VIABILIDADE CELULAR DE Pichia stipitis CULTIVADA EM MEIO MÍNIMO E SOBRE A PRESENÇA DE INIBIDORES Augusto de S. Silva 1, Antonio Martins de O. Júnior 1 e Ana Karla de S. Abud 1 1 Universidade Federal de Sergipe, Departamento de Tecnologia de Alimentos E-mail para contato: ana.abud@gmail.com RESUMO A biomassa agroindustrial é uma promissora alternativa energética. Contudo, para sua conversão em açúcares, necessita de pré-tratamentos, os quais liberam não apenas hexoses, mas também pentoses e outros açúcares, além de inibidores. O efeito dos inibidores ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural na viabilidade celular do processo de fermentação etanólica pela levedura Pichia stipitis, tendo como substrato uma pentose (xilose comercial), é avaliado neste trabalho. As fermentações ocorreram em frascos Erlenmeyer de 250 ml, à temperatura ambiente, 150 rpm, durante 96 h e sem controle de ph, na presença, mistura e/ou ausência dos inibidores. Os resultados indicaram o ácido acético como principal inibidor, tendo a mistura maior dano ao processo fermentativo. Hidroximetilfurfural e furfural, quando isolados, não alteram significativamente a viabilidade celular da fermentação. 1. INTRODUÇÃO Apesar do Brasil ter produzido 23,54 milhões de m³ de etanol em 2012 (ANP, 2013), as mudanças climáticas, o alto preço dos combustíveis fósseis e o fato do etanol ser produzido por fermentação, não contribuindo para o aumento líquido de dióxido de carbono (CO 2 ) para a atmosfera, pois é produzido por matérias-primas renováveis, que sequestram o CO 2 da mesma, aumentaram consideravelmente a sua demanda nos últimos anos (Demirbas, 2005; Cabral et al., 2009). Para suprir tal produção, grandes esforços têm sido feitos no desenvolvimento de processos a partir de biomassas alternativas, como resíduos agroindustriais, lixo urbano, resíduos florestais, etc,
que participam em aproximadamente 50% da biomassa terrestre e onde no Brasil se estima uma geração anual de 35.10 7 toneladas (Ballesteros, 2001; Pereira Jr, 2007; Chandel et al., 2011). Estes materiais são geralmente constituídos por 40% de celulose, 30% de hemicelulose e 20% de lignina, associados um ao outro em uma matriz heterogênea de diferentes graus e variada composição, que depende do tipo, espécie e até mesmo da fonte da biomassa (Behera et al., 2014). Devido à natureza recalcitrante da lignocelulose, um pré-tratamento é necessário para aumentar a quantidade de açúcares fermentescíveis na etapa de hidrólise. Neste pré-tratamento, em adição à mistura de monossacarídeos e oligossacarídeos, liberam-se produtos de decomposição como ácidos orgânicos, lignina e outras substâncias, que podem ter potencial efeito inibitório sobre o processo de fermentação (Bellido et al., 2011). Entre os compostos inibidores formados, que varia com o tipo de condição de pré-tratamento (temperatura, tempo de residência, pressão, ph, etc), destacam-se os ácidos alifáticos (acético, fórmico e levulínico), furaldeídos (furfural e 5- hydroxymetilfurfural) e compostos aromáticos extrativos (Bellido et al., 2011; Ask et al., 2013). As hemiceluloses, heteropolímeros de pentoses e hexoses, têm a xilose como açúcar predominante, compreendendo 20 a 40% do total de carboidratos dos resíduos agrícolas (Moraes et al., 2010). Entretanto, a xilose não é fermentescível por leveduras industriais (Saccharomyces cerevisiae), sendo sua biotransformação a etanol um dos desafios mais importantes a ser resolvido no âmbito científico e tecnológico (Rossell, 2008; Silva et al., 2011). Entre os microrganismos avaliados, a levedura Pichia stipitis aparece como capaz de fermentar xilose e outras importantes hexoses a etanol a partir do hidrolisado da biomassa lignocelulósica, sendo condições como ph, temperatura, oxigênio, agitação e composição do meio fatores importantes no processo de bioconversão (Nigan, 2001; Cabral, 2005; Agbogbo et al., 2008; Farias et al., 2012). Este trabalho analisa a influência dos principais inibidores formados no pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural, na viabilidade celular do processo de fermentação etanólica em meio mínimo, com a levedura Pichia stipitis e xilose como única fonte de carboidrato. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Foi utilizada a levedura Pichia stipitis NRRL Y-7124, gentilmente cedida pela Embrapa Agroenergia. A manutenção da linhagem foi realizada a partir de repiques contínuos em meio YPX (20 g/l de extrato de levedura; 10 g/l de peptona e 20 g/l de xilose), sendo a cultura mantida em tubo inclinado contendo meio YPXA (YPX com adição de 20 g/l de ágar bacteriológico). O meio de cultura foi composto de 20 g/l xilose; 6,7 g/l de YNB. O ph dos meios de ensaio com os inibidores ácido acético e mistura foram corrigidos, com solução de ácido clorídrico 2 N para 4,5 e, em seguida, esterilizado em autoclave à 121º e 1 atm por 15 min. Para o preparo do inóculo, alçadas de levedura foram transferidas assepticamente para frasco Erlenmeyer de 250 ml contendo 250 ml de meio de cultura e incubado à temperatura ambiente e sob agitação de 150
rpm por 24 h (fase exponencial de crescimento). Ensaios anteriores determinaram, a partir de contagem de células em câmara de Neubauer, o volume necessário para inocular 2.10 7 cél/ml. Com o volume definido, as células foram recuperadas por centrifugação a 3500 rpm e 10 min, lavadas com solução salina estéril e ressuspensas no meio de fermentação. Para os testes fermentativos foi utilizado o meio contendo 20 g/l xilose e 6,7 g/l de YNB. Para o teste de inibição foram adicionadas quantidades determinadas dos inibidores ácido acético (1,75 g/l; 3,75 g/l), furfural (0,25 g/l) e hidroximetilfurfural (0,05 g/l). O ph do meio foi ajustado para 4,5, com solução de ácido clorídrico 2 N. Os experimentos foram conduzidos frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio de cultivo, à temperatura ambiente e 150 rpm por 96 h, sem controle de ph e em condições microaeróbias (frascos fechados com tampão de algodão). Durante os experimentos, amostras foram retiradas a cada 24 h para medição do ph, viabilidade celular e determinação do crescimento celular, do consumo de xilose e da produção de etanol. As fermentações sem adição de inibidores (controle) e mistura foram realizadas em triplicata. O acompanhamento do crescimento celular (X) foi feito através da medida de absorbância a 600 nm, tendo água destilada como branco. Os valores de concentração foram calculados através de curva de calibração entre concentração e a absorbância. A concentração de xilose (S) foi determinada pelo método colorimétrico do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS), após fervura por 5 min e leitura em espectrofotômetro a 540 nm, de acordo com metodologia proposta por Miller (1959), tendo como curva padrão soluções de concentração conhecida de xilose. As medidas foram realizadas em triplicata. O percentual de células não viáveis foi determinado a partir da mistura de um volume específico do caldo fermentativo com solução de azul de metileno e contagem das células em câmara de Neubauer, em microscópio óptico Bioval. As células de levedura coradas em azul foram consideradas mortas, enquanto as que permaneceram incolores, vivas. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Para avaliar o comportamento da levedura frente à presença dos inibidores do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, da qual se extrai a hemicelulose, foram realizados estudos de fermentação em xilose comercial na ausência, na mistura e na presença de cada inibidor. Todos os processos fermentativos foram desenvolvidos em triplicada. Utilizaram-se 2 concentrações de ácido acético (HAc I = 3,75 g/l e HAc II = 1,75 g/l), enquanto hidroximetilfurfural (HMF) e furfural (F) possuíram concentrações únicas de 0,05 e 0,25 g/l, respectivamente. O ensaio controle (C) não contou com a presença de nenhum inibidor, enquanto a misturas (M) possuíram os 3 inibidores, com o ácido acético na menor concentração (1,75 g/l). Os perfis das cinéticas de fermentação e da viabilidade celular são apresentados na Figura 1. Observa-se que a Pichia stipitis mostrou-se capaz crescer na presença isolada dos inibidores hidroximetilfurfural e furfural, sendo o HMF, na quantidade em estudo (0,05 g/l), aquele que apresentou melhor desempenho, não influenciando o crescimento celular e o consumo de substrato, com perfil semelhante aos ensaios sem a presença de inibidores (C). A mistura dos
S (g/l) % Células não viáveis X (g/l) ph XX SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS inibidores demonstrou influência maléfica ao processo fermentativo, não apresentando crescimento celular e baixo consumo de substrato após as 96 horas de acompanhamento. 2,4 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 12,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 100 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 80 60 40 20 0,0 0 Figura 1. Comportamento cinético das variáveis de fermentação. Através dos resultados obtidos, constatou-se maior inibição pelo ácido acético no ensaio com 3,75 g/l (HAc II), onde o crescimento celular e, principalmente, o consumo de substrato apresentaram valores demasiadamente baixos quando comparados com a utilização de 1,75 g/l (HAc I). Os processos fermentativos com controle (C) e com adição de HMF e F obtiveram conversão de xilose em células (Y X/S ) próxima a 0,2 g/g e rendimentos próximos ao apresentado na literatura em estudos com adição de glicose e xilose como substratos, sem adição de inibidores (Cabral et al., 2005; Silva et al., 2011; Farias et al., 2012). O crescimento celular nos processos fermentativos foi também estudado pela porcentagem de células não viáveis. Nota-se, pela Figura 1, a diferença da mistura (M) dos demais ensaios, apresentando quase metade das células mortas inicialmente (49,28%) e tendo um aumento gradativo com o passar do tempo. Os ensaios HAc I e HAc II, após 24 h de fermentação, tiveram comportamento semelhante ao da mistura (M). Os demais ensaios (C, HMF e F) apresentaram uma
linearidade crescente em sua porcentagem de células não viáveis a partir das 48 horas, devido à diminuição da concentração de substrato (xilose) após este intervalo de fermentação. O ph dos processos fermentativos inicialmente apresentou diferentes valores, porém o intervalo de ph entre 4,0 e 3,5 foi observado após 48 horas. A partir deste tempo, comprovou-se um aumento na produção celular dos ensaios C, HMF e F, assim como um declínio na concentração de substrato dos mesmos. Estes resultados diferem de Cabral et al. (2005) que, em condições de fermentação em meio rico e sem adição de inibidores, observaram que o aumento do ph favorece o crescimento celular. Os resultados obtidos indicam a necessidade de controle da concentração destes inibidores no caldo extraído do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, em especial no pré-tratamento químico, onde uma maior quantidade destes componentes é gerada, de forma a otimizar a fermentação etanólica de pentoses pela levedura Pichia stipitis. 4. CONCLUSÕES A levedura Pichia stipitis foi capaz de crescer na presença isolada dos principais inibidores do prétratamento da biomassa lignocelulósica, mas mostrou que a mistura destes componentes é capaz de inibir completamente o processo fermentativo, demonstrando alta porcentagem de células não viáveis no inicio do processo. A presença de hidroximetilfurfural e furfural, na concentração de 0,05 g/l e 0,25 g/l, respectivamente, mostrou efeito positivo na fermentação etanólica, em especial com apenas HMF, que apresentou valores de crescimento celular e consumo de substrato semelhantes ao ensaio controle (C). As duas concentrações de ácido acético promoveram menores taxas de crescimento celular. No entanto, a concentração de 3,75 g/l evidenciou um maior efeito inibidor no processo fermentativo quando comparada à concentração de 1,75 g/l. 5. REFERÊNCIAS Agbogbo, F. K., Haagensen, F. D., Milam, D., Wenger, K. S., 2008. Fermentation of acid pretreated corn stover to ethanol without detoxification using Pichia stipitis. Appl Biochem Biotechnol. 145, 53-58. Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (Brasil), 2013. Anuário estatístico brasileiro do petróleo, gás natural e biocombustíveis:. Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis - Rio de Janeiro: ANP. Ask, M., Bettiga, M., Mapelli, V., Olsson, L., 2013. The influence of HMF and furfural on redoxbalance and energy-state of xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Biofuels. 6, 22, 1-13.
Ballesteros, M., 2001. Estado del desarrollo tecnológico del aprovechamiento de biomasa: biocombustibles para el sector del transporte. Energía. 161, 29-34. Behera, S, Arora, R, Nandhagopal, N, Kumar, S., 2014. Importance of chemical pretreatment for bioconversion of lignocellulosic biomass. Renew Sust Energ Rev. 26, 91-106. Bellido, C., Bolado, S., Coca, M., Lucas, S., González-Benito, G., García-Cubero, M. T., 2011. Effect of inhibitors formed during wheat straw pretreatment on ethanol fermentation by Pichia stipitis. Bioresource Technol. 102, 10868-10874. Cabral, J.C.A., Silva, J.P.A., Roberto, I.C., 2005. Influência do ph na produção de etanol por Pichia stipitis. In: 9º Encontro Latino Americano de Pós-Graduação, 9º, Lorena-SP. Chandel, A.K., Chandrasekhar, G., Radhika, K., Ravinder, R., Ravindra, P., 2011. Bioconversion of pentose sugar into ethanol: A review and future directions. Biotechnol Mol Biol Rev. 6, 1, 8-20. Demirbas, A., 2005. Bioethanol from cellulosic materials: a renewable motor fuel from biomass. Energ Source. 27, 327-337. Farias, D., Atala, D. I. P., Maugeri, F., 2012. Modelagem cinética da fermentação de xilose por Pichia stipitis. In: XIX Congresso Brasileiro de Engenharia Química. Búzios, RJ. Miller, G. L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31, 3, 426-428. Nigam, J. N., 2001. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J Biotechnol. 87, 17-27. Pereira Jr., N., 2007. Biomassas residuais de composição lignocelulósica para a produção de etanol e o contexto de refinaria. Rossell, C.E.V., 2008. Evolução tecnológica da produção de etanol. Expectativas futuras: destilarias otimizadas, etanol da hidrólise de bagaço. In: 60ª Reunião Anual da SBPC, Campinas-SP. Silva, J. P. A., Mussatto, S. I., Roberto, I. C., Teixeira, J. A., 2011. Ethanol production from xylose by Pichia stipitis NRRL Y-7124 in a stirred tank bioreactor. Braz J Chem Eng. 28, 1, 151-156. 6. AGRADECIMENTOS À Embrapa Agroenergia, pelo auxílio à pesquisa e doação da levedura, ao Programa PIBIC/UFS e ao CNPq pela bolsa de Iniciação Científica.