ICTR 2004 CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM RESÍDUOS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL Costão do Santinho Florianópolis Santa Catarina

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1 ICTR 2004 CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM RESÍDUOS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL Costão do Santinho Florianópolis Santa Catarina INIBIDORES DO PROCESSO FERMENTATIVO OBTIDOS DA FRAÇÃO HEMICELULÓSICA DAS APARAS DE EUCALIPTO ATRAVÉS DE HIDRÓLISE ÁCIDA Giovani Brandão Mafra de Carvalho Elisângela de Jesus Cândido João Batista de Almeida e Silva PRÓXIMA Realização: ICTR Instituto de Ciência e Tecnologia em Resíduos e Desenvolvimento Sustentável NISAM - USP Núcleo de Informações em Saúde Ambiental da USP

2 ICTR 2004 CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM RESÍDUOS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL Costão do Santinho Florianópolis Santa Catarina INIBIDORES DO PROCESSO FERMENTATIVO OBTIDOS DA FRAÇÃO HEMICELULÓSICA DAS APARAS DE EUCALIPTO ATRAVÉS DE HIDRÓLISE ÁCIDA ELISÂNGELA DE JESUS CÂNDIDO GIOVANI BRANDÃO MAFRA DE CARVALHO JOÃO BATISTA DE ALMEIDA E SILVA PRÓXIMA Realização: ICTR Instituto de Ciência e Tecnologia em Resíduos e Desenvolvimento Sustentável NISAM - USP Núcleo de Informações em Saúde Ambiental da USP

3 INIBIDORES DO PROCESSO FERMENTATIVO OBTIDOS DA FRAÇÃO HEMICELULÓSICA DAS APARAS DE EUCALIPTO ATRAVÉS DE HIDRÓLISE ÁCIDA Giovani Brandão Mafra de Carvalho 2, Elisângela de Jesus Cândido 3, João Batista de Almeida e Silva 4 RESUMO O reconhecimento da natureza finita dos combustíveis energéticos convencionais, a necessidade de se controlar a poluição ambiental e a mudança dos valores sociais e culturais têm incentivado a comunidade científica internacional a examinar fontes alternativas de materiais e energia. Uma solução prática para esses problemas é o desenvolvimento de tecnologias que permitam o uso de fontes renováveis de energia existentes na natureza, como a biomassa lignocelulósica. O potencial de aproveitamento da biomassa lignocelulósica baseia-se em sua composição química. Independente de sua origem, os materiais lignocelulósicos contem celulose, hemicelulose e lignina como principais componentes, em proporções que variam de 40 a 50%, 25 a 35% e 15 a 25%.Em função da facilidade da hidrólise da fração hemicelulósica desses resíduos, pode-se obter um hidrolisado rico em açúcares fermentescíveis, em particular a D-xilose e também compostos químicos indesejáveis conhecidos como inibidores do metabolismo microbiano tais como ácido acético furfural e 5-hidroximetilfurfural. Deste modo, aparas de eucalipto foram hidrolisadas em um reator batelada de aço com 40 L de capacidade útil de acordo com as seguintes condições: relação massa seca de madeira para solução ácida igual à 1:8,6; temperatura de C; tempo de reação de 20 minutos e concentração de 0,65% de ácido sulfúrico. As concentrações dos inibidores obtidos dessa hidrólise foram determinadas por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e apresentaram os seguintes valores: 4,410 g/l de ácido acético, 2,454 g/l de furfural e 0,207 g/l de 5-hidroximetilfurfural. Palavras-chave: hidrolisado, aparas de eucalipto, inibidores. 2 Mestrando do Programa de Biotecnologia Industrial Departamento de Biotecnologia / FAENQUIL 3 Doutoranda do Programa de Biotecnologia Industrial Departamento de Biotecnologia/ FAENQUIL 4 Doutor, professor e pesquisador do Departamento de Biotecnologia /FAENQUIL 2,3,4 FAENQUIL Faculdade de Engenharia Química de Lorena Caixa Postal 116 CEP: gbmafra@yahoo.com.br 4118

4 INTRODUÇÃO A biomassa lignocelulósica é composta basicamente por celulose, hemicelulose, lignina e pequenas quantidades de extrativos e sais minerais (Kuhad, 1993, p.151 ;Singh, 1995, p.53). A celulose, principal componente da parede celular da fibra vegetal, é um polímero linear de D-glicose cujas unidades estão unidas por ligações β (1-4) com uma estrutura cristalina altamente ordenada e de alta massa molecular (Kuhad, 1993, p.151;singh, 1995,p. 53). A lignina é composta de um conjunto de polímeros amorfos reticulares de alta massa molecular, geralmente associado com a celulose e a hemicelulose, com estrutura química fortemente aromática, composta por anéis de benzeno que contêm grupos fenólicos livres e metilados (Espinosa, 1972, p.8 ;Kuhad, 1993, p. 151, Singh, 1995, p.53 ;Ferraz, 2001, p.466). As hemiceluloses são polímeros ramificados compostos de polissacarídeos de baixa massa molecular, associados à parede celular das plantas com a celulose e a lignina (Puls, Schuseil, 1993, p.1 ;Bambanaste, 1995, p. 8). São heteroglicanos constituídos por relativamente poucos resíduos de açúcar, sendo os mais comuns a D-xilose, D- manose, D-galactose, D-glicose e L-arabinose, que conferem características aos diferentes tipos de hemicelulose como arabinogalactana, galactoglicomanana, glicomanana e arabinoxilana (Puls, Schuseil, 1993, p.1). O principal componente da fração hemicelulósica dos resíduos agro-industriais é a xilana, polímero constituído por unidades de xilose que pode ser hidrolisada usando ácidos minerais (Cowling, 1975, p. 163; Kuhad, 1993, p.151; Singh, 1995, p. 53). A xilana possui uma estrutura linear constituída de xilopiranosil unidos por ligações β (1-4) que são encontradas em todas as plantas terrestres e compreendem a 30% do material da parede celular. O aproveitamento dos resíduos florestais e agro-industriais como substratos em processos biotecnológicos para a produção de produtos de alto valor agregado é uma alternativa atrativa e promissora, uma vês que estes materiais são abundantes, renováveis e de baixo custo. A bioconversão destes materiais poliméricos requer um processo que compreende duas etapas: hidrólise, ácida ou enzimática, dos polímeros de açúcares em monossacarídeos, seguido de bioconversão dos monômeros em um produto de interesse industrial (Lohmeier-Voger et al., 1998, p. 175). Quando se realiza a hidrólise de materiais lignocelulósicos nota-se que a principal dificuldade encontrada no aproveitamento dos hidrolisados é que além da fração hemicelulósica podem ser encontrados outros compostos provenientes do processo de hidrólise tais como ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural, ácido fórmico, ácido levulínico, assim como compostos aromáticos derivados da degradação da lignina e dos extrativos da madeira, os quais possuem grande potencial inibitório na atividade fermentativa dos microrganismos. Portanto, é necessária a remoção ou redução de suas concentrações para que os hidrolisados possam ser empregados efetivamente nos processos de bioconversão (Parajó et al., 1998, p. 25). Visando um futuro aproveitamento da fração hemicelulósica das aparas de eucalipto em processos fermentativos, o presente trabalho buscou promover a hidrólise ácida deste resíduo florestal e quantificar os principais inibidores do metabolismo microbiano 4119

5 presentes neste hidrolisado para melhorar futuramente a fermentabilidade deste hidrolisado. MATERIAL E MÉTODOS Hidrólise ácida das aparas de eucalipto As aparas de eucalipto foram hidrolisadas em um reator de aço de 40 L de capacidade útil. A hidrólise foi realizada conforme metodologia estabelecida por Carvalho et al., 2004, p.18, de acordo com as seguintes condições: relação massa seca de madeira para solução ácida igual 1 para 8,6; temperatura de C; tempo de reação de 20 minutos e concentração de 0,65% de ácido sulfúrico. Determinação das concentrações de ácido acético As concentrações de açúcares e ácido acético foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) em equipamento Shimadzu-LC-10AD, empregando-se as seguintes condições: coluna Biorad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm), temperatura da coluna de 45 0 C, fluxo de eluente igual a 36 cm 3.h -1, volume da amostra injetada 20 μl. As amostras foram devidamente diluídas e filtradas em filtro Sepack C18 (Millipore) e o eluente antes do uso, foi filtrado à vácuo em membrana HAWP 0,45 μm (Millipore) e em seguida foi degaseificado em banho ultra-som (Microsonic SX-50) por 0,25 h. Determinação das concentrações de furfural e 5- hidroximetilfurfural As concentrações de furfural e 5-hidroximetilfurfural nos hidrolisados foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) em equipamento Shimadzu-LC-10AD, sob as seguintes condições: coluna Hewlett-Packard RP 18 (200 mm); temperatura da coluna: 25º C, detector de ultravioleta SPD-10A UV-VIS; eluente: solução de acetonitrila/água (1:8) com 1% de ácido acético; volume de amostra injetada 20μL. As amostras foram diluídas e filtradas a vácuo em membrana HAWP 0,45 μm (Millipore). O eluente foi filtrado a vácuo em membrana GVWP 0,22 μm (Millipore) e, em seguida, degaseificado em banho ultra-som (Microsonic SX-50) por 0,25h. 4120

6 RESULTADOS Tabela 1 Concentração dos principais inibidores do processo fermentativo determinados em hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto. Inibidores Valores encontrados no presente trabalho Valores da literatura constatados como inibidores Ácido acético 4,410 g/l 3,000 g/l Furfural 2,454 g/l 1,000 g/l 5-Hidroximetilfurfural 0,207 g/l 1,500 g/l DISCUSSÃO De acordo com os dados apresentados na Tabela 1, o hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto obtido no presente trabalho apresentou concentrações de inibidores tais quais 4,410, 2,454 e 0,207g/L de ácido acético, furfural e 5- hidroximetilfurfural respectivamente. Segundo Lohmeier-Voger et al., 1998, p. 175, o ácido acético é o principal derivado dos grupos acetila liberados das xilanas acetiladas nos hidrolisados hemicelulósicos. O modo de ação nas células de leveduras pode ser pela redução do ph intracelular, resultando em diminuição do crescimento e do metabolismo. A toxicidade do ácido acético na conversão de xilose em xilitol tem sido constatada quando este está presente em concentrações apreciáveis (aproximadamente 3 g/l) (FELIPE et al., 1994, p. 141). O hidrolisado obtido neste trabalho apresentou o valor na concentração de ácido acético superior ao inibitório conforme é demonstrado na Tabela 1. O ácido acético é considerado como um potente inibidor do metabolismo da xilose em leveduras e seu efeito é função da sua concentração na forma não dissociado (pka 4,75) e, portanto, depende do ph do meio de fermentação. No ph ótimo para fermentação por leveduras (ph 4,00 5,00) este ácido encontra-se em maior proporção sob a forma não dissociada, o qual difunde-se livremente para dentro do citoplasma, onde dissocia-se causando um decréscimo no ph intracelular. As leveduras são capazes de regular seu ph interno por meio de bomba de prótons mediante a ATPase situada no plasma da membrana. Quando o ph intracelular diminui, aumenta a atividade da ATPase resultando em uma prejudicial dissipação de ATP (KUSUMEGI et al., 1998, p. 213). Acima de uma certa concentração (3 g/l) de ácido acético, o catabolismo celular não pode gerar suficiente ATP, portanto, o gradiente de prótons na membrana não é mantido, a produção de energia é desajustada e o transporte de vários nutrientes é afetado (HERRERO et al., 1985, p.53). FELIPE (1994, p. 141) observou que nenhuma bioconversão ocorreu quando a levedura Candida guilliermondii cresceu em hidrolisado hemicelulósico de cana-deaçúcar contendo ácido acético em concentrações maiores que 5g/L e ph< 4,50. Segundo estudos realizados por SILVA (2001, p. 248), o efeito inibitório do ácido acético sobre a bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii dependeu 4121

7 da fase de crescimento da levedura, sendo este mais marcante quando o ácido se encontrava em maior concentração no meio após 12 horas de fermentação e que este efeito à levedura pode ser potencializado pela presença de outros compostos tóxicos no hidrolisado, tais como furfural, hidroximetilfurfural e fenóis. O furfural e o hidroximetilfurfural são os principais produtos formados pela desidratação das pentoses e hexoses, respectivamente. Em estudos realizados por SANCHES, BAUTISTA (1988, p. 315) o furfural e o hidroximetilfurfural provocaram retardamento no processo fermentativo no início da fermentação e inibiram o crescimento da levedura Candida guilliermondii. Estes efeitos foram provavelmente causados pela ação destes compostos sobre as enzimas glicolíticas triosefosfatodesidrogenase e a álcool desidrogenase. A inibição pelo furfural foi observada para concentrações maiores de 1,0 g/l e a inibição pelo hidroximetilfurfural para concentrações maiores que 1,5 g/l. O hidrolisado utilizado no presente trabalho apresentou concentração de hidroximetilfurfural de valor inferior ao considerado como inibitório, o que não pode ser observado quanto ao furfural (Tabela 1). Segundo estudos realizados com Pichia stipitis, o efeito tóxico do furfural foi relacionado à inibição na respiração e na fosforilação oxidativa (PARAJÓ et al., 1998, p. 25). WEIGERT et al. (1988, p. 895) atribuíram a inibição pelo furfural à sua interferência direta no transporte de elétrons na cadeia de transporte na mitocôndria. Soboleya (1974) citado por WEIGERT et al. (1988, p. 895), constatou efeito inibitório do furfural sobre a síntese de citocromos. A influência do furfural na via metabólica de utilização de açúcares e no crescimento microbiano é dependente da concentração deste no meio de cultivo. Na fermentação alcoólica empregando Saccharomyces cereviseae, AZHAR et al. (1981, p. 293), verificaram a inibição da multiplicação da levedura, em presença de furfural, na concentração de 3,0 g/l. CONCLUSÃO Concluiu-se que no presente trabalho, as concentrações de acido acético e do furfural determinadas, foram superiores aos valores constatados na literatura como inibidores do metabolismo microbiano. Um futuro tratamento deste hidrolisado poderá reduzir estes valores para níveis não inibitórios, melhorando a fermentabilidade do mesmo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). 4122

8 ABSTRACT The recognition of the finite nature of conventional energy fuels, the necessity of if controlling the ambient pollution and the change of the social and cultural values have stimulated international the scientific community to examine sources alternative of materials and energy. A practical solution for these problems is the development of technologies that allow the use of existing sources renewed of energy in the nature, as the lignocellulosic biomass. The potential of exploitation of the lignocellulosic biomass is based on its chemical composition. Independent of its origin, the lignocellulosic materials will count cellulose, hemicellulose and lignin as main components, in ratios that vary of 40-50%, 25-35% and 15-25%. In function of the easiness of hydrolysis of the hemicellulose fraction of these residues, can also be gotten hydrolysate rich in fermentative sugars, particular the D-xylose and chemical composites undesirable known as of the microbian metabolism such inhibiting as acid acetic, furfural and 5- hydroximetilfurfural. In this way, eucalyptus shavings had been hydrolysate in a bath reactor with 40 L of useful capacity in accordance with the following conditions: relation wooden dry mass for equal acid solution to the 1:8,6; temperature of C; time of reaction of 20 minutes and concentration of sulfuric acid 0,65%. The concentrations of gotten inhibitors of this hydrolysis had been determined by HPLC and had presented the following values: 4,410 g/l of acid acetic, 2,454 g/l of furfural and 0,207 g/l of 5- hydroximetilfurfural. Words Key: hydrolysate, Eucalyptus shavings, inhibitors. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS KHUAD, R. C., SINGH, A., Lignocellulosic biotechnology: current and future prospects. Critical Rewiews in Biotechnology, v. 13, nr. 2, p , SINGH, A., MISHRA, P. Microbialpentose utilization. Current applications in Biotechnology. Progress in Industrial Microbiology. Elsevier Science, v.33, ESPINOSA, J.A. Informe Temático Sobre La Utilización De La Lignina. Informe Interno. ICIDCA, Cuba, p.7-10,1972. FERRAZ, A. Aplicações da biotecnologia na produção de papel e celulose. Biotecnologia Industrial, Editora Edgard Blücher LTDA - Cap 21, v 3, p , PULS, J., SCHUSEIL, J. IN: COUGHLAN, M. P & HAZLEWOOD, G. P. Hemicellulose and Hemicellulases. Portland Press, Cambridge, p. 1-27,

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