSSÔMICA NO SPTZ QUE PERMITE A FUSÃO COM O OVO: FRAGMENTAÇÃO E PERDA DO ACROSSOMA, COM A LIBERAÇÃO DE ENZIMAS E PROTEASES QUE PERMITIRÃO AO SPTZ PENETRAR E SE FUNDIR AO OVO. O ENTENDIMENTO DESTES MECANISMOS É IMPORTANTE PARA A FERTILIZAÇÃO IN VITRO.
No que consiste a análise do sêmen Uma avaliação da espermatogênese e espermiogênese. Análise descritiva tradicional: interpretação baseada em distribuições populacionais de características, portanto, propenso a erros de interpretação no nível individual. Abordagem moderna é avaliar com relação a: diagnóstico de lesões específicas; indicadores de potencial disfuncional e / ou funcional. Exige a compreensão da relevância da patofisiologia relacionada a alteração esperma Em qualquer caso, os resultados devem ser precisos e confiáveis.
Por que realizar as análises? Diagnóstico de esterilidade Diagnóstico da infertilidade O prognóstico para a fertilidade Identificar as opções de tratamento: tratamento cirúrgico tratamento médico tratamento de reprodução assistida Portanto = um teste de triagem para ajudar a gestão direta.
Coleta da Amostra Para um resultado significativo, amostras de sêmen deve ser sempre coletadas em condições padronizadas: o recipiente tem que ser estéril e sabe não ser spermotoxic (ou seja fornecido pelo laboratório) o homem deve ter tido 3-5 dias de abstinência o homem deve ter lavado as mãos antes da coleta (principalmente se a análise microbiológica é solicitada) O homem não deve ter usado lubrificantes a amostra deve ser mantida a 37 C até que a análise se inicie. De preferência dentro de 30 minutos, mas absolutamente dentro de 60 min, após ejaculação
Processamento da Amostra A amostra deve ser misturada cuidadosamente durante o período de liquefação A amostra NUNCA deve ser centrifugada (a única exceção é para a preparação de material fixado para avaliação de concentração) A amostra nunca deve ser "passada por agulha" - se for demasiado viscoso para trabalhar com, um volume conhecido de solução tampão de esperma (não PBS) que deve ser adicionado e misturado suavemente a amostra. O volume adicionado deve ser incluído no cálculo da concentração espermática
Avaliação Macroscópica Aparência Odor Liquefação Volume Viscosidade ph
Avaliação Macroscópica Homogenizar a amostra, ainda no frasco de recolha coleta, suavemente Observe os seguintes aspectos: Cor (normal = branco ao cinza-amarelo) - se houver sangue presente, ela pode variar do rosa ao marrom Opacidade / translucidez (= normal tende a opaco) Se há a presença de filamentos de muco ou aglomerados de células
Avaliação Macroscópica Diferentes pessoas têm diferentes habilidades para sentir o cheiro de sêmen, e isso não pode ser padronizado No entanto, quando a tampa é retirada do frasco de recolha, deve notar-se que há um forte cheiro de urina ou da putrefação As amostras recolhidas após um período de abstinência prolongada (isto é, de várias semanas) são susceptíveis de ter um forte odor Liquefação é a quebra da porção de gel do plasma seminal - as enzimas para isso estão no fluido prostático Uma amostra com liquefacção incompleta tem um material gelatinoso em uma base líquida - isto pode ser visto quando a amostra é homogenizada para a avaliação da aparência
Avaliação Macroscópica Viscosidade está relacionada com a natureza do fluido da amostra inteira: A viscosidade ou consistência da amostra liquefeita pode ser estimada por gentil aspiração do sêmen em pipetas de 5 ml, seguida de fácil gotejamento. Normal quando gotas são formadas. No caso de viscosidade anormal verifica-se no processo de gotejamento a formação de um filamento de mais de 2 cm. O aumento da consistência pode estar relacionado com disfunção prostática por inflamação crônica. A consistência anormal também pode intervir na avaliação de várias características do sêmen, tais como a motilidade, concentração ou determinação de anticorpos antiespermatozóides. O volume da amostra deve ser medido para permitir uma determinação precisa do número de espermatozóides Isto é mais facilmente avaliada usando uma pipeta volumétrica descartável Depois da avaliação do volume amostra é medida a viscosidade
Avaliação Bioquímica PH ph é importante porque o esperma morre a ph <6,9 O ph do sêmen liquefeito normalmente é determinado usando tiras de teste (faixa de ph 6,5-10,0) Costumamos medir o ph após volume e viscosidade - tocando a pipeta volumétrica já vazia (teste de volume) para a tira de teste O intervalo de ph normal é de 7,2-8,4 Desordens inflamatórias das glândulas acessórias pode levar a um ph fora desta faixa Ácido cítrico: pode indicar, função prostática - níveis baixos podem indicar disfunção ou obstrução do ducto prostático Zinco: marcador para a função prostática - ensaio colorimétrico (OMS) Frutose: marcador para a função da vesícula seminal, e é um substrato para o metabolismo do esperma - ensaio espectrofotométrico (OMS) α-glucosidase: secretada exclusivamente pelo epidídimo e por isso é um marcador para a função do epidídimo - ensaio espectrofotométrico (OMS)
Análises das Amostras a Fresco As características avaliadas são: Motilidade Agregação de espermatozóides (aglomeração aleatória) "alguns" é normal, mas os grandes grupos (cada um com centenas de esperma) é anormal Espermaglutinação (entre locais específicos) - pode sugerir a presença de anticorpos anti-espermatozóides. Células redondas: deve ser <1 por 40 campo (~ 1.000 mil / ml). Se mais abundante, um teste de leucócitos deve ser executado As células epiteliais: geralmente presentes em pequeno número: Eritrócitos não devem estar presentes Detritos: partículas menores do que a cabeça de esperma, podem ser abundantes Bactérias e protozoários: presença indica infecção
Determinação da Concentração de Espermatozoides Contagem de esperma = número total de espermatozóides no ejaculado Concentração espermática = número de espermatozóides por ml (não "densidade", a qual é uma expressão de massa / unidade de volume) Método mais preciso é a diluição volumétrica em hemocitômetro Deve-se usar uma pipeta de deslocamento positivo Fazemos um 1 + 19 de diluição com uma solução fixadora (permite que as avaliações sejam lote - normalmente contados dentro de dois dias) Fixar a lamínula hemocitômetro sobre as câmaras ~ 10 ul de ambas as câmaras Deixar em câmara úmida durante 10-15 minutos Conte com um objetiva 20 microscopia de de contraste de fase O número de quadrados avaliados depende do número de espermatozóides contados no primeiro quadrado grande: Se <10 contadas, toda a rede é avaliada Se 10-40 contados 10 quadrados são avaliados Se> 40 contados, 5 quadrados são avaliados
First large square counted
Cálculo da Concentração Se as contagens das duas câmaras não estão dentro de 5% de sua média (ou seja, a diferença> 1/20 de sua soma): descarte, homogenizar novamente a amostra, e contar novamente Se os dois pontos estão em concordância, então a soma das duas contagens é dividido pelo fator de correção: Se 2 25 quadrados contados, divida a soma por 10 Se 2 10 quadrados contados, dividir a soma por 4 Se 2 5 quadrados contados, divida a soma por 2 Isto dá a concentração de espermatozóides em milhões por ml A contagem de esperma = concentração volume total
Fontes de Erro para Contagem Representante alíquota de ejaculação? - Homogênea sêmen (mista)? - Alíquota de amostra precisos (viscosidade)? - Duplicar alíquota? Diluição precisa: - volumes de alíquota de amostra e diluente? - Armazenamento (hermético) /ligação do esperma para frasco? - AmostragemSecundária de : - mistura de alíquota diluída? - Duplicar as alíquotas? Preparação de contar câmaras: - qualidade da câmara boa / fabricação? - Câmara carregada corretamente e / ou tampa de vidro colocada corretamente? - Número mínimo adequado de células? - Repetição de contagens duplicadas? Cálculos corretos? - Precisão dos resultados? -Incerteza de medição conhecido?
Interpretação Valores de referência para: Concentração de espermatozóides é> 20 106 espermatozóides / ml Contagem de esperma é> 40 106 espermatozóides por ejaculado A concentração espermática persistentemente baixo é associado com diminuição da fertilidade Se um homem tem uma concentração de esperma <5 106 espermatozóides / ml, a OMS recomenda a avaliação de anormalidades numéricas e estruturais dos cromossomos sexuais Azoospermia pode indicar uma falha de espermatogênese ou bloqueio (s) no trato
Análise da Morfologia do Espermatozóide Morfologia é ainda mais importante do que a motilidade e concentração Devido ao pequeno tamanho da cabeça de esperma humano, deve usar um esfregaço seco ao ar, que foi corado O melhor método é o Papanicolaou As amostras preparadas são avaliadas utilizando uma objetiva de imersão em óleo 100 sob a ótica de campo brilhantes A OMS recomenda que 200 espermatozóides sejam contados por amostra (2 200 é melhor) Campos para a contagem deve ser selecionado de forma aleatória Ao contar, lembre-se sobre a distribuição normal
Análise da Morfologia Até mesmo as "boas" amostras terão <20% formas normais Mas nós sabemos que os espermatozóides a partir dessas amostras podem fertilizar ovos - assim a morfologia serve de alguma ajuda? Sim, é, mas há algumas coisas para pensar: O resultado indica uma probabilidade, não uma absoluta Você tem que contar 2000 esperma de discriminar de forma confiável 3% e 5% ("critérios rigorosos" de corte de 4%) A gama dinâmica de 4-15% não é muito grande, e significa que é difícil fazer uma avaliação significativa Então, nós usamos um "índice" extra para a avaliação da morfologia
Índice de Teratozoospermia O Índice de Teratozoospermia é uma expressão do número médio de anormalidades por esperma anormal Cada célula do esperma é avaliada por uma anormalidade na cabeça, o pescoço / peça intermediária, ou na cauda, e para uma gotícula citoplasmática Se ele não tem qualquer destas anormalidades, é "normal" Se ele tem uma anormalidade, é "anormal", e marcar cada anormalidade. Então, se uma célula tem uma cabeça anormal e cauda, é contado como uma célula, e duas anormalidades Então, ( total anormalidades) / (total de espermatozóides ) = TZI TZI> 1,80 foi associado com o esperma pobre capacidade de fertilização in vivo e in vitro
Variations of normal head shape Asymmetric insertion Non-inserted tail Distended Thin midpiece midpiece Small / large head Tapering heads Cytoplasmic droplet Pyriform heads Constricted Reduced acrosome Coiled tail Duplicate tail Conjoined form Vacuolated head Dense staining Amorphous forms Short tail Hairpin tail Terminal droplet Bent tail
Análise da Motilidade Esta é a primeira avaliação feita sobre a preparação úmida Se> 10-15% dos espermatozóides são aglutinadas, apenas avaliar o esperma de natação livre (e note que este no formulário de relatório) Uma avaliação de repetição deve ser feita em uma preparação segunda molhado Não estimar, contar (> 4 campos e 200 espermatozóides por prep) Use um objetivo 40, e óptica de contraste de fase Faça uma seleção aleatória dos campos que são avaliados Avaliar os campos que são longe da borda lamela Contar apenas esperma aqueles que estavam em campo em um momento no tempo (você tem que ser rápido!) Deve haver um acordo em 10% entre as duplicatas % Motilidade = a proporção de espermatozóides com movimento de cauda Avaliação progressão = grau de progressão mostrado pela maioria do esperma: este pode ser de 0 (todas imóveis) a 4 (todos com progressão rápida), ou a partir de uma (progressão rápida) a d (todos imóveis) Motilidade contagem diferencial = proporção de espermatozóides em cada uma das quatro classes de motilidade (rápido progressiva; lenta e progressiva; não progressiva; imóveis)
Classificação de motilidade diferencial é baseado na distância nadada ao longo do tempo: Progressiva rápida:> 25 um / s Lento e progressivo: 5-25 um / s Não progressiva: <5 um / s Imóvel: nenhum movimento flagelar A cabeça do espermatozóide é de cerca de 5 um de comprimento, para que o esperma rápido ter um ganho líquido de 5 comprimentos de cabeça / segundo
Interpretação da Motilidade Alternativamente, podemos usar um monitor de vídeo com uma grade para as avaliações de motilidade diferenciais Cada quadrado é o equivalente a 25 25 ^ m (um micro-estágio medidor é usado para configurar isso) Os valores de referência da OMS para motilidade são: 50% ou mais com motilidade progressiva, ou 25% ou mais com motilidade progressiva rápida Assumindo que todos os fatores de coleta e de laboratório têm sido controladas, resultado motilidade deficiente pode ter implicações negativas para a fertilidade. No entanto, isto deve ser confirmado por uma análise do sêmen de repetição, e os resultados devem ser interpretados com o resto dos resultados da análise de sêmen
Fontes de Erro dos Ensaios de Motilidade As definições foram implementados corretamente? Os funcionários são treinados para classificar progressão? Controle de qualidade interno? Como a velocidade / progressão é avaliada? Efeito da temperatura: motilidade % = mínimo % Progressiva = ligeiro % = Rápida muito grande Alíquotas de amostra representativa? Número adequado de espermatozóides contados? Repetibilidade da contagem duplicatas? Cálculos efetuados corretamente? Precisão dos resultados?incerteza dos resultados?
Ensaios de Vitalidade Utilizado em amostras com motilidade total baixa (<50%) Distingue entre as amostras com o esperma vivo, mas imóveis (por exemplo, síndrome de Kartagener), e aqueles com lotes de espermatozóides mortos (pode resultar de: a senescência esperma; exposição a detergentes ou lubrificantes, ou anticorpos espermotóxicos) Também permite verificar a precisão das avaliações de motilidade: % vivos deve ser ligeiramente maior que% móveis Geralmente realizada utilizando um corante vital, tal como eosina Y, com um contracorante (nigrosina) - embora poderia utilizar uma sonda de DNA fluorescente, tal como H33258.
Análises Pós-Vasectomia Para determinar a concentração de esperma quando nenhum / poucos esperavam: centrifugar o máximo da amostra quanto possível (1000 g durante 15 min) num tubo de centrífuga cónico descartável - note o volume exacto usado Remover a maior parte do sobrenadante - volume nota removido Faça pelo menos cinco preps molhadas (10 ul de sedimento ressuspenso em uma lamela 22 22mm) Pesquisar pelo menos 5 preps molhadas Se qualquer coisa que se parece com um espermatozóide é visto - o relatório "não é clara" A decisão final é da responsabilidade do patologista