PRODUÇÃO DE ETANOL POR COMPLEXO ENZIMÁTICO E Pichia stipitis

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1 PRODUÇÃO DE ETANOL POR COMPLEXO ENZIMÁTICO E Pichia stipitis Saulo Luiz Cardoso 1, Janaína Fischer 2 e Ubirajara Coutinho Filho 3 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFU, discente do curso de Engenharia Química 2 Bolsista de doutorado CNPq/UFU, doutoranda do curso de Engenharia Química 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia-UFU/MG 1,2,3, Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia MG, CEP ucfilho@feq.ufu.br RESUMO - A crescente demanda comercial de etanol alavancou estudos sobre produção de etanol de segunda geração, obtido a partir de biomassa celulósica, como forma de reduzir a dependência do petróleo, os custos de produção e a poluição gerada pelo descarte de resíduos, além de ampliar a matriz energética brasileira. A Pichia stipitis é uma levedura que se destaca pela sua capacidade natural de fermentar pentoses e hexoses produzindo etanol nestas fermentações em concentrações que podem ultrapassar 40. Diante da demanda comercial de etanol e avanços nos estudos sobre produção de etanol de segunda geração, obtido a partir de biomassa celulósica, tem-se que fermentações com leveduras do gênero Pichia são cada vez mais avaliadas como alternativa ao uso da levedura Saccharomyces cerevisiae. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi fazer um estudo comparativo da produção de etanol de bagaço de cana tratado com a explosão a vapor utilizando Pichia stipitis e Saccharomyces cerevisiae na fermentação alcoólica. As fermentações alcoólicas foram realizadas em processo batelada com os complexos enzimáticos brutos, com sacarificação e fermentação simultânea. Os melhores resultados sugerem que o uso de Pichia stipitis em conjunto com Saccharomyces cerevisiae gera maior concentração final de etanol que o uso individual de cada um destas leveduras. A maior concentração de etanol encontrada foi de 15,3. Palavras-Chave: Etanol Celulósico, Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis. INTRODUÇÃO O aproveitamento de resíduos agroindustriais em processos de bioconversão tem recebido grande destaque no cenário mundial, devido ao fato de reduzir a poluição ambiental gerada por estes resíduos e ampliar a produção de etanol e a sustentabilidade do processo. Assim, o Brasil sendo um dos maiores produtores de biomassas agroindustriais, tais como farelo e casca de arroz e trigo, soro de leite, palha e bagaço de cana-de-açúcar, se destaca com potencial para produção de enzimas celulolíticas e etanol (Castro; Pereira Jr., 2010; Binod et al., 2012). Geralmente, o etanol produzido a partir de carboidratos complexos segue quatro etapas de processo: pré-tratamento de matérias-primas, hidrólise enzimática, fermentação de açúcares, etanol e recuperação (Binod et al., 2012, Rocha et al., 2013). Vários métodos de pré-tratamento têm sido propostos para modificar a estrutura rígida que caracteriza a lignocelulose. Para o bagaço de cana-de-açúcar, o pré-tratamento por explosão a vapor foi proposto como um dos mais promissores devido a sua compatibilidade em sistemas de biorrefinaria. Neste método, o material lignocelulósico é exposto a condições de elevada pressão seguidas de elevadas temperaturas e descompressão repentina, que causa a quebra da estrutura lignocelulósica associada à hidrólise da hemicelulose e despolimerização da celulose e lignina (Zúñiga, 2010; Balat e Balat, 2008). Outro pré-tratamento empregado é a hidrolise deste material por enzimas. As celulases são enzimas que formam um complexo capaz de atuar sobre materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. São biocatalisadores altamente

2 específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais a glicose desperta maior interesse industrial devido à possibilidade de sua conversão em etanol (Castro; Pereira Jr., 2010; Binod et al., 2012). Atualmente, há pesquisas voltadas para a produção do complexo de celulases por fungos filamentosos. Fungos filamentosos são mais comumente utilizados em fermentação em estado sólido (FES), para produção de complexos enzimáticos, devido à sua capacidade de crescer naturalmente em superfícies sólidas com atividade de água mais baixo e seu modo de crescimento de hifas, que podem penetrar mais profundamente no substrato. Fungos do gênero Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Chaetomium e Mucor tem sido relatados por vários pesquisadores como produtores de enzimas celulolíticas (El-Said e Saleem, 2008). Os fungos filamentosos podem ser encontrados em a mbientes não convencionais representam importantes fontes de biodiversidade natural apropriadas ao isolamento e seleção de micro-organismos de interesse biotecnológico. Somados a isso, áreas com elevada diversidade microbiana tendem a conservar melhor os bancos genéticos e, consequentemente, potencializam a chance de obter inovações (BUZZINI, et al., 2002). O Cerrado brasileiro é o segundo maior bioma da América do Sul, ocupando uma área de aproximadamente 2 milhões de km 2, que é cerca de 22% do território nacional, sendo considerado a savana mais rica do mundo em biodiversidade (MMA, 2013). Destaca-se como uma fonte ainda pouco explorada na obtenção de microorganismos com potencial para produção de enzimas que degradam a celulose. Com relação ao substrato empregado na etapa de fermentação para produção do etanol de segunda geração, o aproveitamento de resíduos agroindustriais em processos de produção de bioetanol celulósico no cenário mundial deve ser visto como um processo integrado com o uso da lignina em processo de combustão e a fermentação dos açúcares xilose e pentose presentes na biomassa de celulose para a produção de etanol. Neste contexto o uso de microrganismos capazes de fermentar a pentose e a arabinose representam uma necessidade para pleno aproveitamento da biomassa. Entre todos os microrganismos capazes de fermentar xilose e arabinose a levedura Pichia stipitis se destaca pela sua capacidade natural de realizar esta fermentação e produzir diretamente etanol nesta fermentação em concentrações de etanol que podem ultrapassar 40 (Lin et al., 2012; Agboggo e Coward-Kelly, 2008). As pentoses, arabinose e xilose, são geradas tanto no pré-tratamento de biomassas ricas em celulose como no processo de hidrólise enzimática necessário para liberação de glicose. A glicose gerada pela hidrólise enzimática, pode ser fermentada pela Saccharomyces cerevisiae e as pentoses podem ser fermentadas para produção de etanol pela Pichia stipitis. Em processo onde se utiliza a S. cerevisiae e a Pichia stipitis para a fermentação alcoólica em caldo com glicose e pentoses a maior produção de etanol ocorre quando se utiliza primeiro a S. cerevisiae. Este fato está relacionado ao metabolismo das pentoses que é diáuxico e ocorre ao fim da conversão das hexoses (Lin et al., 2012; Grootjen et al., 1991). Entre as diferentes investigações de uso de Saccharomyces e a Pichia tem-se o interesse de redução do custo de uso da celulase que hoje é o principal obstáculo à utilização de biomassa celulósica. Neste trabalho foi feita comparação do uso de Pichia stipitis e Saccharomyces cerevisiae na fermentação de etanol em meio contendo bagaço de cana e enzimas, produzidas por FES de resíduos agroindustriais e cepa selvagem Aspergillus niger. MATERIAL E MÉTODOS Microrganismos e Biomassas Foi utilizado Aspergillus niger (Figura 1), selecionado entre 66 culturas de fungos coletados do Cerrado do Triângulo Mineiro (Uberlândia/MG) (Fischer et al., 2013). As leveduras utilizadas nas fermentações alcoólicas foram a cepa Saccharomyces cerevisiae Y904, produzida pela Mauri Brasil Ind. Com. Ltda, na forma liofilizada e Pichia stipitis (CCT 2617 Andre Tosello). Figura 1 Aspergillus niger.

3 As biomassas utilizadas foram: farelo de arroz, adquirido de beneficiadora da região (Uberlândia/MG); bagaço de cana-de-açúcar sem tratamento; bagaço de cana tratado com explosão a vapor na condição de baixa severidade (12 kgf/cm 2 e tempo de 8 minutos), gentilmente cedido pelo Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), Piracicaba/SP. Fermentações Fermentação em estado sólido: As FES destinadas à produção de complexo enzimático foram realizadas em reator estático, contendo 10 7 a 10 8 células/g de Aspergillus niger e 40 g de substrato sólido, sendo 24 g de farelo do beneficiamento de arroz e 16 g de bagaço de cana-deaçúcar tratado. O tempo de fermentação foi de 72 h e a temperatura 30 ± 1 C. Os complexos enzimáticos foram extraídos com 100 ml de água deionizada e Tween 80 (1%), condições de acordo com Fischer et al. (2013). Fermentações alcoólicas (FA): as FAs para produção de etanol foram realizadas com complexo enzimático bruto produzido por FES, em reator batelada sobre mesa agitada, com volume reacional de 100 ml, com sacarificação e fermentação simultânea, e 25 g de substrato sólido (21 g de bagaço de cana tratado com explosão a vapor e 4 g de bagaço não tratado). O meio de fermentação alcoólica foi suplementado com fosfato de potássio monobásico 5,0, sulfato de magnésio 1,0, cloreto de amônio 1,0, cloreto de potássio 5,0 e extrato de levedura 1,0. As FAs foram conduzidas em dois procedimentos, de acordo com as condições citadas na literatura para cada levedura (Ferreira, 2010; Silva et al., 2012, Rocha et al., 2013). da S. cerevisiae (30 ), temperatura de 35 ± 1 C, ph de 4,5, 150 rpm e fermentado por mais 24 h. Métodos Analíticos A concentração de etanol, pentoses e hexoses foi determinada pelo método de Cromatografia de Alta Eficiência (HPLC). O processo cromatográfico consiste na partição dos componentes de uma mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. As amostras foram diluídas em água deionizada, filtrada e injetada no sistema cromatográfico marca Shimadzu modelo LC-20A Prominence, coluna SUPELCOGEL Ca, na qual os componentes são separados e detectados por refração de luz. A solução de arraste utilizada foi água deionizada, o fluxo de bomba 0,5 ml/min, temperatura do forno de 80 ºC e volume de injeção de 20 µl. O etanol e os açúcares foram determinados a partir de suas respectivas curvas de calibração. RESULTADOS E DISCUSSÃO Fermentações alcoólicas com Saccharomyces cerevisiae e Pichia stipitis Os resultados das fermentações alcoólicas (Figura 2) conjuntas de S. cerevisiae e P. stipitis com complexo enzimático de Aspergillus niger e bagaço de cana (FES), nos dois procedimentos estudados neste trabalho, estão apresentadas na Tabela 1 e 2. Procedimento 1: As FAs foram realizadas inicialmente com a S. cerevisiae (30 ), nas condições desta levedura: concentração de inóculo de 30, temperatura de 35 ± 1 C, ph de 4,5, 150 rpm. E após 24 h de FA, o caldo fermentado, foi ajustado para as condições da levedura P. stipitis (10 7 a 10 8 células/ml), temperatura de 30 ± 1 C, ph de 6,5, 150 rpm, e fermentado por mais 48 h. Procedimento 2: As FAs foram realizadas inicialmente com a P. stipitis (10 7 a 10 8 células/ml), temperatura de 30 ± 1 C, ph de 6,5, 150 rpm, durante 48 h de fermentação. Em seguida, o caldo de fermentação foi ajustado para condições Figura 2 Fermentação alcoólica. Na Tabela 1 podem ser observados os resultados das fermentações alcoólicas em que se

4 utilizou inicialmente a S. cerevisiae por 24 horas de fermentação em ph 4,5 e a seguir a P. stipitis por 48 horas, utilizando o ph de 6,5. A Tabela 2 apresenta o resultado das fermentações alcoólicas em que se utilizou inicialmente a P. stipitis por 48 horas de fermentação em ph 6,5 e a seguir a S. cerevisiae por 24 horas utilizando o ph de 4,5. Tabela 1 Concentrações dos diferentes constituintes de meio para fermentação alcoólica (FA) com a S. cerevisiae por 24 h, seguida pela adição de P. stipitis e 48 horas de fermentação S. cerevisiae (24 h de FA) P. stipitis (48 h de FA) Celobiose - - Xilose 3,5 ± 0,4 - Manose 3,1 ± 0,2 0,22 ± 0,4 Arabinose 3,3 ± 0,4 0,38 ± 0,3 Etanol 13,1 ± 0,2 15,3 ± 0,2 Tabela 2 Concentrações dos diferentes constituintes de meio para fermentação alcoólica com a P. stipitis por 48 h, seguida pela adição de S. cerevisiae e 24 h de fermentação P. stipitis (48 h de FA) S. cerevisiae (24 h de FA) Celobiose - - Xilose - Manose 0,20 ± 0,3 0,19 ± 0,2 Arabinose 0,55 ± 0,2 0,53 ± 0,3 Etanol 12,6 ± 0,1 12,5 ± 0,1 Os resultados mostram que a produção de etanol quando se utiliza S. cerevisiae na fermentação inicial foi 18,7% superior à fermentação iniciada com P. stipitis. Nota-se também, que a rota metabólica da P. stipitis estava voltada para a fermentação das pentoses e a produção de etanol, já que a adição da mesma proporcionou a redução na concentração das pentoses. Tal fato pode ser explicado pelo comportamento diáuxico da P. stipitis que faz com que na abundância de glicose ela venha só a utilizar pentoses ao esgotamento da glicose (Grootjen, 1991; Lin et al., 2012). A produção de etanol pelo uso sequencial de S. cerevisiae e P. stipitis foi maior que a utilização destas leveduras em simultâneo, nesta condição foi obtido 15,3 de etanol. Gupta, Sharma e Kuhad (2009) obtiveram o hidrolisado hemicelulósico contendo 18,24 de açúcares, quando fermentada com P. stipitis produziu 7,13 de etanol, após 24 h. Para a fermentação de hidrolisado celulósico (37,47 ), utilizando S. cerevisiae, obteve 18,52 de etanol, após 16 h. Estes autores estudaram a produção de etanol celulósico, utilizando como matériaprima a Prosopis juliflora (arbusto espinhoso comum da vegetação do semi-árido) e as leveduras Pichia stipitis NCIM 3498 para a fermentação das pentoses e Saccharomyces cerevisiae para fermentação das hexoses. CONCLUSÃO A comparação entre uso de fermentações sequênciais com Saccharomyces cerevisiae e Pichia stipitis e fermentações sequências de P. stipitis e S. cerevisiae mostram que a primeira situação favorece mais a produção de etanol. Estes resultados são satisfatórios, pois demonstram caminhos promissores para a produção de etanol de segunda geração, aproveitamento de resíduos agroindustriais, os quais têm baixo custo e são abundantes e pela potencialidade da cepa selvagem Aspergillus niger selecionada. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGBOGGO FK, COWARD-KELLY G.,2008. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol Lett, BALAT, M.; BALAT, H.; OZ, C. Progess in bioethanol processing, Progress in Energy and Combustion Science, BINOD P., KUTTIRAJA M., ARCHANA M., USHA J.K., SINDHU R., SUKUMARAN R.K., PANDEY A., 2012, High temperature pretreatment and hydrolysis of cotton stalk for producing sugars for bioethanol production, Fuel 92, BUZZINI, P.; MARTINI, A.,2002. Extracellular enzymatic activity profiles in yeast and yeastlike strains isolated from tropical environments. J. Appl. Microbiol, CASTRO, A. M.; PEREIRA Jr., N., Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, EL-SAID, A.H.M.; SALEEM, A.,2008. Ecological and physiological studies on soil fungi at western region, Libya. Mycobiol. FERREIRA, A. D., Utilização da levedura Pichia stipitis UFMG-IMG 43.2 para obtenção de etanol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Dissertação de Mestrado, Universidade de São Paulo, Escola de Engenharia de Lorena.

5 GROOTJEN, D.R.J.; MEIJLIK, H.H.M.; LANS, RGKM, LUBEN, A.M.,1991. Cofermetation of glucose and xylose with immobilized Pichia stipitis and Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microbiology Technology, GUPTA, R.; GUPTA, N.; RATHI, P., Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties. Appl Microbiol Biotechnol, FISCHER, J.; LOPES, V.; GALVÃO, C.; TEODORO, J.; FILHO, U.; CARDOSO, V.,2013. Utilization of Cheese Whey and Cellulosic Biomass for Production of Ethanol by Selected Fungi Strain from Brazilian Savannas. Chem. Eng. Trans, LIN TH, HUANG CF, GUO GL, HWANG WS, HUANG, SL.Pilot-scale ethanol production from rice straw hydrolysates using xylose-fermenting Pichia stipitis.bioresour Technol, MMA - MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE. O bioma Cerrado. Disponível em: A- cesso em: 10 set ROCHA, N.R.A.F.; BARROS, M.A.; FISCHER, J.; FILHO, U.C.; CARDOSO, V. L.,2013. Ethanol production from agroindustrial biomass using a crude enzyme complex produced by Aspergillus niger. Renewable Energy, SILVA, J. P. A.; MUSSATTO, S. I.; ROBERTO, I. C.; TEIXEIRA, J. A., Fermentation medium and oxygen transfer conditions that maximize the xylose conversion to ethanol by Pichia stipitis. Renewable Energy ZÚÑIGA, U.F.R. Desenvolvimento de um bioprocesso para produção de celulases específicas na cadeia produtiva do etanol de segunda geração, Tese (Doutorado em Ciências da Engenharia Ambiental) Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 228 p. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq (Projeto /2010-3, Edital 046/2009), CAPES e FAPEMIG pelo apoio financeiro e ao Centro de Cultura Canavieira (CTC) pela parceria em estudos conjuntos relacionados à produção de etanol. E a FEQ-UFU pela oportunidade de desenvolvimento do trabalho.