UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA SONIA CRISTINA MEDEIROS SANTOS AVALIAÇÃO DO SISTEMA DESCONTÍNUO ALIMENTADO REPETIDO PARA A PRODUÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE EUCALIPTO Lorena SP 27

2 SONIA CRISTINA MEDEIROS SANTOS Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de Biomassa Orientador: Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata Lorena SP 27

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo Santos, Sonia Cristina Medeiros Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3- butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto / Sonia Cristina Medeiros Santos ; orientador Arnaldo Márcio Ramalho Prata f. : fig. Tese (Doutorado Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de biomassa) Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo 1. Biotecnologia 2. Hidrolisado hemicelulósico 3. Butanodiol 4. Sistema descontínuo alimentado repetido 5. Klebsiella pneumoniae 6. Inibidores microbianos 7. Fermentação. I. Título CDU

4 Sonia Cristina Medeiros Santos Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor. Área de Concentração: Conversão de Biomassa Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura:

5 AGRADECIMENTOS A Deus que está em tudo! Ao Rodrigo meu marido e companheiro e as nossas famílias, pelo amor, dedicação, apoio e força. Ao meu Orientador Arnaldo Márcio Ramalho Prata, que acreditou no meu trabalho e esteve sempre presente, pela orientação, amizade e confiança. Ao meu Padrinho Eduardo Sales, Walter Dias, Ana Maria, Morena, Zé Brazão e a todos que contribuíram em muito na minha jornada. A Escola de Engenharia de Lorena/USP pela oportunidade da realização deste trabalho. Aos amigos Adriana, Andréa Doria, Andrezinho, Dani Borba, Dani Cortez, Daniel, Denise, Fran, Gilvani, Júlio, Larissa, Lili, Marcos Paulo, Martica, Marton, Pérola, Priscila, Priscila Brazil, Rita, Rogérios, Rodrigo (IC), Solange, Taís, Waltinho e a todos os colegas pela amizade, brincadeiras e sugestões. A todos os Professores e funcionários do Departamento de Biotecnologia, em especial, Djalma, Fabrício, Jussara, Paulinho, Rita, Zé Cobrinha e Zé Moreira, pela força, trabalho e amizade. A todos os funcionários da EEL que colaboraram para a realização deste trabalho. À CAPES, pelo apoio financeiro. A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Pela força e amizade, muito obrigada!!!

6 RESUMO SANTOS, S.C.M. Avaliação do Sistema Descontínuo Alimentado Repetido para a Produção de 2,3-Butanodiol a partir de Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo, 27. Os materiais lignocelulósicos, como as aparas de eucalipto, são uma abundante e renovável fonte de celulose e hemicelulose que podem servir como matéria-prima para a produção de diversos compostos químicos. Esses materiais contêm açúcares polimerizados que podem ser liberados por hidrólise, e, subseqüentemente, fermentados por diversos microrganismos. O emprego desses materiais tem sido considerado de interesse na área de conversão de biomassa em combustíveis líquidos e substâncias químicas de interesse industrial, como é o caso do 2,3-butanodiol. Um dos principais problemas relativos à utilização de hidrolisados hemicelulósicos é a presença de vários compostos tóxicos, inibidores do metabolismo microbiano. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estratégia de vazões crescentes de alimentação com meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para produção fermentativa de 2,3-butanodiol em sistema descontínuo alimentado por Klebsiella pneumoniae, proporcionando, assim, uma maior adaptação da cultura aos inibidores, uma vez que estes serão adicionados progressivamente ao meio de fermentação. Além disso, avaliou-se o sistema descontínuo alimentado repetido, com a reutilização das células já adaptadas ao meio contendo hidrolisado e em fase de produção, visando um aumento de produtividade do processo. Avaliou-se este sistema empregando-se hidrolisado tratado com carvão ativo e hidrolisado tratado com resinas de troca iônica. O aumento da vazão foi realizado de forma a se preencher o biorreator com o meio em 3 tempos: 7, 1 e 13 horas, com diferentes valores de concentração de substrato (Si) no meio de alimentação: 1, 15 e 2 g/l. O aumento do tempo de adição de meio melhora os resultados, assim como com a diminuição de Si. Porém, a estratégia de vazão crescente não apresentou vantagem em relação aos parâmetros fermentativos avaliados, quando comparados aos encontrados na literatura que empregaram vazão constante. Os valores de vazão de alimentação constante e de Si iguais a 72 ml/h e 1 g/l, respectivamente, foram empregados tanto para o hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA) quanto para o tratado com resina de troca iônica (HRI) para a realização do processo em sistema descontínuo alimentado repetido. Com o emprego deste sistema para o hidrolisado tratado com carvão obteve-se 14,84 g/l de produto, Y P/S de,27 g/g e Qp de,62 g/h no 1 o ciclo, enquanto que para o hidrolisado tratado com resina os valores foram de 3,4 g/l de produto, Y P/S de,32 g/g e Qp de 1,22 g/h até o 4 o ciclo. Conclui-se que o tratamento com resinas de troca iônica para remoção dos compostos tóxicos é mais eficiente que o tratamento com carvão ativo, e a reutilização das células favorece o processo, por estarem com seu metabolismo em plena atividade produtiva no momento do corte, ou seja, para o próximo ciclo. Palavras-chave: Hidrolisado hemicelulósico. Butanodiol. Sistema descontínuo alimentado repetido. Klebsiella pneumoniae. Fermentação. Inibidores microbianos.

7 ABSTRACT SANTOS, S.C.M. Evaluation of the repeated fed-batch system for the 2,3- butanediol production from Eucalyptus hemicellulosic hydrolysate f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 27. Lignocellulosic materials, like eucalyptus chips, are an abundant and renewable cellulose and hemicellulose source that can serve as raw material for the production of several chemical compounds. These materials contain polymerized sugars that can be released by hydrolysis process, and, subsequently, fermented by several microorganisms. These materials has been converted, by biotechnological route, into liquid fuels and chemical substances of industrial interest, like 2,3- butanediol. One of the main problems related to the use of hemicellulosic hydrolysate is the presence of several toxic compounds, inhibitors of the microbial metabolism. This work aimed to evaluate the increasing feeding rate strategy with medium prepared with eucalyptus hemicellulosic hydrolysate for fermentative production of 2,3-butanodiol in fed-batch system by Klebsiella pneumoniae. This system provides higher adaptation of the culture to the inhibitors, wich will be added progressively to the fermentation medium. Besides, the repeated fed-batch system was evaluated with the recycle of the cells already adapted to the medium containing hydrolysate in order to increase the productivity of the process. This system was evaluated by using hydrolysate treated with active charcoal and hydrolysate treated with ionic exchange resins. The increase of the feeding rate was accomplished by filling out the biorreator with the medium at 3 times: 7, 1 and 13 hours, with different values of substrate concentration in the feeding medium (Si): 1, 15 and 2 g/l. The time increase of medium addition improves the results, as well as the decrease of Si. However, the strategy of increasing feeding rate did not present better results of the evaluated fermentative parameters, in relation to the values for constant feeding rate found in the literature. The 72 ml/h constant feeding rate and 1 g/l Si were used for the hydrolysate treated with active charcoal (HCA) as for that treated with ionic exchange resins (HRI) in order to accomplish the process in repeated fed-batch system. Using this system it was obtained 14,84 g/l of product,,27 g/g Y P/S and,62 g/h Qp in the first cycle with the hydrolysate treated with active charcoal, while for the hydrolysate treated with resin the values were 3,4 g/l of product,,32 g/g Y P/S and 1,22 g/h Qp until fourth cycle. The treatment with ionic exchange resins for the toxic compounds removal is more efficient than the treatment with actived charcoal, and the recycle of the cells favors the process, due to their metabolism be in productive activity at the moment of the cut, for the next cycle. Keywords: Eucalyptus hemicelullosic hydrolysate. 2,3-Butanodiol. Repeated fedbatch. Klebsiella pneumoniae. Fermentation. Microbial inhibitors.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 2.1 Reações que ocorreram durante a hidrólise do material lignocelulósico...2 Figura 2.2 Classificação das principais bactérias produtoras de 2,3-butanodiol (MAGEE e KOSARIC, 1987)...37 Figura 2.3 Vias metabólicas de formação dos produtos da fermentação de carboidratos por Klebsiella pneumoniae...39 Figura 3.1 Picador de madeira...44 Figura 3.2 Reator de hidrólise (capacidade útil de 5L)...45 Figura 3.3 Evaporador a vácuo de coluna capacidade de 4L, operando a 7 ± 2 o C...46 Figura 3.4 Sistema de 4 colunas de vidro encamisadas na seqüência A-18S; A-5, C-15 e A13S...48 Figura 3.5 Variação exponencial do volume de meio no reator nos ensaios...51 Figura 3.6 Variação linear da vazão de alimentação nos ensaios com adição do meio de alimentação em 4, 7, 1 e 13 horas...51 Figura 4.1 Aspecto do hidrolisado concentrado e sem tratamento (HC), e após tratamento com resinas de troca iônica A86, A5, C15 e A13S...61 Figura 4.2 Concentração de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 1 horas (C) com valor de Si=2 g/l...63 Figura 4.3 Massa de células formada Mxf (- -), de substrato consumido Msc (- -) e de produto formado Mpf (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 1 horas (C) com valor de Si=2 g/l...64 Figura 4.4 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 1 horas (C) com valor de Si=2 g/l...65 Figura 4.5 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 1 horas (C) com valor de Si=2 g/l...66 Figura 4.6 Concentração de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C) com Si=15 g/l...69 Figura 4.7 Massa de células formada Mxf (- -), de substrato consumido Msc (- -) e de produto formado Mpf (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C) com Si=15 g/l...7

9 Figura 4.8 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 1 horas (C) com Si=15 g/l...71 Figura 4.9 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C) com Si=15 g/l...72 Figura 4.1 Concentração de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C) com Si=1 g/l...75 Figura 4.11 Massa de células formada Mxf (- -), de substrato consumido Msc (- -) e de produto formado Mpf (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C) com Si=1 g/l...76 Figura 4.12 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 1 horas (C) com Si=1 g/l...77 Figura 4.13 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C) com Si=1 g/l...78 Figura 4.14 Concentrações de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 ml/h com Si=1 g/l...8 Figura 4.15 Massa de células formadas (- -), de substrato consumido (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 ml/h com Si=1 g/l...81 Figura 4.16 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 ml/h com Si=1 g/l...81 Figura 4.17 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 ml/h com Si=1 g/l...82 Figura 4.18 Concentrações de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...86 Figura 4.19 Massa de células formadas (- -), de substrato consumido (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...86

10 Figura 4.2 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...87 Figura 4.21 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...87 Figura 4.22 Concentrações de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...89 Figura 4.23 Massa de células formadas (- -), de substrato consumido (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...89 Figura 4.24 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...9 Figura 4.25 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=1 g/l e vazão de alimentação constante de 72 ml/h...9 Figura 4.26 Concentrações de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi, R1 e R2, empregando hidrolisado HCA...93 Figura 4.27 Massa de células formadas (- -), de substrato consumido (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA...94 Figura 4.28 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA...95 Figura 4.29 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA...96 Figura 4.3 Concentrações de células (- -), de substrato (- -) e de produto (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos empregando hidrolisado HRI...99 Figura 4.31 Massa de células formadas (- -), de substrato consumido (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI...11

11 Figura 4.32 Velocidades de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI...13 Figura 4.33 Velocidades de específicas de formação de células (- -), de consumo de substrato (- -) e de produto formado (- -), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI...15

12 LISTA DE TABELAS Tabela 2.1 Classificação das resinas de troca iônica em função do grupo funcional e da força iônica...29 Tabela 2.2 Ordem de afinidade de diferentes resinas por íons em soluções diluídas (HARLAND, 1994)...3 Tabela 2.3 Aplicações do 2,3-butanodiol e alguns derivados...36 Tabela 3.1 Composição do meio empregado por Frazer e McCaskey, (1989)...49 Tabela 3.2 Valores de vazão e volume para os ensaios com adição do meio 75 ml de alimentação...52 Tabela 4.1 Composição do hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto...59 Tabela 4.2 Composição do hidrolisado hemicelulósico concentrado tratado com carvão (HCA) e resina de troca iônica (HRI)...6 Tabela 4.3 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do meio de alimentação com Si=2 g/l: 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C)...62 Tabela 4.4 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do meio de alimentação com Si=15 g/l: 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C)...68 Tabela 4.5 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do meio de alimentação com Si=1 g/l: 7 horas (A), 1 horas (B) e 13 horas (C)...79 Tabela 4.6 Parâmetros fermentativos dos ensaios com Si=1 g/l e vazão constante de 72 ml/h...82 Tabela 4.7 Parâmetros fermentativos dos melhores ensaios para definição do tempo de adição do meio de alimentação...83 Tabela 4.8 Composição dos hidrolisados HCA e HRI...85 Tabela 4.9 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de corte (TC) para adição do meio de alimentação para HCA e HRI...91 Tabela 4.1 Parâmetros fermentativos dos ensaios em sistema descontínuo alimentado repetido, empregando hidrolisado HCA...97 Tabela 4.11 Parâmetros fermentativos dos ensaios em sistema descontínuo alimentado repetido, empregando hidrolisado HRI...17

13 SUMÁRIO 1 Introdução Revisão Bibliográfica Materiais Lignocelulósicos Hidrolisados de biomassa vegetal Tratamento do hidrolisado Adaptação do microrganismo ,3-Butanodiol Características e aplicações Microrganismos produtores Fatores que influenciam a formação de 2,3-butanodiol Recuperação do produto Material e Métodos Obtenção do Hidrolisado Hemicelulósico Concentração do hidrolisado Tratamento do hidrolisado Precipitação e adsorção por carvão ativo (HCA) Extração com resinas de troca iônica (HRI) Fermentação Microrganismo Meio de preparo do inóculo Meios de Fermentação Meio da Fase Descontínua Meio de Alimentação Condições de fermentação Seqüência experimental Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA) Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no sistema descontínuo alimentado repetido Definição do tempo de corte para os hidrolisados tratados HCA e HRI Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para os hidrolisados tratados HCA e HRI Métodos analíticos Concentração de Açúcares e Ácido Acético Concentração de produtos Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural Determinação de fenóis totais Concentração celular...55

14 3.6.6 Coeficiente Volumétrico de Transferência de Oxigênio (k L a) Parâmetros Fermentativos Metodologia de análise dos resultados Resultados e Discussão Obtenção e Concentração do Hidrolisado Tratamento com carvão ativo e resinas de troca iônica Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado com carvão ativo Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no sistema descontínuo alimentado repetido Definição do tempo de corte para o hidrolisado HCA e HRI Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para hidrolisado tratado com carvão ativo Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para hidrolisado tratado com resina de troca iônica Conclusões Sugestões para Trabalhos Futuros Referências Bibliográficas Apêndices...123

15 13 1. INTRODUÇÃO Os materiais lignocelulósicos, como os resíduos agrícolas e florestais, são uma abundante e renovável fonte de celulose e hemicelulose que pode servir como matéria-prima para a produção de diversos compostos químicos. Nas últimas décadas, o eucalipto tem sido o gênero florestal mais utilizado para aumentar a área de plantações utilizadas com fins industriais no Brasil, contribuindo assim para o desenvolvimento da indústria madeireira e de polpa e papel. O Brasil é um dos líderes na plantação florestal, com uma área plantada de 6,7 milhões de hectares, os quais representam 22% do total mundial. Conforme dados da literatura, somente 5% do peso seco total do eucalipto é aproveitado pela indústria, permanecendo o restante no campo, na forma de folhas, galhos, e cascas (BERNARDO et al, 1998). Esses materiais contêm açúcares polimerizados que podem ser liberados por hidrólise, e, subseqüentemente, fermentados por diversos microrganismos. O emprego desses materiais para a produção de butanodiol tem sido considerado de interesse na área de conversão de biomassa em combustíveis líquidos e substâncias químicas de interesse industrial. Um dos principais problemas relativos à utilização do hidrolisado hemicelulósico é a presença de vários compostos tóxicos, normalmente formados durante sua obtenção. Existe uma variedade de tratamentos cujo objetivo é reduzir as concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados a níveis não inibitórios ou até mesmo eliminá-los, visando a melhoria da fermentabilidade dos hidrolisados. Outra forma de contornar o problema é a adaptação do microrganismo ao meio que contém tais compostos. A produção de butanodiol por via fermentativa se justifica por ser um importante intermediário químico, podendo ser transformado em diversas substâncias de interesse para a indústria. Entre essas destacam-se o 1,3-butadieno, principal componente da borracha sintética, e a metil-etil-cetona (MEC), um solvente amplamente empregado na indústria química. Pode ser também utilizado como anticongelante, devido ao baixo ponto de congelamento e como crioprotetor. Suas características físico-químicas conferem a este composto, um grande potencial como combustível líquido, o qual tem despertado grande interesse nos últimos anos, sobretudo por não ser proveniente do petróleo.

16 14 A maioria das substâncias nas quais o butanodiol pode ser convertido, atualmente são obtidas a partir do petróleo. Porém, a atividade industrial baseada nessa matéria-prima encontra-se sempre ameaçada por problemas de esgotamento ou políticos. Assim, o desenvolvimento de uma tecnologia para produção de butanodiol por fermentação, resultando num custo mais baixo para sua obtenção, constitui uma alternativa estratégica para a obtenção dos compostos mencionados. O desenvolvimento do processo de produção por via fermentativa, no que diz respeito ao aumento da concentração final de produto, é fundamental não apenas sob o aspecto comercial, como também sob o ponto de vista de recuperação do produto do meio fermentado. A extração se torna mais viável economicamente à medida que se obtém maiores concentrações de produto no meio. Vários trabalhos realizados no Departamento de Biotecnologia da EEL/USP empregaram hidrolisado de cavacos de eucalipto para a produção de butanodiol, obtendo-se resultados considerados satisfatórios comparados aos encontrados na literatura. Prata (1997) empregou o sistema descontínuo alimentado para produzir 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, obtendo uma produtividade e eficiência de 4 g/h e 8%, respectivamente, porém com uma concentração relativamente baixa, comparando com os dados da literatura. Entendese que esta concentração pode ser aumentada fornecendo-se uma maior quantidade de substrato, uma vez que a eficiência de conversão apresentou um valor próximo do teórico. Além disso, com base nos resultados de Garcia (1999), verificou-se que com uma vazão de 72, ml/h e uma concentração inicial de substrato Si de 9 g/l não houve acúmulo de substrato durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. Isso possibilita a utilização de uma vazão de alimentação maior, o que resultaria em maiores valores de produtividade. Assim, propõe-se neste trabalho estudar a produção fermentativa de butanodiol utilizando como matéria-prima as aparas de eucalipto, consideradas resíduos florestais, que são acumuladas na natureza durante o corte da madeira, e testar um novo sistema de condução do processo, o descontínuo alimentado repetido, com a reutilização das células já adaptadas ao meio contendo hidrolisado em fase de produção, visando um aumento de produtividade do processo.

17 15 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Materiais Lignocelulósicos Os materiais lignocelulósicos são importantes fontes de substrato, uma vez que grandes quantidades de resíduos florestais e agro-industriais são gerados e acumulados na natureza, decorrentes de atividades industriais e agrícolas. Estes resíduos constituem reservas naturais renováveis e representam uma importante fonte de matérias primas de baixo custo que podem ser utilizadas para obtenção de produtos de alto valor agregado, podendo ser convertidos em energia, produtos químicos e alimentos (KERN et al., 1998; SHAN e LEE, 1994). Os três maiores constituintes da biomassa lignocelulósica são a celulose, a hemicelulose e a lignina, em proporções que variam de 4 a 5%, 15 a 3% e 1 a 3%, respectivamente (DEKKER, 1985). Como exemplo tem-se o eucalipto, com cerca de 4 a 62% de celulose, 12 a 22% de hemicelulose e 15 a 22% de lignina (VITAL, DELLA LUCIA, 1986). Garcia (26) encontrou para o resíduo constituído por folhas, cascas e galhos de eucalipto, os valores de 31,2% de celulose, 15,7% de hemicelulose e 28,3% de lignina. A celulose principal componente da parede celular da fibra vegetal é um polímero linear formado por unidades de glicose unidas por ligações glicosídicas β-1,4 com estrutura cristalina altamente ordenada e alta massa molecular (FAN et al., 1982; KUHAD e SINGH,1993). A hemicelulose é um polímero complexo, constituído das pentoses xilose e arabinose, e das hexoses manose, glicose, galactose e ácidos urônicos (FENGEL e WEGENER, 1989; KUHAD e SINGH,1993). O principal componente da fração hemicelulósica dos resíduos agro-industriais é a xilana, polímero constituído por unidades de xilose que pode ser hidrolisado usando-se ácidos minerais. A xilana possui estrutura linear constituída de unidades xilopiranosídicas unidas por ligações β-1,4, é encontrada em todas as plantas terrestres e compreende 3% do material da parede celular (VILKARI, et al, 1993). A lignina é composta de um conjunto de polímeros amorfos reticulares de alta massa molecular, geralmente associados com a celulose e a hemicelulose. Tem estrutura química fortemente aromática, composta por anéis de benzeno que contém

18 16 grupos fenólicos livres e metilados (FENGEL e WEGENER, 1989; KUHAD e SINGH,1993). Os constituintes menores da biomassa vegetal incluem extrativos e não extrativos. As madeiras contêm 1-8% de extrativos, em base seca, que consistem de gomas, alcalóides, amidos, graxas, gorduras, resinas e óleos essenciais, entre outros. Os não extrativos compreendem a,2-,8% da madeira, em base seca, e incluem compostos inorgânicos como sílica, carbonatos e oxalatos (FENGEL, WEGNER, 1989). O emprego da biotecnologia é uma maneira de fazer com que a biomassa agrícola e florestal, rica fonte de carboidratos (MOHANDAS et al., 1995) se torne um substrato utilizado pelos microrganismos para a produção de insumos úteis como a acetona, o ácido acético, o butanol e o ácido butírico (SADDLER et al., 1983), dentre outros. O eucalipto é originário da Austrália, pertence à família Myrtacea e é a principal matéria-prima da indústria brasileira de papel e celulose. Nas últimas décadas, o eucalipto tem sido o gênero florestal mais utilizado para aumentar a área de plantações utilizadas com fins industriais no Brasil, contribuindo assim para o desenvolvimento das indústrias madeireiras e de polpa e papel. O crescimento rápido torna a madeira muito rentável, sendo utilizada para embalagens, fabricação de postes de luz e telefonia e como combustível industrial (ENCARTA, 21). Segundo a FAO (2) somente em 2, foram plantados 2,96 milhões de hectares, representando 59,5% da área total de plantações florestais no país. As maiores áreas reflorestadas com eucalipto estão localizadas nos Estados de Minas Gerais (51,8%), São Paulo (19,4%), Bahia (7,2%) e Espírito Santo (5,1%). Segundo a Sociedade Brasileira de Silvicultura (SBS), o Brasil é atualmente responsável por 2% do comércio mundial de papel (11º produtor mundial) e 5% do comércio de celulose (7º produtor mundial), isto contabilizado os produtos obtidos de outras espécies de madeira utilizadas, como pinus e araucária. (SELING et al., 21). De acordo com o Inventário Florestal das Áreas Reflorestadas do Estado de São Paulo (22) 79,4% da área média das plantações é de Eucalyptus, com predominância das espécies E. grandis (26%) e E. saligna (15%). Segundo a SBS, a produtividade média das plantações de Eucalyptus é de 34 m 3 /ha.ano (SELING et al., 21).

19 17 Uma grande quantidade de resíduos é gerada durante o corte da madeira, geralmente esses resíduos não são aproveitados no momento da colheita. De 5 a 75% dos ramos, folhas e raízes das árvores ficam no campo e a isto são adicionados os resíduos gerados em operações de polpação e moagem (SINGH e MISHRA, 1995). De acordo com Dale (1987) o custo de vários produtos de fermentação dependem do custo da fonte de carboidrato. Segundo este autor, a conversão de materiais lignocelulósicos oferece potencial para a obtenção de açúcares fermentescíveis de baixo custo. Para isto é de fundamental importância o uso integrado de todos os componentes dos materiais lignocelulósicos e o desenvolvimento de pré-tratamentos que possibilitem o aumento do rendimento da hidrólise da celulose Hidrolisados de biomassa vegetal Vários processos foram desenvolvidos e adaptados visando o fracionamento da biomassa vegetal em seus principais constituintes, para a posterior utilização da fração hemicelulósica, que apresenta como principal componente a xilose (GARCIA et al., 24; LARSSON et al., 1999; ROBERTO et al., 1991a; SILVA et al, 1998). De acordo com McMillan (1992) citado por Kim et al. (2), a hidrólise ácida é um dos métodos mais utilizados para a separação da hemicelulose da biomassa lignocelulósica. Normalmente a hidrólise ácida é realizada em temperaturas entre 12 e 2 o C, com a adição de pequenas quantidades de ácidos como H 2 SO 4, promovendo a separação de açúcares e da lignina (GRETHLEIN e CONVERSE, 1991; TOREGET e HSU, 1994), citados por Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2b). Neste processo, a concentração de ácido e a temperatura são fatores cruciais para formação de compostos tóxicos. Temperaturas moderadas (<16 o C) mostraram ser adequadas para hidrólise hemicelulósica, promovendo pouca decomposição do açúcar. Por outro lado, temperaturas acima de 16 o C favorece a hidrólise da celulose, produzindo grandes quantidades de açúcares e produtos da decomposição da lignina (McMILLAN, 1994a). Garcia (26) obteve o máximo de rendimento da extração de hemicelulose de aparas de eucalipto, conduzindo a hidrólise a 16 o C.

20 18 Segundo Harris (1975) citado por Jeffries et al. (1984), a hemicelulose tal como xilana tem mais ramificações, estrutura menos cristalina que a celulose, e as ligações glicosídicas entre os resíduos anidro-d-xilose nas xilanas são menos estáveis e mais rapidamente rompidas pelo ácido do que as ligações entre os resíduos de D-glicose na celulose. Como conseqüência as pentoses podem ser mais facilmente extraídas do material lignocelulósico através deste método de hidrólise. O pré-tratamento empregado deve ser energeticamente e quimicamente eficiente, ou seja, o processo de conversão de biomassa deve ser economicamente vantajoso. Deve propiciar a conversão eficiente do carboidrato disponível em açúcares fermentescíveis, para se obter alto rendimento do produto de interesse. Logo, a degradação ou a perda de carboidratos deve ser evitada, bem como a formação de compostos inibidores do metabolismo celular (McMILLAN, 1994a). Esta condição também é mencionada por Garg e Jain (1995) em sua revisão sobre produção fermentativa de 2,3-butanodiol. Como exemplo pode-se citar o trabalho de Shan e Lee (1994), que desenvolveram um processo de produção de acetona-butanol a partir de madeira, através do sistema de fermentação extrativa e sacarificação associadas. Neste estudo foram empregadas enzimas que hidrolisavam a fração celulósica e hemicelulósica da madeira. GONG et al. (1997), utilizando material lignocelulósico, empregaram um processo de sacarificação e fermentação simultâneas para a produção de 2,3-butanodiol. Neste processo as frações de celulose e hemicelulose foram hidrolisadas pela celulase obtendo-se glicose, xilose e uma mistura de outros açúcares em menor quantidade, predominando arabinose. Simultaneamente estes açúcares foram convertidos a 2,3-butanodiol pela bactéria Klebsiella oxytoca ATCC Neste processo, obtiveram-se maiores velocidades de hidrólise e rendimento em produto quando comparados com aqueles envolvendo hidrólise e fermentação separadas. Um dos principais problemas relativos à utilização de hidrolisados hemicelulósicos é a presença de substâncias inibidoras do metabolismo dos microrganismos fermentadores (FRAZER e McCASKEY, 1989; YU et al., 1982). Tais inibidores são liberados ou formados durante o processo de hidrólise ácida dos materiais lignocelulósicos (FRAZER e McCASKEY, 1989). A composição dos inibidores varia com as condições de hidrólise empregadas e a fonte de materiais lignocelulósicos. A temperatura do processo de hidrólise, o tempo e a concentração

21 19 de ácido utilizada são fatores que influenciam na formação dos inibidores da fermentação (OVEREND e CHORNET, 1987), citados por Taherzadeh et al. (2). O hidrolisado obtido por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos necessita ser concentrado, para aumentar o teor de açúcares, antes de ser utilizado como substrato num processo fermentativo como o de produção de 2,3-butanodiol. Isto porque a concentração de açúcar do meio deve estar em torno de 1 g/l (JANSEN et al, 1984; SILVEIRA, 1991) e os hidrolisados contêm de 25 (ALMEIDA e SILVA, 1996) a 4 g/l de carboidratos fermentescíveis (GARCIA, 26). Os compostos tóxicos presentes no hidrolisado podem causar inibição do crescimento celular e limitação do consumo dos açúcares presentes, inibindo assim, a formação do produto e o rendimento do processo (PARAJÓ et al., 1998c). Ocasionalmente, a inibição é o resultado do efeito sinergístico, ou seja, interação dos efeitos negativos dos compostos tóxicos proporcionando um aumento da inibição existente. Os inibidores também aumentam o stress químico do meio até um certo limite, porém podem proporcionar a morte celular, se a capacidade da célula de resposta ao stress for excedida (PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, 2b). Leonard & Hajny (1945), citados por Parajó et al. (1998c), consideraram os seguintes inibidores: (i) minerais ou metais pesados contidos no material lignocelulósico ou resultantes da corrosão do equipamento de hidrólise; (ii) produtos derivados da hidrólise da hemicelulose, como o ácido acético (formado pelos grupos acetil da matéria-prima) ou furfural e hidroximetil-furfural (formados pela degradação dos açúcares); (iii) produtos derivados da degradação da lignina (compostos fenólicos, ácidos aromáticos e aldeídos) e (iv) compostos derivados de extrativos. Ácidos como vanílico, siringílico, capróico, caprílico, pelargônico e palmítico têm sido citados entre os ácidos orgânicos com capacidade inibitória presente nos meios de fermentação formulados com hidrolisados de materiais lignocelulósicos. O processo de hidrólise, o qual envolve o tratamento do material lignocelulósico à alta temperatura sob condições ácidas, leva à formação e liberação de vários compostos. a principal via de degradação está esquematizada na Figura 2.1 (PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, 2b).

22 2 MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS HEMICELULOSE CELULOSE LIGNINA CH 3 COOH Ácido acético Compostos Fenólicos CHO CHO CHO CHO H C OH HO C H H C OH H C OH HO C H HO C H HO C H HO C H H C OH H C OH HO C H H C OH CH 2 OH H C OH H C OH H C OH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH Xilose Manose Galactose Glicose O CHO HOH 2 C O CHO Furfural Hidroximetilfurfural O HCOOH H 3 C C CH 2 CH 2 COOH Ácido Fórmico Ácido Levulínico Figura 2.1 Reações que ocorreram durante a hidrólise do material lignocelulósico. De acordo com Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2b), o efeito inibitório do furfural tem sido relacionado com a redução da velocidade de crescimento específica do microrganismo. PARAJÓ et al. (1997) verificaram que em concentrações de 1,3 a 3,2 g/l, o furfural apresenta efeito inibitório sobre a levedura Pichia stipitis. Porém, em concentrações inferiores a 1, g/l, este efeito pouco influencia o processo fermentativo. Nigan (21) verificou que a adição de,27 g/l de furfural ao meio de fermentação não reduziu significantemente o rendimento e a produtividade em etanol, porém a adição de 1,5 g/l de furfural reduziu notoriamente o rendimento e a produtividade em 9,4 e 85,1%, respectivamente. Isto mostra que a alta

23 21 concentração de furfural inibiu diretamente a respiração e o crescimento da levedura P. stipitis. O autor verificou ainda, que o furfural é reduzido a álcool furfurílico, o qual também diminui a velocidade de crescimento, bem como a velocidade específica de produção de etanol. Em relação ao hidroximetilfurfural, Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2b) relataram que seu mecanismo de inibição é muito similar ao do furfural, causando uma longa fase lag durante o crescimento do microrganismo. Porém, o hidroximetilfurfural é considerado menos tóxico que o furfural, e sua concentração no hidrolisado hemicelulósico é normalmente baixa devido a 3 fatores: (1) baixa quantidade de hexose na hemicelulose, (2) as condições empregadas no processo de hidrólise, o qual normalmente não degrada hexoses em grande quantidade e (3) a alta reatividade dos compostos. De acordo com Delgenes et al. (1996), o crescimento P. stipitis foi reduzido em 43, 7 e 1%, quando a concentração de HMF no meio foi de,5;,75 e 1,5 g/l, respectivamente. Martinez et al. (2) verificaram que a produção de etanol por E. coli em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana foi afetada somente em presença de concentrações maiores que 9 mg/l de furanos (furfural e HMF), sendo que estes não foram os principais compostos que determinaram a toxicidade dos hidrolisados hemicelulósicos para a produção de etanol. De acordo com Vogel-Lowmeier et al. (1998), a toxicidade do furfural e do HMF pode estar relacionada ao efeito sinergístico, quando estes dois compostos são combinados com outros compostos, incluindo uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos derivados da degradação da lignina, e outros tipos de ácidos como, acético, fórmico e levulínico (MUSSATO e ROBERTO, 24). O efeito tóxico do ácido acético (pka=4,75) está relacionado com a inibição do crescimento do microrganismo. Este ácido pode ser, portanto, utilizado como preservativo em alimentos. Os ácidos fracos, em valores de ph baixo, apresentamse na forma não-dissociada. Sendo lipossolúveis, têm sua passagem facilitada através da membrana plasmática. Ao entrar na célula e encontrar um ph interno neutro, este ácido se dissocia no citossol liberando prótons H +. A enzima ATPase existente na membrana da célula tem a função de expulsar os prótons do interior desta, de forma a manter a integridade da célula. Quando a concentração de ácido aumenta, a atividade da enzima ATPase também aumenta, porém, dependendo da concentração do ácido, esta enzima pode não conseguir bombear os prótons para

24 22 fora da célula. Em conseqüência, cada vez mais o ph intracelular vai se acidificando e inibindo a atividade da célula, o que pode levá-la à morte (LARSSON et al., 1999b; PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2b). A toxicidade do ácido acético varia de acordo com as condições de cultivo empregadas no processo fermentativo. Van Zyl et al. (1991) utilizaram P. stipitis para produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço-de-cana e concluiram que o grau de inibição causado pelo ácido acético depende não somente da sua concentração, mas também da concentração de oxigênio e do ph do meio. Verificaram que em ph 6,5 e com concentração de ácido acético acima de 4 g/l a produção de etanol caiu, descrescendo até 5% quando a concentração do ácido alcançou 15 g/l. Em ph 5,1 o mesmo decréscimo de 5% na concentração de etanol foi observado quando a concentração de ácido acético foi de somente 1, g/l e nenhum etanol foi produzido na concentração de ácido de 1 g/l no hidrolisado. Segundo Felipe et al. (1995) a produção de xilitol por Candida guilliermondii, utilizando meio semi-sintético, foi favorecida em baixa concentração de ácido acético (até 1, g/l), enquanto que em níveis superiores a 3, g/l foi inibida. Virgínio da Silva (21) constatou que a inibição do ácido acético é dependente da sua concentração bem como da fase de crescimento da levedura. Segundo o autor, o maior efeito tóxico do ácido acético ocorreu quando, após 12 horas de cultivo, as células foram expostas a 5, g/l deste ácido, no tempo que corresponde à fase de atividade máxima metabólica da levedura C. guilliermondii. Assim, relacionou a toxicidade a uma possível interação do efeito inibidor do ácido acético com outros compostos tóxicos como, furfural, 5-HMF e fenóis, já que os maiores valores de rendimento e produtividade em xilitol foram obtidos com a utilização de meio simulando a composição de açúcares do hidrolisado, tendo apenas o ácido acético como composto inibidor. A assimilação de ácido acético pela levedura C. guilliermondii, foi observada por outros autores em hidrolisado de bagaço-de-cana (MARTON, 22), eucalipto (GINORIS, 21) e palha de trigo (CANILHA, 22). Rossi et al. (26) estudou o comportamento da bactéria K. pneumoniae para a produção de butanodiol em meio sintético contendo diferentes concentrações de ácido acético. Concluiu que o ácido acético favorece o processo em termos de velocidade quando a adição de ácido acético no meio foi de 2 g/l e em termos de conversão de substrato em produto quando a adição foi de 6 g/l de ácido acético. O

25 23 mesmo autor verificou que a bactéria consome ácido acético mesmo antes do esgotamento do substrato do meio. A influência de outros ácidos fracos foi verificada por Larsson et al. (1998), que concluiram que existe uma clara diferença entre a toxicidade dos ácidos acético, fórmico e levulínico nas mesmas concentrações de suas formas não dissociadas. É provável que isto ocorra devido a diferenças de permeabilidade da membrana ou da toxicidade da forma aniônica dos ácidos, uma vez no interior da célula (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2b). Uma grande variedade de compostos aromáticos, poliaromáticos, fenólicos e aldeídicos são liberados durante a degradação da estrutura da lignina dos materiais lignocelulósicos. Os compostos fenólicos têm sido considerados por exercerem grande efeito inibitório na fermentação de hidrolisados hemicelulósicos, sendo considerados mais tóxicos, os compostos fenólicos de baixa massa molecular (LARSSON et al., 1998; LUO et al., 22; MACIEL et al., 21). De acordo com Heipieper et al. (1994), citados por Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2b), os compostos fenólicos causam uma perda da integridade da membrana celular, afetando sua habilidade de atuar como barreira seletiva e matriz enzimática. Estes autores utilizaram como base o estudo de Larsson et al. (1998), que observaram que o hidrolisado hemicelulósico de madeira é consideravelmente mais inibidor do que um meio sintético contendo concentrações correspondentes de ácidos alifáticos, furfural e 5-HMF, porém sem compostos fenólicos. Contudo, o mecanismo do efeito de inibição destes compostos ainda não foi elucidado, devido, em grande parte, à falta de exatidão das análises quantitativas e qualitativas. Tran e Chambers (1986) testaram o efeito de nove fenólicos, a maioria dos quais foram compostos benzílicos, em Klebsiella pneumoniae, e concluiram que os compostos fenólicos foram mais tóxicos que os compostos de extrativos não-fenólicos, os quais foram também testados. Nishikawa et al. (1988) estudaram o efeito de sete compostos benzílicos em K. pneumoniae. Como resultado destes estudos, foi proposto que os álcoois aromáticos são menos tóxicos que seus correspondentes ácidos, os quais são menos tóxicos que seus correspondentes aldeídicos (LARSSON et al., 2). Lee et al. (1999) estudaram o efeito de compostos inibidores do hidrolisado de madeira na produção de etanol por Sacharomyces cerevisiae. O produto da degradação da lignina, p-hidroxibenzóico aldeído foi o composto mais inibidor

26 24 testado neste estudo. Os compostos com grupo metil adicional apresentaram toxicidade menor e os ácidos aromáticos foram menos tóxicos do que seus aldeídos correpondentes. Os autores concluiram que os produtos da degradação da lignina foram mais inibitórios do que os produtos derivados de açúcares, como o furfural e o HMF. Fitzgerald (24) conclui que o efeito inibitório da vanilina consiste principalmente na sua habilidade de afetar a integridade da membrana citoplasmática, resultando na perda de gradientes de íons, ph de homeostase e inibição da atividade respiratória. A inibição por vanilina depende da concentração, do tempo de exposição e do microrganismo utilizado. Os íons de metais pesados podem ser provenientes da corrosão dos equipamentos de hidrólise (íons ferro, cromo, níquel e cobre). Watson et al. (1984) estudaram os efeitos dos íons Fe, Cu, Cr e Ni (em concentrações similares às encontradas nos hidrolisados) sobre o crescimento de Cândida tropicalis em meio sintético. Segundo estes autores, a presença dos íons cobre e cromo em concentrações de -,4 e -,1 g/l, respectivamente, não tiveram efeito significativo sobre μ máx, porém, 6% de redução foi notada para o meio contendo,1 g Ni +2 /L. Existem poucos estudos sobre o efeito de cátions metálicos na atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de xilose. Girio et al. (1996), citados por Parajó (1998c), verificaram que os íons Ca +2, Mg +2 e Mn +2 não afetam a atividade da enzima XDH, ao passo que os íons Zn +2, Cd +2 e Co +2 inibiram fortemente esta enzima. Rodrigues et al. (21) detectaram a presença de alguns minerais no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, bem como de metais, provavelmente derivados da matéria-prima lignocelulósica ou da corrosão dos equipamentos de hidrólise. Segundo os autores, as concentrações de alguns íons encontrados no hidrolisado não foram consideradas inibitórias da atividade microbiana quando comparados aos resultados obtidos por Watson et al. (1984) Tratamento do hidrolisado A fermentação de hidrolisados não destoxificados é caracterizada por uma cinética lenta, com rendimentos e produtividades limitadas, quando comparada à fermentação realizada a partir de açúcares comerciais ou hidrolisados

27 25 destoxificados. Isto é devido à presença de uma variedade de compostos que atuam como potentes inibidores do metabolismo microbiano. Muitos estudos têm sido realizados para identificar os compostos inibidores do hidrolisado hemicelulósico, sendo de grande importância o conhecimento destes inibidores e como minimizar seus efeitos negativos para se obter uma grande eficiência num processo fermentativo (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2b). De acordo com Taherzadeh et al. (2a) existem quatro diferentes alternativas para contornar o problema dos inibidores dos hidrolisados hemicelulósicos: (1) Evitar a formação dos inibidores durante hidrólise; (2) Destoxificar o hidrolisado antes da fermentação; (3) Desenvolver espécies de microrganismos capazes de tolerar os inibidores; (4) Converter os compostos tóxicos em produtos que não interferem no metabolismo microbiano. Segundo estes autores, novas espécies de microrganismos metabolicamente engenheiradas para aumentar sua tolerância aos inibidores podem diminuir a necessidade de destoxificação dos hidrolisados. Porém, não se tem totalmente definido contra quais compostos é requerida esta resistência. Vários tratamentos vêem sendo propostos com o objetivo de reduzir as concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados a níveis não inibitórios ou até mesmo eliminá-los, visando a melhoria da fermentabilidade dos hidrolisados (DOMINGUEZ et al., 1996; GARCIA, 26; MATOS, 24; PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2b; PRATA, 1997; ROBERTO et al., 1991a; VILLARREAL et al., 26; VIÑALS, 21). Estes tratamentos podem ser classificados em função da forma de realização (individual ou combinado) e da natureza dos agentes empregados (físico, químico e biológico). A eficiência do método de destoxificação depende do tipo de hidrolisado hemicelulósico e da espécie de microrganismo empregada, uma vez que cada tipo de hidrolisado apresenta diferente grau de toxicidade, e cada espécie de microrganismo apresenta diferente grau de tolerância aos inibidores (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2a). Antes da escolha do método deve-se considerar a composição do hidrolisado, a qual varia de acordo com a matéria-prima e as condições de hidrólise empregadas (LARSSON et al., 1999b). O método físico de destoxificação do hidrolisado baseia-se no processo de concentração por evaporação à vácuo, que reduz a concentração de compostos voláteis presentes como ácido acético, furfural e vanilina. Porém, este método também aumenta moderadamente a concentração de compostos tóxicos

28 26 não-voláteis como extrativos e derivados de lignina e, conseqüentemente, seu grau de inibição (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2a). Esta situação pode ser contornada associando a evaporação a outro método de destoxificação (LARSSON et al, 1999; PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2b). Converti et al. (2) e Rodriguez et al. (21) relataram que o método de evaporação é capaz de remover ácido acético, furfural e outros compostos voláteis do hidrolisado hemicelulósico, aumentando a produtividade do processo fermentativo para produção de xilitol. Converti et al. (2) estudaram os processos de explosão à vapor e préhidrólise com ácido sulfúrico diluído para a hidrólise de Eucalyptus globulus para a produção de xilitol. Os autores concluiram que o processo de explosão à vapor é capaz de hidrolisar mais rapidamente a madeira, mas o hidrolisado produzido desta maneira requer fortes tratamentos de destoxificação. A precipitação através da elevação e abaixamento do ph e a adsorção com carvão ativo foram mais adequados para a remoção dos compostos derivados da lignina. Os métodos químicos baseiam-se na precipitação de compostos tóxicos e na instabilidade de alguns inibidores em determinado valor de ph (MARTINEZ et al., 2; SILVA et al., 1998;), na extração com solventes orgânicos (CRUZ et al., 1999), na adição de substâncias redutoras (PARAJÓ et al.,1997b), na adsorção com carvão ativo (DANNER et al., 23; GINORIZ, 21; MARTON, 22b), na utilização de resinas de troca iônica (CANILHA et al., 23, GARCIA, 26; LARSSON et al., 1999b; NILVEBRANT et al., 21; VIÑALS, 21) e na combinação deles (ALVES et al., 1998; KULKARNI et al., 1998b; MARTON, 25; PRATA e HISS, 1998; VILLARREAL, 25). O processo de precipitação pela alteração do ph causa efeitos benéficos como uma parcial remoção de ácidos (acético e tânico) e compostos fenólicos, precipitação de íons metálicos pesados e conversão de furfural em ácido furfurílico. No entanto, os açúcares podem ser parcialmente degradados (ROBERTO et al., 1994; SILVA et al., 1991). Nesse processo, óxido de cálcio (CaO), hidróxido de cálcio Ca (OH) 2 ou outro hidróxido é adicionado ao meio até se alcançar valores de ph entre 7 e 1,5 e logo é adicionado ácido para abaixar o ph. O precipitado formado, constituído principalmente por sais de cálcio de baixa solubilidade, como o sulfato, é eliminado por filtração à vácuo. Este método foi realizado sob condições de calor, uma vez que a solubilidade do sulfato de cálcio diminui em alta temperatura.

29 27 Em estudos realizados com hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-deaçúcar tratados pelo método de alteração de ph observou-se uma eliminação total do furfural, no entanto, a redução do ácido acético no meio foi parcial (FELIPE et al., 1993). De acordo com Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2a), o ajuste do ph até 1 com NaOH ou Ca(OH) 2 tem sido relatado como capaz de diminuir a concentração das cetonas de Hibbert presentes no hidrolisado ácido diluído de madeira, em cerca de 22%, e as concentrações de furfural e de HMF em cerca de 2%. Porém, a concentração de ácido acético não foi afetada por nenhum dos tratamentos. O tratamento com carvão ativo é um método eficiente e econômico para redução das concentrações de compostos fenólicos (PARAJÓ et al., 1996a), compostos aromáticos (PARAJÓ et al., 1997b), furfural e HMF (MUSSATO et al., 21), encontrados nos hidrolisados hemicelulósicos, e tem sido capaz de melhorar a fermentabilidade do hidrolisado (GINORIZ, 21). Rodrigues et al. (1995) verificaram a influência da elevação do ph e do uso de carvão ativo sobre a redução dos níveis de inibidores e de Carboidratos Redutores Totais (CRT) presentes no hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido por hidrólise ácida. Os autores constataram que a elevação do ph para 8, e a adição de carvão ativo é o procedimento que proporciona uma menor perda de açúcares associada a uma maior redução de impurezas do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Prata e Hiss (1998) verificaram que o tratamento por elevação de ph com CaO e abaixamento com H 2 SO 4 combinado com adsorção por carvão ativo proporcionaram melhores resultados de crescimento da bactéria Klebsiella pneumoniae em meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, obtido por hidrólise ácida. Ginoriz (21) encontrou como melhor condição de tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto (fator de conversão de xilose em xilitol por C. guilhermondii de,52 g/g e formação de xilitol de 42,9 g/l), a elevação do ph deste para 3,5 com CaO seguida da adsorção em carvão ativo pulverizado SYNTH (2,4%, m/v) sob agitação de 2 rpm, 3 o C por 34,5 min. Mussato e Roberto (21) utilizaram hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para o estudo do efeito do tratamento com carvão ativo na bioconversão de xilose em xilitol por C. guilhermondii e encontraram que o grau de remoção dos compostos fenólicos

30 28 aumentou quando a razão hidrolisado:carvão foi diminuída de 12 para 24 g/g. Contudo, os melhores valores de rendimento (,72 g/g) e produtividade volumétrica (,61 g/l.h) do processo fermentativo foram alcançados com a razão de 4 g/g, a qual removeu 27% dos compostos fenólicos. Estes estudos demonstraram ainda que esses parâmetros tiveram um aumento de 22 e 45%, respectivamente, em relação àqueles obtidos sem tratamento com carvão. MARTON (22b) avaliou, para quatro marcas de carvões ativos pulverizados nacionais (SYNTH, BRASILAC, CARBOMAFRA e CARVORITE), os parâmetros temperatura (T), tempo de contato (tc), agitação (A), ph e concentração de carvão (CC), e não foram observadas diferenças significativas em relação à produtividade volumétrica de xilitol (Q P ) para os diferentes carvões usados no tratamento. Porém, o carvão ativo CDA da BRASILAC foi selecionado entre os avaliados por apresentar a maior relação área superficial/custo do produto. A condição estabelecida de tratamento (T=6 ºC, tc=3min, A=1 rpm, ph 2,5 e CC=1%) permitiu remoção média de 44,18% de ácido acético, 76,22% de fenóis, 58,27% de furfural e 59,69% de 5-hidroximetilfurfural, além da clarificação do hidrolisado. A fermentação deste hidrolisado, com 64 horas, resultou em um consumo de 94,14% de D-xilose, fator de conversão de D-xilose em xilitol de,66 g/g e produtividade volumétrica de xilitol de,51g/l.h, embora esta produtividade seja ainda considerada baixa em relação à desejada em processos de bioconversão. Outro método de tratamento químico é o de adsorção por resinas de troca iônica, contudo, seu custo é alto quando comparado com outros tratamentos (LEE et al., 1999). As resinas de troca iônica são compostos macromoleculares constituídos por um esqueleto tridimensional no qual fixam-se os grupos ativos. Estas permitem trocar os íons não desejáveis da solução problema por aqueles que se encontram saturando os grupos funcionais da resina. Este processo de equilíbrio pode ser representado pela seguinte equação: RA + B RB + A, onde RA e RB representam as resinas na forma A e B respectivamente, e A e B os íons trocados. As reações de troca iônica são estequiométricas, reversíveis e possíveis com qualquer composto ionizável. A natureza reversível da reação permite o repetido uso das resinas, desde que estas não sofram mudanças substanciais da sua estrutura. A velocidade da reação depende da seletividade da resina (DECHOW, 1989).

31 29 Uma reação de troca iônica pode ser definida como uma troca reversível de íons entre uma fase sólida (matriz) e uma fase líquida (solução problema). Os trocadores carregados positivamente têm contra íons carregados negativamente (ânions) disponíveis para serem trocados, e são denominados trocadores aniônicos. Logo, os trocadores carregados negativamente têm contra-íons positivos (cátions) e são denominados de trocadores catiônicos. Como características principais das resinas encontram-se a não-solubilidade em água e em solventes orgânicos e inorgânicos mais comuns. Possuem uma estrutura hidrofílica de forma regular e reproduzível, rápida velocidade de troca e estabilidade física em termos de força mecânica e resistência à atrição. As resinas, ao contrário do carvão ativo, podem ser regeneradas com solventes polares como metanol, acetona e eletrólitos, inclusive a água (HARLAND, 1994). A capacidade de troca máxima das resinas é um parâmetro importante no processo de troca iônica e varia segundo as características das resinas, relacionando o tamanho dos poros e a área superficial com as características das soluções a serem tratadas (densidade e viscosidade). Esta capacidade é influenciada também pelos canais preferenciais que podem formar-se no leito das resinas, pelo fluxo de alimentação empregado, pelas obstruções e pela eficiência da regeneração (NÁPOLES et al., 1998). As resinas de troca iônica são classificadas segundo os grupos ativos em, catiônica ácido forte (fortemente ácida), catiônica ácido fraco (fracamente ácida), aniônica base forte (fortemente básica) e aniônica base fraca (fracamente básica) (Tabela 2.1). Segundo a estrutura polimérica, as resinas podem ser classificadas em estirênicas (copolimerização de monômeros divinilbenzeno e de estireno) ou acrílicas (copolimerização de monômeros divinilbenzeno e de ácido acrílico ou de ácido substituído). Tabela 2.1 Classificação das resinas de troca iônica em função do grupo funcional e da força iônica Classificação Grupo funcional Forma iônica Catiônica ácido forte -SO 3 - -SO 3 - H + ; -SO 3 - Na + Catiônica ácido fraco -COO - -COO - H + Aniônica base forte TipoI -CH 2 N(CH 3 ) 3 + -CH 2 N(CH 3 ) 3 + Cl - Aniônica base forte Tipo II -CH 2 N(CH 3 ) 2 (CH 2 CH 2 OH) + -CH 2 N(CH 3 ) 2 (CH 2 CH 2 OH) + Cl - Aniônica base fraca -CH 2 NH(CH 3 ) 2 + -CH 2 NH(CH 3 ) 2 + Cl -

32 3 A seletividade das resinas depende de fatores como a valência e o tamanho do íon trocado, a forma iônica da resina, a força iônica total da solução, entrecruzamento das resinas, o tipo de grupo funcional e a natureza dos íons não trocados. A Tabela 2.2 apresenta a seletividade para cada um dos tipos de resinas, de acordo com DANDEL e ANDEN (1989), citados por Harland (1994). Tabela 2.2 Ordem de afinidade de diferentes resinas por íons em soluções diluídas (HARLAND, 1994). Resina Seletividade Catiônica ácido forte Ag + >Cs + >K + >NH 4 + >Na + >H + >Li +, Ba 2+ >Pb 2+ >Ag 2+ >Sr 2+ >Ca 2+ Catiônica ácido fraco H + >>Cu 2+ >Pb 2+ >Ni 2+ >Co 2+ >Fe 2+ >Ca 2+ >Mg 2+ >Na 2+ >K + > Cs + Aniônica base forte TipoI SO 4 2- >HSO 4 - >I - >NO 3 - >Br - >Cl - >HCO 3 - >HSiO 3 - >F - >HO - TipoII SO 4 2- >HSO 4 - >I - >NO 3 - >Br - >Cl - >HCO 3 - >HO - >HSiO 3 - >F - Aniônica base fraca OH - >> SO 4 2- > HSO 4 - > I - > NO 3 - > Br - > Cl - > F - Segundo Frazer e McCaskey (1989), o emprego de resina de troca iônica é o processo que leva aos melhores resultados na conversão de substrato em produto (96% do rendimento teórico). Além das resinas, estes autores obtiveram valores de conversão de substrato em produto (Y p/s ) em torno de,3 g/g, empregando carvão ativo, etil-acetato, clorofórmio, tricloroetileno, benzeno e hexano, após neutralização do hidrolisado com hidróxido de cálcio, indicando serem esses tratamentos promissores para a remoção dos inibidores do metabolismo microbiano. Dominguez et al. (1996) avaliaram a combinação de resina catiônica (DOWEX 5WX4) e neutralização com CaCO 3 para tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana com vistas à obtenção de xilitol. Os resultados demonstraram que o tratamento reduziu a atuação dos agentes tóxicos e favoreceu a formação de xilitol, que aumentou de 1 g/l para 28 g/l em 96 h de fermentação com a levedura mutante Candida sp 11-2, comparado ao tratamento em que se fez somente a neutralização com CaCO 3. Kulkarni et al. (1998) utilizaram as resinas DUOLITE catiônica C-2 (H + ) e a aniônica A-368 (OH - ) para purificação de xarope de D-xilose obtido de casca de algodão em rama. Foram empregadas diferentes temperaturas (3, 4 e 5 o C) e

33 31 vazões de alimentação (5, 1 e 15 V L /h, V L /h: volume de leito por hora). Observou-se que a temperatura de 3 o C e o fluxo de alimentação de 1 V L /h com a resina C-2 combinada com a resina A-368 a 4 o C e fluxo de alimentação de 15 V L /h, resultou na remoção de 93,6% de fenóis e 1% da coloração. Segundo os autores o fluxo de alimentação influencia na difusão das moléculas, porém a remoção dos fenóis permaneceu com valores de 89,93, 9,97 e 92,97% para os respectivos fluxos de 5, 1 e 15 V L /h. Nápoles et al. (1998) compararam o tratamento com carvão ativo e com uma série de resinas de troca iônica catiônica e aniônica do hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar concentrado 3 vezes. Obtiveram uma redução dos inibidores ácido acético e fenóis de 15,2 e 54,7% usando carvão ativo e de 92,5 e 98,9% usando resinas de troca iônica. Ainda obtiveram, com as resinas, um aumento de 36,5% na conversão de xilose em xilitol e de 85,6% na produtividade em xilitol, em relação ao tratamento com carvão ativo. Nilvebrant et al. (21) trataram hidrolisado de madeira com resinas de troca iônica catiônica e aniônica para a produção de etanol. As resinas de troca aniônica foram mais eficientes, removendo altas quantidades de fenóis, furanos, aldeídos e ácidos alifáticos do hidrolisado, obtendo produtividade e rendimento em etanol de 1,71 g/l.h e,46 g/g, respectivamente. As resinas de troca catiônica apresentaram rendimento similar (,45 g/g), porém, baixa produtividade (,65 g/l.h). Para o hidrolisado não tratado a produtividade e rendimento obtidos foram de,21 g/l.h e,42 g/g, respectivamente. Viñals (21) utilizou diferentes resinas de troca iônica no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço-de-cana para obtenção de xilitol, e a máxima produtividade volumétrica em xilitol e concentração de produto obtidas foram de,679 g/l.h e 25 g/l, respectivamente, quando utilizou a seqüência de resinas aniônicas A-86S e A-5, seguida da catiônica C-15 e finalizada com a resina aniônica fraca A-13S, todas da PUROLITE. Para esta condição de melhor produtividade, obteve-se 1% na remoção de ácido acético, 1% na remoção de furfural, 1% na remoção de hidroximetilfurfural, 86,44% na remoção de fenóis e 97,48% na remoção de cor. Villarreal et al. (26) estudaram dois métodos de destoxificação do hidrolisado de aparas de eucalipto, um empregando carvão ativo e outro um sistema de resinas de troca iônica para a produção de xilitol por C. guilliermondii. Os dois

34 32 tratamentos apresentaram melhoras na fermentabilidade do hidrolisado de aparas de eucalipto, porém, o tratamento com resinas de troca iônica foi mais eficiente proporcionando uma produtividade volumétrica (Qp) de 1,4 g/l.h e formação de xilitol de 5,18 g/l, utilizando a seqüência de resinas Applexon catiônica, A-86, C-15 e Applexon aniônica no hidrolisado concentrado até 8 g/l de xilose. Os baixos valores dos parâmetros fermentativos obtidos com o tratamento com carvão (Qp=,25 g/l.h e xilitol 29,5 g/l) podem ser explicados pelo efeito dos inibidores, que não foram removidos a um nível considerado não tóxico para a levedura C. guilliermondii. Garcia (26) comparou dois métodos de destoxificação do hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto nos parâmetros fermentativos para a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. O autor concluiu que o tratamento com resinas de troca iônica (seqüência A-86S, A-5, C-15 e A-13S) foi mais eficiente que o tratamento com carvão ativo, pois removeu 1% dos inibidores dosados, resultando numa produtividade de 2,8 g/l.h e uma formação de produto de 29,8 g, enquanto que com o tratamento com carvão obteve-se 1,28 g/l.h e 15,8 g, respectivamente. Em estudo subseqüente, Rossi (26) constatou que a resina A-13S pode ser eliminada do processo de tratamento do hidrolisado quando este for empregado para a produção de butanodiol em sistema descontínuo alimentado. Os métodos biológicos de tratamento envolvem o uso de enzimas específicas ou microrganismos que agem sobre o composto tóxico presente no hidrolisado. A utilização de microrganismos tem sido proposta para remoção seletiva de compostos inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos (JÖNSSON et al., 1998; SCHNEIDER, 1996) Adaptação do microrganismo Outra forma de minimizar o problema da toxicidade dos inibidores é a utilização de células adaptadas (AMARTEY e JEFFRIES, 1996; FELIPE et. al., 1996; FRAZER e McCASKEY, 1989; SENE, 21). Este método é baseado em fermentações sucessivas, onde o microrganismo de cada experimento é utilizado como inóculo para o próximo ensaio. Frazer e McCaskey (1989) concluíram que a adaptação possibilita obter um inóculo capaz de se desenvolver e produzir maior

35 33 quantidade de 2,3-butanodiol quando comparado com o inóculo obtido em meio sintético. Além disso, estudos realizados com diversos inibidores oriundos do processo de hidrólise ácida demonstram que pelo menos alguns desses compostos podem ser metabolizados ou modificados por Klebsiella pneumoniae ou ter seu efeito inibidor atenuado com o prolongamento do tempo de incubação (NISHIKAWA et al., 1988). Frazer e McCaskey (1991) verificaram que os compostos fenólicos seringaldeído e vanilina são os maiores inibidores do crescimento e da produção de 2,3-butanodiol. Adaptação de células foi utilizada por Amartey e Jeffries (1996) na bioconversão de hidrolisado de palha de milho por Pichia stipitis para produção de xilitol, os quais destacaram a reciclagem de células adaptadas como a forma mais econômica para aumentar a produtividade de xilitol, comparando-se com o uso de métodos para remoção dos compostos inibidores do hidrolisado. Parajó et al. (1995), citados por Parajó et al. (1998c) verificaram um aumento de 3,6 vezes na produtividade volumétrica de xilitol e um aumento de 2 vezes no rendimento de xilitol após cinco fermentações de hidrolisado neutralizado de madeira de Eucalyptus com células recicladas de Debaryomyces hansenii. Sene et al. (1998) constataram que houve um aumento de 46% e 5% no rendimento e produtividade de xilitol, respectivamente, quando o inóculo de C. guilliermondii foi obtido de células adaptadas no hidrolisado de bagaço de canade-açúcar, utilizado como meio de fermentação, em relação à fermentação com células não adaptadas. Os autores também observaram que quanto mais concentrado o hidrolisado utilizado no cultivo, maior a necessidade da utilização de células adaptadas. Matos (24), empregando a adaptação combinada ao reciclo de células em sucessivas fermentações, obteve uma melhoria de até 8% na formação de xilitol pela levedura C. guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar. A adaptação do inóculo ao hidrolisado de maior fator de concentração (5 vezes) resultou em melhoria de 47% na formação de xilitol. As formas de cultivo contínuo (MARTÍNEZ et al., 23), semi-contínuo (SILVA et al., 23), descontínuo alimentado (PRATA, 1997; SILVEIRA, 1998) e descontínuo alimentado repetido (KUMAR et al., 2; PARK et al., 1998; BAE et al., 24) e a reutilização de células em sucessivas fermentações (CARVALHO et al., 23; MATOS, 24) são técnicas utilizadas como forma de adaptação ao

36 34 hidrolisado hemicelulósico e uma alternativa para a melhoria dos parâmetros fermentativos. O cultivo contínuo da levedura C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar foi estudado por Martínez et al. (23), os quais obtiveram uma conversão de xilose em xilitol de,68 g/g e uma produtividade de,68 g/l.h, enquanto Silva et al. (23), utilizando o sistema semi-contínuo com células imobilizadas de C. guilliermondii em pérolas de vidro poroso, obtiveram rendimento de,57 g/g e produtividade de,6 g/l.h. Carvalho et al. (23) avaliaram a reutilização de células de C. guilliermondii imobilizadas em alginato de cálcio durante cinco consecutivas fermentações em hidrolisado de bagaço de cana. A conversão de xilose em xilitol obtida foi de,68 g/g, com produtividade de,6 g/l.h, correspondendo a uma melhora de 2,3% ao longo do reciclo. Park et al. (1998) estudaram o sistema descontínuo alimentado e o sistema descontínuo alimentado repetido para produção de eritritol (açúcar alcóolico), em meio contendo xarope de glicose por Trichosporon sp. Os autores obtiveram o mesmo rendimento em produto de 45% para os dois sistemas, porém a produtividade quando utilizado o sistema repetido foi de 1,86 g/l.h, maior que a do sistema descontínuo alimentado que foi de 1,54 g/l.h. Kumar et al. (2) utilizaram o sistema descontínuo alimentado repetido para aumentar a produção de lovastatina em meio contendo glicose, maltodextrina e xarope de amido. Obtiveram um aumento de 73% na produção de lovastatina, alcançado em 288 horas no processo descontínuo alimentado repetido, quando comparado com o processo descontínuo. Bae et al. (24) utilizaram o sistema descontínuo alimentado repetido e o reciclo de células para produção de xilitol pela levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae contendo o gene xilose redutase. O meio empregado denominado meio YPD (1 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de bactopeptona e 2 g/l de glicose) foi suplementado com xilose. A concentração final de xilitol e a produtividade para as fermentações em sistema descontínuo alimentado repetido e em sistema com reciclo de células foram 2,5-3,3 e 1,5 2, vezes maior do que a produção em sistema descontínuo, respectivamente.

37 ,3-Butanodiol Características e aplicações O 2,3-butanodiol, também conhecido como 2,3-butilenoglicol, 2,3-dihidroxibutano e dimetilenoglicol, constitui um insumo de interesse econômico e é o principal produto da fermentação butileno-glicólica. O interesse na produção microbiana de 2,3-butanodiol se justifica devido ao amplo número de aplicações industriais deste produto. Butanodiol é um líquido incolor e inodoro com elevado ponto de ebulição e um baixo ponto de congelamento, e é amplamente usado como monômero para síntese de polímeros. As aplicações comerciais deste diol não estão limitadas à manufatura de butadieno, ou no uso como agente anticongelante (LEDINGHAM e NEISH, 1954; PALSSON et al., 1981). Tem também grande potencial como combustível, com calor de combustão comparável a outros combustíveis líquidos, como metanol e etanol (FLICKINGER, 198; YU e SADDLER, 1982b). Butanodiol também pode ser facilmente convertido a diacetil e butano (EMERSON et al., 1982). Além disso, o diacetil formado por desidrogenação catalítica deste diol é um aditivo de alimentos altamente valioso usado como agente flavorizante (COGAN, 1995). Soltys et al. (1998) empregaram 2,3-butanodiol para congelamento de fígado de rato comprovando ser eficiente e evitando a formação de gelo por 24 horas à -4 o C, e Evans e Azeman (1998) estudaram as propriedades do dimetil sulfóxido e do 2,3-butanodiol como crioprotetores. O 2,3-butanodiol é um composto biodegradável, sendo que Klebsiella pneumoniae, que é capaz de produzi-lo, é também capaz de consumi-lo. Essa biodegradabilidade significa que o 2,3-butanodiol pode ser empregado como um solvente ou agente de ligação para a produção de tintas e polímeros, os quais não agridem o meio ambiente (AFSCHAR et al.,1993). O 2,3-butanodiol pode ser obtido tanto por via fermentativa como por via sintética. A produção por via fermentativa se deu em função da falta do 1,3-butadieno sintético obtido por fontes petroquímicas na época da segunda guerra mundial (PRESCOTT e DUNN, 1959), o qual também pode ser obtido pela desidratação do 2,3-butanodiol e usado na manufatura de borracha sintética (MADDOX, 1988). Nos últimos anos, as pesquisas sobre a fermentação butileno-

38 36 glicólica tem-se intensificado, justificando-se a produção do 2,3-butanodiol com base nas suas características potenciais como intermediário químico, além das suas aplicações diretas (CONVERTI et al. 21; GARCIA, 26; NAKASHIMADA et al., 2; PEREGO et al., 23; SAHA et al., 1999; SILVEIRA et al., 1998). Na Tabela 2.3 estão apresentadas algumas aplicações do butanodiol e seus intermediários químicos. Tabela 2.3 Aplicações do 2,3-butanodiol e alguns derivados. COMPOSTO FINALIDADE REFERÊNCIA 2,3-butanodiol Agente anticongelante crioprotetor PALSSON et al. (1981); EVANS e AZEMAN, (1998); SOLTYS et al. (1998) Combustível líquido FLICKINGER (198); YU e SADDLER (1982b) Metil-etil-cetona Éter tetrametílico Diacetil Solvente industrial e aditivo para combustível LEDDINGHAM e NEISH (1954) Mistura à gasolina VOLOCH et al. (1985) Aditivo para alimentos EMERSON et al., 1982; MAGEE e KOSARIC (1987) 1,3-butadieno Borracha Sintética MAGEE e KOSARIC (1987) Diésteres do butanodiol Plastificantes de polímeros termoplásticos VOLOCH et al. (1985); AFSCHAR et al. (1993) Microrganismos produtores Várias espécies microbianas são capazes de sintetizar o 2,3-butanodiol como produto final da fermentação, como por exemplo, Bacillus licheniformis (NILEGAONKAR et al., 1996) e Klebsiella pneumoniae (JANSEN e TSAO, 1983). Esta última normalmente é classificada como Aerobacter aerogenes e Klebsiella oxytoca. Enterobacter cloacae foi empregada também para obtenção de 2,3-butanodiol por Saha e Bothast (1999). De acordo com Perego et al. (23) os melhores produtores são a Klebsiella oxytoca (GROVER et al., 199), Enterobacter aerogenes (PEREGO et al., 2), Bacillus polymyxa (MAS et al., 1988) e Bacillus licheniformis (BUCHANAN e GIBBSON, 1975). Converti et al. (23, 21) utilizaram Enterobacter aerogenes e Bacillus licheniformis, respectivamente,

39 37 para a produção de 2,3-butanodiol e Nakashimada et al. (2) utilizaram Paenibacillus polymyxa. A Figura 2.2 apresenta as principais espécies de bactérias produtoras de butanodiol, sendo os gêneros Klebsiella, Bacillus, Serratia e Pseudomonas (MAGEE e KOSARIC, 1987) as que apresentam as melhores características de rendimento e produtividade. ORDEM FAMÍLIA GÊNERO ESPÉCIE Klebsiella K. pneumoniae Enterobacteriaceae Enterobacter E. aerogenes Serratia S. marcescens Eubacteriales B. subtilis Bacillaceae Bacillus B. polymyxa Pseudomonadales Pseudomonadaceae Aeromonas A. hydrophila Figura 2.2 Classificação das principais bactérias produtoras de 2,3-butanodiol (MAGEE e KOSARIC, 1987). A maioria das pesquisas sobre a fermentação butileno-glicólica utiliza Klebsiella pneumoniae como agente fermentador (BERBET de MOLINA, 1995; FRAZER e McCASKEY, 1989; GARCIA, 1999; JANSEN et al., 1984; PRATA, 1997; SYU, HOU, 1999; ZANÃO, 21). Suas principais características são: a estabilidade genética (LONG, PATRICK, 1963), evitando problemas de degeneração por sucessivas repicagens; a flexibilidade quanto a utilização de substratos para a fermentação, sendo capaz de metabolisar todos os principais açúcares presentes nos hidrolisados hemicelulósicos (YU e SADDLER, 1982) e celulósicos (YU et al.,1984). Além disso, a inexistência de problemas de inibição pelo produto formado permite chegar a concentrações de 2,3-butanodiol próximos de 1 g/l (AFSCHAR et al., 1991) no meio de fermentação. A capacidade da K. pneumoniae de utilizar diferentes açúcares para a fermentação faz com que essa espécie, principalmente a cepa NRRL B-199, seja a mais utilizada em estudos de fermentação de melaço (LONG e PATRICK, 1963),

40 38 soro de leite (BARRET et al., 1983), hidrolisados celulósicos (YU et al., 1984), hemicelulósicos (GARCIA, 26; GONG et al., 1997; PRATA, 1997; SADDLER et al., 1983; ZANÃO, 21) e amiláceos (WARD et al., 1945), caldo de cana-de-açúcar (BERBERT de MOLINA, 1995) e outros. Esta bactéria também é capaz de metabolisar o glicerol e o ácido succínico (BIEBL et al., 1998; EITEMAN e MILLER, 1995, respectivamente) e produzir 2,3-butanodiol a partir dos mesmos. O mecanismo bioquímico de formação dos compostos da fermentação butilenoglicólica é apresentado na Figura Fatores que influenciam a formação de 2,3-butanodiol Vários fatores influenciam a formação de 2,3-butanodiol. Um destes é a concentração inicial de substrato no meio de fermentação. De acordo com dados de literatura (JANSEN et al., 1984; SABLAYROLLES e GOMA, 1982) a concentração de glicose ou xilose que resulta nos maiores valores de produtividade é 1 g/l, quando se trabalha com processos aerados em sistema descontínuo. O mesmo valor foi encontrado por Silveira (1991), na fermentação de sacarose em sistema descontínuo. Isto se deve ao fato de o microrganismo ser inibido em concentrações acima desse valor (SABLAYROLLES e GOMA, 1982). Embora se tenha observado um aumento de velocidade específica de formação de produto com o aumento da concentração inicial de substrato, observou-se nítido decréscimo da velocidade específica de crescimento, comprometendo a produtividade (JANSEN et al., 1984; SABLAYROLLES e GOMA, 1982). Segundo Esener (1981), a velocidade específica de crescimento de Klebsiella pneumoniae diminui aproximadamente dez vezes com o decréscimo da atividade de água de,995 para,975. Esta baixa resistência osmótica pode explicar a inibição que altas concentrações de substrato provocam sobre esta bactéria. Segundo OLSON, JOHNSON (1948) uma das formas de se evitar o problema é a condução do processo em sistema descontínuo alimentado, o que permite ainda atingir altas concentrações de produto no meio. Para minimizar a inibição do crescimento celular em altas concentrações de substrato, durante a produção de 2,3-butanodiol a partir do melaço, Afschar et al. (1991) empregaram o sistema descontínuo com pulso de substrato, e obtiveram uma concentração de 98,6 g/l de 2,3-butanodiol.

41 39 MONOSSACARÍDEOS NAD + NADH 2 CoA 1 11 H 2 Formato Lactato PIRUVATO CO CoA 3 CO 2 Acetil-CoA Acetaldeído α-acetolactato Pi 5 NADH 2 NAD + 8 CO 2 NADH 2 CoA 4 Acetoína Acetil-P NAD + NADH 2 ADP ETANOL 9 6 NAD + ATP ACETATO 2,3-BUTANODIOL 1. Enzimas do ciclo das pentoses e/ou via glicolítica 7. Acetolactato sintase 2. Piruvato-formiato liase 8. Acetolactato descarboxilase 3. Acetaldeído desidrogenase 9. Acetoína redutase 4. Etanol desidrogenase 1. Lactato desidrogenase 5. Fosfo-transacetilase 11. Formiato-hidrogênio liase 6. Acetato quinase Figura 2.3 Vias metabólicas de formação dos produtos da fermentação de carboidratos por Klebsiella pneumoniae. A ótima concentração de açúcar depende do tipo de matéria-prima utilizada como fonte de carbono, pois um aumento na concentração de açúcares proporciona

42 4 também um aumento da concentração de possíveis inibidores existentes no meio, como por exemplo, o meio proveniente de materiais lignocelulósicos (MADDOX, 1988). O suprimento de oxigênio é um dos principais parâmetros que afetam a fermentação butileno-glicólica. Jansen et al. (1984) e Sablayrolles e Goma (1982) mostraram que a velocidade específica de formação de produto por Klebsiella pneumoniae é maior quando a concentração de oxigênio dissolvido se aproxima de zero. Entretanto, devido à baixa concentração celular, os rendimentos não são satisfatórios. A aeração é necessária para a formação de massa celular, enquanto que a queda do oxigênio dissolvido é fundamental para a síntese do 2,3-butanodiol, uma vez que o processo se realiza pelo metabolismo anaeróbio ou microaeróbio do microrganismo (PIRT, 1957). Tal fato foi comprovado por Jansen et al. (1984) pela cinética da fermentação de xilose por Klebsiella pneumoniae. Neste caso verificou-se que após um intenso crescimento celular, em sistema aerado, a concentração de oxigênio dissolvido atingia valor nulo, iniciando-se neste ponto a produção de 2,3-butanodiol. O mesmo comportamento foi observado por GARCIA (1999) no estudo das condições iniciais para a produção de 2,3-butanodiol em sistema descontínuo alimentado utilizando o valor de k L a inicial da fase descontínua igual a 1 h -1. Nestas condições foi possível obter valores de produtividade em 2,3-butanodiol em torno de 2,9 g/h (2,15 g/l.h). A temperatura ótima de formação de produto difere da temperatura ótima de crescimento de Klebsiella pneumoniae. Pirt e Callow (1958), trabalhando com processo contínuo, em meio contendo sacarose como substrato, mostraram que o intervalo de 35 a 37 o C é o mais adequado para a formação do 2,3-butanodiol, e que a melhor temperatura para crescimento é de 3 o C. Segundo Esener et al. (1981), que utilizaram glicerol como substrato para Klebsiella pneumoniae, a velocidade específica máxima de formação de produto ocorre a 37 o C. Jansen e Tsao (1983) concluíram que a temperatura ótima para o crescimento da bactéria e para a formação de produto é de aproximadamente 37 ºC. Converti et al. (21) obtiveram os maiores rendimentos em butanodiol para Enterobacter aerogenes e Bacillus licheniformis, a 39 o C e 37 o C, respectivamente. A maioria dos trabalhos que envolvem a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae são realizados a 37 ºC (BERBERT de MOLINA, 1995; FRAZER e McCASKEY, 1989; GARCIA, 1999; MENZEL et al., 1996; PRATA, 1997; SILVEIRA et al., 1998; ZANÃO, 21).

43 41 Para o ph, Jansen et al. (1984) verificaram que a máxima velocidade específica de crescimento de Klebsiella pneumoniae, em aerobiose, ocorre a ph 5,2 e que o máximo rendimento em 2,3-butanodiol a partir da xilose ocorre num ph entre 5,2 e 5,6. Este rendimento não é afetado quando utiliza-se valores de ph entre 4,4 e 5,8. Em valores de ph iguais ou superiores a 6,, o rendimento de 2,3-butanodiol decresce devido ao decréscimo da atividade das enzimas necessárias para produção de 2,3-butanodiol. Störmer (1968) verificou que o ph ótimo para a ação da enzima acetolactato sintase, necessária para a produção de 2,3-butanodiol, se situa em torno de 5,8 e Biebl et al. (1998), em fermentação de glicerol por Klebsiella pneumoniae, verificaram um aumento da produção de butanodiol com a diminuição do ph, no intervalo de 7, a 5,7, sendo que de 6,2 para 5,7 o aumento foi de 1%. Prata (1997), empregou o ph 5,8 e concluiu que este valor é adequado para a produção de 2,3-butanodiol em sistema descontínuo alimentado, com a bactéria Klebsiella pneumoniae, em meio preparado com o hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Grover et al. (199) examinaram o efeito do ph sobre a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado de madeira, por Klebsiella pneumoniae, e verificaram que o ph inicial ótimo varia entre 5,5 e 6,. Encontram-se na literatura estudos sobre a produção de 2,3-butanodiol em diferentes sistemas de fermentação. Silveira et al. (1991) estudaram a cinética desta fermentação, utilizando sacarose como substrato, em sistema descontínuo e descontínuo alimentado, obtendo uma concentração máxima de 74, g/l. O autor realizou, também, alguns ensaios em sistema descontínuo alimentado, e sugere que este tipo de fermentação seja preferencialmente empregado para a produção de 2,3-butanodiol. Neste caso foi verificado que em nenhum momento a cultura ficou exposta a concentrações de substrato inibitórias. De acordo com Olson e Johnson (1948) o emprego do sistema descontínuo alimentado permite evitar a inibição causada por altas concentrações de substrato. O sistema descontínuo alimentado é indicado, ainda, quando se tem problemas de inibidores microbianos no meio de fermentação (MOSER, 1985). No caso do emprego de matérias-primas lignocelulósicas, em que o processo de hidrólise resulta na formação de diversos compostos inibidores (FRAZER e McCASKEY, 1989; SJOLANDER et al., 1938), este sistema é de grande interesse como dito anteriormente. Prata (1997) obteve rendimentos de até 8% do valor

44 42 teórico da conversão de substrato em 2,3-butanodiol, durante a fermentação em sistema descontínuo alimentado, a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Considerando que para o processo de recuperação a concentração de 2,3-butanodiol deve ser a maior possível, o sistema descontínuo alimentado é o mais adequado para a obtenção deste produto, uma vez que através do mesmo obtêm-se as maiores concentrações: Olson e Johnson (1948) obtiveram 99, g/l, a partir de glicose; Yu e Saddler (1982) obtiveram 113, g/l (somando butanodiol com acetoína) e Silveira (1991) obteve 92,9 g/l, a partir de sacarose. Silveira et al. (1998) encontraram os maiores valores de produtividade e rendimento, na fermentação de sacarose em sistema descontínuo, com uma concentração de 95 g/l de substrato. De acordo com os autores, o microrganismo só é inibido em concentrações acima desse valor. Garcia (1999), utilizando uma vazão de alimentação igual a 72, ml/h e uma concentração de substrato inicial Si igual a 9 g/l, verificou que não houve acúmulo de substrato no meio, na condição que proporcionou o melhor resultado de produção de butanodiol, sugerindo que uma vazão de alimentação maior e/ou uma maior concentração de substrato no meio de alimentação pode resultar em maiores valores de concentração de produto e de produtividade Recuperação do produto Poucas pesquisas foram direcionadas para um dos grandes problemas da fermentação butileno-glicólica, que é a recuperação do produto a partir do meio fermentado. As maiores dificuldades na recuperação deste glicol são devido ao seu elevado ponto de ebulição ( ºC), sua grande afinidade com a água e a presença de constituintes sólidos e dissolvidos no meio de fermentação (LONG e PATRICK, 1963). Alguns métodos de recuperação do 2,3-butanodiol de meios fermentados são citados na literatura. Entre estes estão a conversão química, a extração com emprego de solventes e o arraste por vapor (LEDINGHAM e NEISH, 1954; LONG e PATRICK, 1963; MAGEE e KOSARIC, 1987). Afschar et. al (1993) propuseram um método para recuperação de 2,3-butanodiol utilizando a técnica de salting-out. Vários experimentos foram realizados para avaliar o efeito de diferentes sais na separação do diol de melaço e

45 43 hidrolisado amiláceo fermentados por Klebsiela pneumoniae. Os melhores resultados foram obtidos com carbonato de potássio anidro (K 2 CO 3 ), um sal altamente solúvel em água e, por outro lado, com baixa solubilidade em dióis. Após a dissolução do sal e aquecimento do meio a 4 ºC, duas fases distintas se formam: uma contendo o diol (fase superior) e outra contendo água e o sal (fase inferior). Com a adição de 53% (p/p) de K 2 CO 3 ao meio de melaço fermentado, livre de células e previamente clarificado, foi possível recuperar 94% do diol presente. A concentração do diol na solução obtida foi de 97% (p/p). No trabalho publicado por Qureshi et al. (1994) foi estudado um processo de destilação à vácuo com membrana, para a recuperação de 2,3-butanodiol. O método consiste na utilização de uma membrana hidrofóbica microporosa de PTFE (politetrafluoretileno), sob um gradiente de temperatura, que permite a passagem de vapor d água enquanto retém o 2,3-butanodiol. O sistema permitiu obter uma solução com até 43 g/l de butanodiol. Garcia e Prata (26) estudou a recuperação do produto através da técnica de salting out, com o objetivo de determinar a melhor temperatura e a melhor concentração de sal que proporcionasse uma maior recuperação de 2,3-butanodiol a partir de meio fermentado, o qual foi preparado com hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. Os autores observaram que aumentando-se a temperatura de 2 ºC para 6 ºC, a recuperação de 2,3-butanodiol diminuiu nitidamente. Em temperaturas menores o aumento da concentração de sal favoreceu o processo de recuperação. Pela metodologia estatística usada estabeleceu um modelo matemático para descrever a recuperação de 2,3-butanodiol do meio fermentado por Klebsiella pneumoniae, prevendo uma recuperação máxima de butanodiol de 92% dentro do intervalo de confiança de 95%.

46 44 3 MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram realizados nos laboratórios do Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos (GMBio) do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena-USP, em Lorena - SP. 3.1 Obtenção do hidrolisado hemicelulósico A matéria-prima empregada no presente trabalho correspondeu aos resíduos que permanecem no campo após a colheita do eucalipto (galhos, folhas e cascas), os quais foram denominados de aparas. Estas aparas foram provenientes das plantações de eucalipto da Cia Suzano de Papel e Celulose - São Luis do Paraitinga SP. A análise dos teores dos componentes da madeira (resíduo de eucalipto) foi feita por Garcia (26) de acordo com a metodologia sugerida por Dunning e Dallas (1946), que se fundamenta na sacarificação quantitativa dos polissacarídeos de diferentes matérias-primas vegetais. As aparas de eucalipto apresentaram em sua composição 32% de celulose, 15% de hemicelulose e 28% de lignina. O material para hidrólise foi obtido pela cominuição destas aparas, em um picador semi-industrial do Departamento de Materiais da EEL/USP (Figura 3.1). Figura 3.1 Picador de madeira.

47 45 A hidrólise foi realizada em reator cilíndrico, tipo eixo rotativo sob pressão, utilizando-se o processo de hidrólise ácida, nas seguintes condições: relação massa seca: água de 1:3, solução ácida a,8% de ácido sulfúrico, temperatura de 16 o C, condições estas definidas por Garcia (26). A capacidade do reator (Figura 3.2) é de 5 L, podendo-se obter cerca de 2 L de hidrolisado por partida. A fração líquida foi retirada por gravidade, através de uma saída com registro no fundo do reator e os sólidos foram. Figura 3.2 Reator de hidrólise (capacidade útil de 5L). 3.2 Concentração do hidrolisado O hidrolisado hemicelulósico foi concentrado à vácuo, em evaporador de coluna de 4 L, com aquecimento a vapor (Figura 3.3), a uma temperatura de 7 ± 5 ºC, a fim de se obter um teor de açúcares redutores totais igual a 2 g/l. Em seguida, todo o hidrolisado foi colocado em um único recipiente, para homogeneização. Por fim, uma fração do material foi diluída com água destilada para se obter 15 g/l de açúcares redutores e outra fração foi diluída para se obter 1 g/l. Uma terceira fração permaneceu com 2 g/l.

48 46 Figura 3.3 Evaporador de coluna, de capacidade igual a 4 L, operando a 7 ± 5 o C, sob vácuo. 3.3 Tratamento do hidrolisado Após as diluições e antes de se proceder ao preparo do meio de alimentação, cada fração do hidrolisado foi submetida a dois diferentes tratamentos para remoção de compostos inibidores do crescimento microbiano, os quais foram aplicados de acordo como procedimentos descritos nos itens e Precipitação por variação do ph combinada com adsorção por carvão ativo (HCA) O tratamento consistiu da remoção dos inibidores por precipitação pela variação do ph (elevação a ph 8, com óxido de cálcio, filtração após 1 horas de repouso, redução a ph 5,4 com ácido sulfúrico concentrado e filtração após 5 horas de repouso) seguida da adsorção por carvão ativo (RODRIGUES et al., 1995). Em seguida, o hidrolisado ficou em contato com o carvão, na proporção de 3% (m/v), durante 1 hora, sob agitação e temperatura de 3 ± 5 o C. Por fim, o carvão foi separado por filtração à vácuo, empregando-se papel de filtro qualitativo.

49 Extração com resinas de troca iônica (HRI) Neste tratamento foram empregadas as resinas PUROLITE A-86S, A-5 na forma Cl -, C-15 na forma H + e A-13S na forma OH -. O sistema foi constituído de 4 colunas de vidro encamisadas (Figura 3.4), medindo 8 cm de altura por 4 cm de diâmetro interno (volume total de 14,8 cm 3 ) com 2 cm de camisa, fixadas na posição vertical, empregando-se o mesmo volume de resina, alimentadas por gravidade, e com temperatura inicial de 3 o C. O hidrolisado foi filtrado para remoção de possíveis impurezas sólidas antes de ser introduzido nas colunas. Antes da operação do sistema, as resinas foram submetidas a um processo de inchamento com água destilada, sendo mantidas nesta condição por 24 horas. O ciclo de operação para o trabalho com resinas compreendeu os seguintes passos, com base no trabalho de Viñals (21): Regeneração: passagem do agente regenerante recomendado pelo fabricante a uma vazão igual a 1V L /h e em sentido contrário ao mesmo. A regeneração foi feita com uma quantidade de regenerante igual a 3V L. Lavagem: eliminação do regenerante com água deionizada para não deixar carga adicional, realizada a uma vazão constante e volume fixo de 4 L. Purificação: o hidrolisado a ser tratado foi passado através de cada uma das resinas de troca iônica numa vazão de 2V L /h, com a seguinte finalidade: a) descoloração com a resina aniônica forte A-86S b) desmineralização com s resina aniônica forte A-5 c) desmineralização com a resina catiônica forte C-15 d) descoloração com a resina aniônica fraca A-13S Lavagem: este procedimento foi realizado com água destilada em contracorrente, para remover o material estranho acumulado na resina durante o tratamento, a uma vazão constante e volume fixo. A lavagem foi feita em duas etapas: a primeira rápida (mesma velocidade de serviço) e a segunda lenta (mesma velocidade de regeneração). O hidrolisado obtido após o tratamento foi analisado em termos de concentração de açúcares e inibidores e teve sua capacidade de ser fermentado avaliada por ensaios em biorreator de bancada.

50 48 Figura 3.4 Sistema de 4 colunas de vidro encamisadas contendo, na seqüência, as resinas A-18S; A-5, C-15 e A13S. 3.4 Fermentação Microrganismo Para todos os experimentos de fermentação, foi empregada a bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B-199, fornecida pelo Northern Regional Research Laboratory, EUA e catalogada na American Type Culture Collection (ATCC), EUA, sob o código ATCC As culturas foram mantidas sob refrigeração (4 ºC), em ágar inclinado contendo os nutrientes do meio sintético definido por Frazer e McCaskey (1989), cuja composição está apresentada na Tabela Meio de preparo do inóculo A bactéria foi ativada em frascos Erlenmeyer de 25 ml, contendo 5 ml de meio composto pelos nutrientes apresentados na Tabela 3.1 e por xilose P.A., na concentração de 2 g/l. Após a mistura das soluções, o ph do meio foi ajustado para 6,2 (ph que favorece o crescimento microbiano) com ácido clorídrico 6 mol/l ou hidróxido de sódio 6 mol/l, quando necessário.o cultivo foi realizado sob agitação

51 49 de 18 rpm, em incubadora de movimento circular modelo INNOVA 4 (New Brunswick, Sci. Co.), a 37 o C. As células foram centrifugadas e ressuspendidas numa porção do meio de cultura e, em seguida, transferidas para o fermentador, de modo a se obter uma concentração inicial de 1, g/l, na fase descontínua do sistema descontínuo alimentado. Tabela 3.1 Composição do meio empregado por Frazer e McCaskey, (1989). Nutriente Concentração (g/l) Fosfato dibásico de amônio (NH 4 ) 2 HPO 4 4, Fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) 1, Cloreto de sódio (NaCl) 1, Fosfato dibásico de sódio (Na 2 HPO 4 ) 1, Sulfato de magnésio (MgSO 4 ),2 Extrato de levedura 1, Meios de Fermentação Meio para a Fase Descontínua Este meio foi composto pelos nutrientes apresentados na Tabela 3.1 e por xilose P.A., na concentração de 3 g/l. Após a mistura das soluções, o ph foi ajustado para 6,9 (PRATA, 1997) Meio de Alimentação O meio de alimentação foi constituído pelo hidrolisado hemicelulósico de eucalipto concentrado e tratado (HCA e HRI), nas concentrações de teste, conforme descrito nos itens 3.2 e 3.3, e suplementado com os nutrientes da Tabela 3.1. Para o hidrolisado HCA, após a adição dos nutrientes e ajuste do ph para 5,8, o meio permaneceu em repouso por 12 horas, sendo então centrifugado assepticamente para remoção de sólidos em suspensão, caso necessário. Todos os meios foram preparados com soluções aquosas dos respectivos componentes, as quais, assim como a água, foram esterilizadas a 12 o C por 2 minutos.

52 Condições de fermentação Com exceção do preparo do inóculo todos os ensaios foram realizados em fermentador de bancada, tipo Bioflow III (marca New Brunswick Sc. Co.) constituído de 1 turbina tipo Rushton de 6 pás-planas, com volume útil de 1,35 L, equipado com controle de temperatura, ph, agitação, aeração e medidor de oxigênio dissolvido. Os experimentos foram realizados a 37 o C, sendo a aeração e a agitação definidas de forma a se obter o valor de k L a inicial igual a 1 h -1. Inicialmente o reator foi carregado com 6 ml de meio da fase descontínua (descrito no item ) e estabeleceu-se as condições de trabalho mencionadas acima. Quando a velocidade máxima de consumo de substrato foi alcançada (cerca de 4 horas após a inoculação), iniciou-se a fase de alimentação, com adição de 75 ml de meio (descrito no item ). Com o crescimento da bactéria, o ph decresce, devido à formação de ácido acético. Quando o ph atingiu 5,8, o mesmo foi mantido neste valor, por adição automática de NaOH 6 mol/l. Tal ph foi definido por Prata (1997) como o mais adequado para a produção de butanodiol, por Klebsiella pneumoniae, quando se emprega hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. 3.5 Seqüência experimental Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA) Visando a adaptação do microrganismo ao hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA), devido a presença de compostos tóxicos inibidores do metabolismo microbiano, foi testada a estratégia de vazão crescente para a adição de meio durante a fase de alimentação. A estratégia de aumento da vazão foi a de degrau, ou seja, para cada tempo total de carga (4, 7, 1 e 13 horas) foram feitos aumentos discretos da vazão a cada hora ou a cada meia hora, o que proporcionou um aumento linear desta (Figura 3.5), e um aumento exponencial do volume de meio no reator (Figura 3.6). Foram realizados inicialmente testes com 3 tempos para adição de 75 ml de meio de alimentação (TAM): 1, 7 e 4 horas, com diferentes valores de concentração de substrato (Si) do meio de alimentação: 1, 15 e 2 g/l. Posteriormente, o tempo de 4 horas foi substituído pelo tempo de 13 horas.

53 51 35 Vazão (ml/h) h 7 h 1 h 13 h tempo (h) Figura 3.5 Variação linear da vazão de alimentação nos ensaios com adição do meio de alimentação em 4, 7, 1 e 13 horas Volume (ml) h 7 h 1 h 13 h tempo (h) Figura 3.6 Variação exponencial do volume de meio no reator durante os ensaios em sistema descontínuo alimentado com vazão crescente. Na Tabela 3.2 encontram-se os intervalos de tempo e os respectivos valores de vazão e de volume de meio no biorreator, para os quatro tempos de adição de meio.

54 52 Tabela 3.2 Valores de vazão e volume de meio no biorreator, para os ensaios com adição de 75 ml de meio de alimentação. Vazão4h Vazão 7h Vazão 1h Vazão 13h t(h) Vazão(mL/h) Vol(L) t(h) Vazão(mL/h) Vol(L) t(h) Vazão(mL/h) Vol(L) t(h) Vazão(mL/h) Vol(L), 3,6, 2,6 12,6, 12,6,5 75,615,75 42, ,612 1,5 26,618 1, 12,6525 1,5 65, ,638 3, 36,657 1,5 165,7125 2,25 88, ,678 4,5 48,711 2, 21,795 3, 11, ,732 6, 6,783 2,5 255,9 3,75 132, ,8 7,5 72,873 3, 3 1,275 4,5 155, ,882 9, 82,981 3, ,1775 5, , ,978 1,5 96 1,14 4, - 1,35 6, 2 1, ,88 12, 11 1,248 6,75-1, ,212 13, - 1, , Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no sistema descontínuo alimentado repetido De acordo com a análise dos resultados obtidos no item e comparação com o trabalho de Garcia (1999), empregou-se a vazão e a concentração que apresentaram melhores resultados dos parâmetros fermentativos do hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA). Os valores de vazão e de concentração foram empregados tanto para o hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA) quanto para o tratado com resina de troca iônica (HRI), na fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido, com a finalidade de comparar os tratamentos em função dos parâmetros fermentativos neste novo sistema Definição do tempo de corte para os hidrolisados tratados HCA e HRI O tempo de corte foi definido de acordo com a situação do meio fermentado, já que os tratamentos proporcionaram valores diferentes de remoção dos compostos inibidores. As fermentações foram mantidas até exaustão do substrato e então foi escolhido um parâmetro em comum entre os resultados obtidos das fermentações com os hidrolisados HCA e HRI, para futuras comparações. O tempo de corte foi definido como sendo o tempo no qual houvesse cerca de 2 g/l de xilose remanescente, aproximadamente a concentração no início da alimentação. De acordo com este critério, o tempo de corte para a fermentação utilizando HCA foi cerca de 2 horas e para HRI foi cerca de 1 horas, após o término da alimentação.

55 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para os hidrolisados tratados HCA e HRI As condições de fermentação para estes ensaios foram as mesmas mencionadas no item Quando o tempo de fermentação do primeiro ciclo foi igual ao tempo de corte previamente definido (item 3.5.3), foi feita a remoção de um volume de meio fermentado igual ao volume de meio adicionado durante a alimentação (75 ml). Em seguida iniciou-se novo ciclo de alimentação, com a vazão e o valor de Si estabelecidos em função do melhor resultado encontrado previamente (item 3.5.2). Inicialmente foram executados 4 ciclos de descarga e alimentação. Em função dos resultados foi possível verificar a eficiência do sistema proposto, que resultou nos melhores valores de rendimento e produtividade do processo. 3.6 Métodos analíticos Concentração de Açúcares e Ácido Acético Os açúcares (glicose, xilose e arabinose) e o ácido acético foram dosados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), em cromatógrafo WATERS, equipado com coluna BIO-RAD Aminex HPX-87H (3 x 7,8 mm), acoplado a um detector de índice de refração RID-6A. O eluente utilizado foi ácido sulfúrico,5 mol/l desgaseificado, a um fluxo de,6 ml/min. A temperatura da coluna foi de 45 ºC e o volume de amostra injetado de 2 μl. As concentrações foram calculadas de acordo com curvas de calibração que correlacionam a concentração de cada um dos padrões com a área do respectivo pico Concentração de produtos Os produtos da fermentação 2,3-butanodiol e acetoína foram quantificados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), em cromatógrafo WATERS equipado com coluna HAMILTON PRP-X3, acoplado a um detector de índice de refração, operando nas seguintes condições: temperatura de 5 o C; eluente: água ultra-pura desgaseificada; fluxo do eluente:,8 ml/min; volume de amostra: 2 μl.

56 54 As concentrações foram calculadas por curvas de calibração que correlacionam a concentração de cada um dos padrões com a área do respectivo pico Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural Furfural e hidroximetilfurfural foram dosados por cromatografia líquida de alto desempenho em cromatógrafo WATERS equipado com detector UV, coluna Hewlett- Packard RP18 (2 mm), nas seguintes condições: temperatura de 25 ºC; detector de ultra-violeta no comprimento de onda de 276 nm; eluente solução de acetonitrila e água na proporção de 1:8 com 1% de ácido acético; fluxo de,8 ml/min; volume de amostra de 2 μl. As concentrações foram calculadas por curvas de calibração que correlacionam a concentração de cada um dos padrões com a área do respectivo pico Determinação de fenóis totais Para determinar fenóis totais pelo reagente de Folin-Ciocalteu (SINGLETON et al., 1999), foram feitas algumas modificações no método. Obteve-se uma curva de calibração usando vanilina como padrão. Tomaramse 3 ml de amostra diluída em um tubo de ensaio e adicionou-se os seguintes reagentes, na ordem:,2 ml de reativo de Folin-Ciocalteu,8 ml de solução Na 2 CO 3 (15 g/l) Após a adição do reativo de Folin-Ciocalteu, agitou-se o tubo em vórtice e deixou em repouso de 5-8 minutos, e, em seguida, adicionou-se solução de Na 2 CO 3. Os tubos foram cobertos, mantidos em repouso por 3 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Em seguida foi medida a absorbância a 76 nm em cubeta de 1 cm, contra um branco obtido pelo mesmo procedimento, contendo água no lugar de vanilina. A concentração de fenóis foi expressa como equivalentes de vanilina, em g/l.

57 Concentração celular O crescimento celular foi medido por densidade ótica, sendo que a concentração foi obtida por uma curva de calibração que correlaciona absorbância com massa seca de células por unidade de volume (g/l). As leituras foram feitas a 6 nm, em espectrofotômetro BECKMAN DU 64B, utilizando-se água destilada como branco. A curva de calibração foi obtida a partir de uma suspensão de células previamente separadas por centrifugação e ressuspendidas em solução de soro fisiológico Coeficiente Volumétrico de Transferência de Oxigênio (k L a) O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio foi determinado pelo método polarográfico, gassing-out descrito por Wise (1951) citado por Stanbury, Whitaker (1986). A medida foi feita no próprio reator, nas condições de operação previstas para a fermentação, após a calibração do eletrodo. Primeiramente a concentração de oxigênio dissolvido no meio foi reduzida a zero pela injeção de nitrogênio. Em seguida o líquido foi agitado e aerado de acordo com as condições desejadas, e o aumento da concentração de oxigênio dissolvido foi monitorado por uma sonda de oxigênio dissolvido, tipo polarográfica. A variação da concentração de oxigênio em função do tempo pode ser expressa pela seguinte equação: dc L /dt = k L a (C* - C L ), que integrada resulta em: ln (C* - C L ) = k L a. t Onde: C* é a concentração de oxigênio dissolvido na saturação C L é a concentração de oxigênio dissolvido no meio no tempo t Portanto, medindo-se vários valores de C L, compreendidos entre % e 1% da saturação do meio com oxigênio, e calculando-se, para cada medida, a diferença entre C* e C L, obtem-se a curva ln (C* - C L ) em função do tempo, sendo a sua inclinação correspondente a -k L a.

58 Parâmetros Fermentativos As massas de células, de substrato e de produto em cada tempo t foram obtidas multiplicando-se as respectivas concentrações pelo volume de meio no reator no tempo t, o qual, por sua vez, foi obtido com base na vazão de alimentação. As massas de células formadas, de substrato consumido e de produto formado foram obtidas de acordo com as seguintes equações: M xf = M Xt -M Xo M sc = M So -M St + M Sa onde: M pf = M pt -M po M xf é a massa de células formada M xt é a massa de células formada no tempo t M xo é a massa inicial de células M sc é a massa de substrato consumido M so é a massa inicial de substrato M st é a massa de substrato no instante t M sa é a massa de substrato adicionada até o instante t M pf é a massa de produto formada até o instante t M pt é a massa de produto no instante t M po é a massa inicial de produto As velocidades de crescimento (dx/dt), de consumo de substrato (-ds/dt) e de formação de produto (dp/dt) corresponderam a derivada das curvas de massa celular, consumo de substrato e formação de produto em função do tempo. As velocidades específicas foram obtidas dividindo-se as respectivas velocidades pela massa de células em cada tempo correspondente. As produtividades foram obtidas dividindo-se a variação da massa de produto formado pelo intervalo de tempo correspondente. Foram consideradas as massas de produto formadas a partir do início da alimentação do reator. Pr= (Mp-Mp o )/t

59 57 O fator de conversão de substrato em produto foi obtido dividindo-se a massa de produto formado pela massa de substrato consumido. Y P/S = M Pf /M Sc A eficiência de fermentação foi definida pela relação entre o fator de conversão obtido e o coeficiente estequiométrico. Para a conversão de xilose, glicose e arabinose em 2,3-butanodiol o valor estequiométrico é de,5 g por grama de substrato (JANSEN, TSAO, 1983). Assim, a expressão para o cálculo da eficiência foi: η = (Y P/S /,5)x1 3.8 Metodologia de análise dos resultados A qualidade do hidrolisado obtido foi avaliada pela concentração dos açúcares (xilose, glicose e arabinose) e dos inibidores (acido acético, furfural e hidroximetilfurfural) presentes, sendo desejável o maior teor de açúcares e o menor teor de inibidores. As fermentações foram avaliadas pelos parâmetros: velocidades de crescimento, de consumo de substrato e de formação de produto, fator de conversão de substrato em produto, concentração final de produto e produtividade. Os valores obtidos foram comparados entre si e com aqueles encontrados na literatura, de modo a se detectar discrepâncias, assim como para definir as condições mais adequadas que atendam aos objetivos propostos. A definição do tempo de corte, da vazão crescente de alimentação e concentração de substrato no meio de alimentação, assim como do número de ciclos do processo descontínuo alimentado repetido foi feita em função da concentração final de produto e da produtividade em 2,3-butanodiol.

60 58 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Obtenção e concentração do hidrolisado O hidrolisado foi obtido por hidrólise ácida nas condições citadas no item 3.1 e concentrado por evaporação à vácuo de acordo com item 3.2. Na Tabela 4.1 estão apresentados os dados da composição do hidrolisado original, ou seja, sem concentrar, e do hidrolisado com fator de concentração igual a 5. Observa-se uma predominância de xilose (37,96 g/l), seguida de arabinose (2,62 g/l) e glicose (2,3 g/l) entre os monossacarídeos obtidos, o que é uma característica desejável, uma vez que a bioconversão em 2,3-butanodiol pode ser realizada a partir de pentoses e hexoses (GARCIA, 26; YU e SADDLER, 1982). Durante a hidrólise da estrutura lignocelulósica, além de se liberar açúcares fermentescíveis também são liberados vários compostos, dos quais alguns podem inibir o metabolismo microbiano. Os inibidores presentes nos hidrolisados lignocelulósicos podem limitar o consumo de substrato, reduzir o crescimento, inibir a formação de produto e comprometer o rendimento do processo fermentativo. Os compostos caracterizados neste trabalho foram furfural, hidroximetilfurfural (HMF), ácido acético e fenóis totais. Observa-se na Tabela 4.1, que as concentrações dos monossacarídeos dosados (xilose, glicose e arabinose), do HMF e dos fenóis totais apresentaram um aumento proporcional ao fator de concentração do hidrolisado, enquanto que houve uma redução do furfural. Esta remoção pode ter sido causada pelas condições de operação (vácuo à 7 o C), pois, segundo Perry (1997), este composto apresenta ponto de ebulição de o C, o que favorece sua volatilização. De acordo com Converti et al. (21), o método de concentração por evaporação à vácuo é capaz de reduzir a concentração de compostos voláteis presentes como ácido acético, furfural e vanilina. Quanto ao ácido acético, verifica-se na Tabela 4.1 que houve um aumento na concentração deste composto, porém, não proporcional ao fator de concentração. Este fato pode ser atribuído às condições empregadas, podendo existir uma parcial volatilização do mesmo. De acordo com Rodrigues (1999), o baixo ph do hidrolisado favorece a volatilização parcial do ácido acético por este se encontrar na forma não dissociada nesta condição.

61 59 Tabela 4.1 Composição do hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto. COMPONENTES Hidrolisado Original CONCENTRAÇÃO (g/l) Hidrolisado Concentrado não Tratado Glicose 2,3 13,4 Xilose 37,96 184,83 Arabinose 2,62 1,46 Ácido Acético 8,6 13,66 Furfural,178,34 HMF,65,31 Fenóis Totais 3,74 19,32 ph 11,35,, Tratamento com carvão ativo e resinas de troca iônica Com o objetivo de obter um hidrolisado com menor teor possível de inibidores do crescimento microbiano, foram testados dois tratamentos, um baseado na precipitação por variação do ph e adsorção com carvão ativo (HCA) e outro baseado na adsorção por resinas de troca iônica (HRI), conforme descrito nos itens e Os resultados, em termos de concentração de açúcares e inibidores, foram comparados após cada tratamento. A Tabela 4.2 apresenta as concentrações médias de substrato (soma dos monossacarídeos glicose, xilose e arabinose), furfural, hidroximetilfurfural, fenóis e ácido acético, após cada um dos tratamentos mencionados. Observa-se que os compostos resultantes da degradação dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural) foram praticamente removidos do hidrolisado com os dois procedimentos de tratamento. Não há na literatura registros de efeito tóxico destes compostos quando presentes em concentrações tão baixas quanto estas. Delgenes et al. (1996) verificaram que concentrações de,5, 1, e 2, g/l de furfural reduziram o crescimento de P. stipitis em 25, 47 e 99%, respectivamente, e concentrações de,5,,75 e 1,5 g/l de HMF reduziram o crescimento em 43, 7 e 1%. Roberto et al. (1991b) estudaram o efeito tóxico do furfural sobre o crescimento e o consumo de xilose por P. stipitis e observaram que concentrações.

62 6 Tabela 4.2 Composição do hidrolisado hemicelulósico concentrado tratado com carvão (HCA) e com resina de troca iônica (HRI). COMPONENTES TRATAMENTO CARVÃO ATIVO (HCA) RESINA (HRI) Substrato 86,5 126,83 181,7 113,52 Ácido Acético 7,5 1, 12, ND Furfural,25,4,55 ND HMF,13,19,26 ND Fenóis Totais 3,66 4,22 7,34 ND ND.: não detectado menores que,5 g/l de furfural tiveram efeito positivo no crescimento, porém concentrações acima de 1, g/l de furfural inibiram quase totalmente o crescimento. Chung e Lee (1985) observaram, na produção de etanol pela levedura Sacharomyces cerevisiae a partir de hidrolisado celulósico de madeira, que o furfural e o HMF causaram morte celular em concentrações de,8 e 1,1 g/l, respectivamente. Segundo Sánchez e Bautista (1988), o crescimento de Cândida guilliermondii foi inibido de 62 a 1% quando foram adicionados, ao meio, furfural e HMF em concentrações de 2, g/l. Delgenes et al. (1996) sugerem que os compostos fenólicos possuem um grande potencial inibitório, inclusive em baixas concentrações (cerca de,1 g/l), sendo os compostos de baixa massa molecular considerados os de maior toxicidade. Os açúcares glicose, xilose e arabinose tiveram suas concentrações reduzidas no primeiro tratamento devido ao uso do carvão ativo. A perda de açucare foi em média igual 14,1%, a qual pode ser considerada baixa, em vista de outros resultados encontrados na literatura. Silva et al. (1998), que utilizaram 3% de carvão no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, observaram uma remoção de 31,3% dos açúcares presentes. O hidrolisado submetido ao tratamento com resinas de troca iônica apresentou 1% de remoção dos compostos inibidores dosados, que incluem ácido acético, furfural, HMF e compostos fenólicos representados por vanilina. Além disso, houve uma excelente clarificação, conforme pode ser observado pela aparência do hidrolisado após cada resina (Figura 4.1).

63 61 No tratamento com resinas a perda de açúcares foi em média de 6% em relação ao hidrolisado inicial. Dentre os compostos inibidores, o ácido acético foi o único que não sofreu alterações significativas com o processo de tratamento com carvão ativo, fato este também observado em outros trabalhos (PRATA, 1997; RODRIGUES et al., 1995). HC A86 A5 C15 A13S Figura 4.1 Aspecto do hidrolisado concentrado e sem tratamento (HC), e após tratamento com resinas de troca iônica A86, A5, C15 e A13S. 4.3 Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado com carvão ativo Foram realizados 3 grupos de ensaios de fermentação com o objetivo de comparar os tempos de alimentação (TA) de 4, 7 e 1 horas, utilizando em cada grupo um valor nominal de Si, ou seja: Grupo de Ensaios 1: Si = 2 g/l, Grupo de Ensaios 2: Si = 15 g/l e Grupo de Ensaios 3: Si = 1 g/l. Os ensaios foram conduzidos em sistema descontínuo alimentado, conforme descrito no item Todos os parâmetros utilizados na discussão foram calculados durante a fase de alimentação, com o objetivo de avaliar o comportamento do microrganismo nesta fase do processo, em que a adição de inibidores é crescente.