POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE EXTRATO DE TOMILHO (Thymus vulgare L.) G.S. Duarte 1, J.H.L. Souza 1, C.P.M. Aranha 1 1- Faculdade de Engenharia Universidade Federal da Grande Dourados, Engenharia de Alimentos CEP: 79804-970 Dourados MS Brasil, Telefone: +55 (67) 3410-2170 e-mail: (CarolineAranha@ufgd.edu.br) RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar o potencial antioxidante dos extratos de de tomilho, bem como determinar a estabilidade oxidativa do óleo de soja, submetido ao processo de termoxidação. Para determinar a atividade antioxidante do extrato e seu efeito sinergista com o tercbutilhidroquinona (TBHQ), a termoxidação foi realizada por 20 horas a 180ºC. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey para as médias a 5% empregando o programa STATISTICA 10. Pelos resultados de atividade antioxidante (DPPH) e compostos fenólicos totais, verificou-se que o extrato etanólico apresentou potencial antioxidante. Observou-se também que o extrato preveniram a oxidação lipídica quando adicionado ao óleo de soja, pelos resultados obtidos na análise de estabilidade oxidativa. ABSTRACT This research aims to evaluate the antioxidant potential of thyme extract, as well as determine the oxidative stability to soybean oil under thermal oxidation. In order to determine the antioxidant activity of the extract and it synergistic effect with tert-butylhydroquinone (TBHQ), the thermal oxidation was performed for 20 hours at 180ºC. The results obtained were subjected to analysis of variance and Tukey test for averages at 5%, using the program STATISTICA 10. Considering the results of antioxidant activity (DPPH) and total phenolic compounds, it was possible to verify that the ethanolic extract has presented antioxidant potential. It is also noted that the extract prevented lipid oxidation when added to the soybean oil, the results obtained for oxidative stability. PALAVRAS-CHAVE: atividade antioxidante; DPPH ; compostos fenólicos totais; estabilidade oxidativa. KEYWORDS: antioxidant activity; DPPH ; total phenolic compounds; oxidative stability. 1. INTRODUÇÃO Óleos e gorduras são matérias-primas com larga faixa de aplicação, estando entre os principais componentes dos alimentos. São compostos que têm grande importância para a dieta humana, pois constituem a maior fonte de energia calórica para o organismo, além de apresentarem alguns elementos que desempenham funções importantes, como por exemplo, as vitaminas lipossolúveis e os ácidos graxos essenciais. Atuam também como meio de transferência de calor em frituras e são responsáveis pela palatabilidade, sabor, cor e textura, características estas dos alimentos submetidos aos processos de fritura e forneamento (Oliveira e Regitanod arce, 2004; St. Angelo, 1996).
Os óleos e gorduras estão sujeitos a diversas reações que resultam em modificações de suas características originais e que envolvem alterações biológicas, físicas e químicas, dentro das quais se enquadra o processo de oxidação lipídica (Namiki, 1990; Nawar, 1985). Os antioxidantes são comumente usados para inibir, prevenir ou retardar a deterioração pela oxidação (Pokorný, 2007). Os antioxidantes sintéticos mais utilizados pela indústria de alimentos são butil hidroxianisol (BHA), butil hidroxitolueno (BHT), terc-butilhi droquinona (TBHQ) e galato de propila (GP), cuja ação consiste na rápida doação de um átomo de hidrogênio para o radical livre. Entretanto, durante o processamento térmico a 185 C, ocorre volatilização e decomposição desses antioxidantes (Hamama e Nawar, 1991). No entanto, o emprego de antioxidantes sintéticos na indústria de alimentos tem sido alvo de questionamentos quanto à sua inocuidade. Sendo assim, pesquisas são realizadas em busca de compostos naturais que apresentem essa propriedade funcional, podendo atuar como alternativa para prevenir a deterioração oxidativa de alimentos e diminuir o uso dos antioxidantes sintéticos. Os antioxidantes naturais podem ser encontrados e isolados em uma variedade de alimentos. Dentre as fontes de antioxidantes naturais podem ser citados os cereais, os cogumelos, as ervas e especiarias e as sementes de frutas cítricas (Pérez-Jiménez e Saura-Calixto, 2005; Yanishlieva et al., 2006; Elmastas et al., 2007). 2. MATERIAL E MÉTODOS Para a realização do presente trabalho, a especiaria (tomilho) in natura foi selecionada, retirando folhas danificadas e raízes e, então, submetida à liofilização e em seguida, o material liofilizado foi triturado para a obtenção de um pó uniforme. Para comparar o efeito antioxidante do extrato de tomilho foi utilizado antioxidante sintético terc-butilhidroquinona (TBHQ) fornecido pela empresa Danisco S/A. Os ensaios experimentais foram realizados com óleo de soja refinado, adquirido no comércio local sem adição de antioxidante sintético. 2.1 Obtenção Do Extrato Para a obtenção do extrato etanólico de tomilho, 5 g da especiaria foram adicionados em 100 ml de álcool etílico. A mistura foi submetida a uma intensa agitação por 16 minutos e, em seguida, foi filtrada separando o extrato líquido do material sólido. A remoção do solvente utilizado para a obtenção do extrato foi realizada em evaporador rotativo, sob pressão reduzida a 40ºC. 2.2 Termoxidação Foram submetidos à termoxidação diferentes tratamentos: óleo de soja sem adição de antioxidante (OS), óleo de soja com adição de 50 mg/kg de antioxidante sintético tercbutilhidroquinona (TBHQ), óleo de soja com adição de extrato de tomilho (ET) e óleo de soja com adição de extrato de tomilho e terc-butilhidroquinona (Mistura). Os tratamentos foram colocados em chapa aquecida, utilizando béqueres de 50 ml contendo 30 ml de amostra com relação superfície/volume 0,4/cm. A temperatura utilizada foi 180ºC e o ensaio foi conduzido de modo descontínuo por dois dias, com 10 horas de aquecimento ao dia, cujas tomadas das amostras foram feitas em diferentes períodos de tempo (0, 10 e 20 horas). A temperatura foi controlada com auxílio de termômetro. Todas as amostras, a diferentes intervalos de tempo, foram recolhidas em frasco âmbar e armazenadas à temperatura de aproximadamente -18ºC até o momento das análises.
2.3 Atividade Antioxidante A atividade antioxidante foi determinada segundo o método de Brand-Williams et al. (1995). Neste procedimento, preparou-se uma solução etanólica com concentração de 500 µg/ml de extrato de tomilho. A cada amostra desta solução (0,3 ml) foi adicionada a 2,7 ml de solução de DPPH (40 µg/ml) em diferentes concentrações (5, 10, 25, 50, 125, 250 e 400 µg/ml). Após o tempo de 30 minutos, a absorbância foi lida em 515 nm e convertida em porcentagem de atividade antioxidante (AA), seguindo a fórmula: AA(%) = 100 {[(Absamostra Absbranco ) x 100] / Abscontrole}. Um controle foi feito com 2,7 ml de DPPH e o branco realizado com 0,3 ml de solução etanólica do extrato e 2,7 ml de metanol, para cada concentração. 2.4 Composto Fenólicos Totais A quantificação de compostos fenólicos totais foi determinada por espectrofotometria, por meio do reagente Folin-Ciocalteu, segundo a metodologia descrita por Singleton e Rossi (1965). Neste procedimento, pipetou-se 100 µl da solução de extrato natural em tubos de ensaio e adicionou-se 500 µl do reagente Folin-Ciocalteu. Em seguida, adicionou-se 1,5 de solução saturada de carbonato de sódio a 20% e 6 ml de água destilada. Essa mistura permaneceu em repouso por 2 horas em temperatura ambiente e a absorbância foi determinada a 765 nm. Para a quantificação, foi feito uma curva de calibração, utilizando ácido gálico em concentrações de 0 a 500 mg/l. 2.5 Estabilidade Oxidativa Foi determinada pelo método proposto pela AOCS Cd 12b-92 (1993) utilizando o Rancimat, marca Metrohm, modelo 743, que se baseia na determinação da condutividade elétrica dos produtos voláteis de degradação. A determinação foi realizada a 100ºC, com fluxo de ar de 20 L/h, utilização de 3 g de amostra e volume de água destilada de 60 ml nos frascos contendo os eletrodos. 2.6 Análise Estatística Os resultados obtidos das determinações analíticas em duplicata foram submetidos à análise de variância para determinar a influência dos tratamentos e dos tempos de aquecimento sobre a alteração dos óleos submetidos ao aquecimento. A termoxidação foi realizada em esquema fatorial 4 x 3, no delineamento inteiramente casualizado. As análises de variância e os testes de Tukey para as médias a 5% foram obtidos através do programa ESTAT versão 2.0. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O rendimento porcentual, bem como o teor de compostos fenólicos totais, a porcentagem de atividade antioxidante máxima (AAMáxima) e o valor da concentração necessária de extrato para reduzir em 50% os radicais livres (EC50) do extrato etanólico de tomilho estão apresentados na Tabela 1. O rendimento do extrato etanólico de tomilho foi de 34,80%. Na pesquisa realizada por Barros et al. (2010) obtiveram rendimento para o extrato metanólico de orégano de 30,69%. Observase que os resultados destes estudos foram superiores ao obtido neste trabalho, devido ao fato de que o rendimento de uma extração depende do solvente e método utilizados.
Tabela 1 Determinações do rendimento (porcentagem), compostos fenólicos totais (mg EAG/g) e EC 50 (μg/ml) do extrato etanólico de tomilho. Determinações analíticas Extrato etanólico de tomilho Rendimento (%) 34,80 ± Compostos fenólicos totais (mg EAG/g) 96,82 ± EC 50 (μg/ml) 21,52 ± A concentração de compostos fenólicos totais do extrato de tomilho foi de 96,82 mg EAG/g. No estudo realizado por Katalinic et al. (2006), determinaram a concentração de compostos fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteau em 70 amostras de plantas medicinais, e encontraram para o tomilho 87,6 mg EAG.g -1. Mata et al. (2007) analisaram o total de compostos fenólicos de extrato etanólico e aquoso de tomilho, pelo método de Folin- Ciocalteau, e os valores encontrados foram de 113 e 74,9 mg EAG.g -1, para extrato etanólico e aquoso, respectivamente. Estas diferenças são evidenciadas pela forte influência que o tipo de solvente utilizado tem sobre a quantidade de compostos fenólicos extraídos da matéria-prima, ou seja, quanto mais polar o solvente, maior a quantidade de compostos fenólicos extraídos (Gaméz-Meza et al., 1999). A maior atividade antioxidante do extrato está associada com menores valores de EC50, definido como a concentração necessária para reduzir em 50% os radicais livres (Su et al., 2007). O valor de EC 50 de 21,52 μg/ml para o extrato etanólico de tomilho foi obtido por regressão linear com R 2 = 0,9885. Mata et al. (2007) encontraram valor de EC50 para extrato etanólico e aquoso de tomilho de 13,2 e 31,6 μg/ml, respectivamente. Os valores da estabilidade oxidativa obtidos neste trabalho estão apresentados na Tabela 2. A estabilidade oxidativa é intimamente influenciada pela presença de antioxidante que, por sua vez, sofre a ação de elevadas temperaturas. Tabela 2 Médias de estabilidade oxidativa (horas) para os tratamentos durante a termoxidação a 180 C Tempo (horas) Amostra 0 10 20 OS 14,83 ± 0,01 ac 8,44 ± 0,08 bc 3,49 ± 0,12 cc TBHQ 24,84 ± 0,345 aa 6,29 ± 0,125 bd 4,46 ± 0,11 cb OT 13,94 ± 0,155 ac 13,00 ± 0,015 bb 12,16 ± 0,195 ca Mistura 20,40 ± 0,245 ab 15,16 ± 0,505 ba 12,08 ± 0,055 ca OS: óleo de soja; TBHQ: óleo de soja com terc-butilhidroquinona (50 mg/kg); ET: óleo de soja com extrato de tomilho (3000 mg/kg); Mistura: óleo de soja com extrato de tomilho (3000 mg/kg) + TBHQ (50 mg/kg). a, b... (linha): médias de tempos de aquecimento seguidas de mesma letra minúscula não diferem pelo teste de Tukey (p > 0,05); A, B (coluna): médias de tratamentos seguidas de mesma letra maiúscula não diferem pelo teste de Tukey (p > 0,05). Observa-se que a estabilidade oxidativa é inversamente proporcional ao tempo de aquecimento, visto que ocorreu uma redução ao longo do tempo de aquecimento, para todos os tratamentos. Evidencia-se também que o tratamento ET apresentou menores variações nos valores de estabilidade oxidativa entre os tempos de aquecimento.
Nota-se que no tempo inicial, o tratamento TBHQ apresentou maior estabilidade oxidativa. Entretanto, no tempo final os tratamentos ET e Mistura obtiveram maiores valores de estabilidade, o que evidencia que o extrato etanólico de tomilho é o principal responsável pelo efeito protetor do óleo de soja termoxidado. Não houve diferença significativa entre os tratamentos ET e Mistura e, portanto, não foi evidenciado sinergismo entre o terc-butilhidroquinona e o extrato de tomilho. 4. CONCLUSÕES Ao analisar os dados obtidos foi possível verificar que o extrato etanólico de tomilho apresentou considerável atividade antioxidante representada pelo valor EC50, bem como pelos compostos fenólicos totais. O potencial antioxidante do extrato de tomlho foi evidenciado nos resultados de estabilidade oxidativa do tratamento ET. Contudo, não foi verificado o efeito sinergista entre o antioxidante natural e sintético, já que a Mistura apresentou resultados semelhantes ao do tratamento ET. Tendo em vista que o extrato de tomilho quando adicionado ao óleo de soja na concentração de 3000 mg/kg foi o principal responsável por retardar a oxidação lipídica, recomenda-se o uso deste extrato como antioxidante para óleo de soja como alternativa aos antioxidantes sintéticos. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AOCS (1993), Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society, 3 ed. Champaign, IL. Barros, L., Heleno, S.A., Carvalho, A. M. and Ferreira, C.F.R. (2010). Lamiaceae often used in Portuguese folk medicine as a source of powerful antioxidants: vitamins and phenolics, LWT - Food Science and Technology, 43(3), 544-559. Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E. and Berset, C. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, Lebensmittel Wissenschaft Technologie, 2891), 25-30. Elmastas, M., Isildak, O., Turkekul, I. and temur, N. (2007). Determination of antioxidant activity and antioxidant compounds in wild edible mushrooms, Journal of Food Composition and Analysis, 20(3), 33-45. Gaméz-Meza, N., Noriega-Rodríguez, J.A., Medina-Juárez, L.A., Ortega-García, J., Cázarez- Casanova, R. and Angulo-Guerrero, O. (1999). Antioxidant activity in soybean oil of extracts from thompson grape bagasse, Journal of the American Oil Chemists Society, 76(12), 1445-1447. Hamama, A.A. and Nawar, W.W. (1991). Thermal decomposition of some phenolic antioxidants, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 39(6), 1063-1069. Katalinic, V., Milos, M., Kulisic, T., Jukic, M. (2006). Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols. Food Chemistry, 94, 550-557. Mata, A. T., Proença, T., Ferreira, A. R., Serralheiro, M. L., Nogueira, J. M. F., Araújo, M. E. M. (2007). Antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of Five plants used as Portuguese food spices. Food Chemistry, 102(3), 778-786. Namiki, M. (1990). Antioxidants and antimutagenics in food - critical review, Food Science Nutrition, 29(4), 273-300.
Nawar, W. W. Lipids. In: Fennema, O. R. Food Chemistry. 2. ed. New York: Marcel Dekker, 1985. p. 139-44. Oliveira, J T.G.S.B., Regitano-D arce, M.A.B. (2004). Determinig economial TBHQ doses for corn oil stability, Ciência e Tecnologia de Alimentos, 24(3), 413-418. Pérez-Jiménez, J.; Saura-Calixto, F. (2005). Literature data may underestimate the actual activity of cereals, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(13), 5036-5040. Pokorný, J. (2007). Are natural antioxidants better and safer than synthetic antioxidants?, European Journal of Lipids Science and Technology, 109(6), 629-642. Singleton, V.L. and Rossi, J.A. (1965). Colorimetric of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16(3), 144-146. St angelo, A.J. (1996). Lipid oxidation in foods critical review, Food Science and Nutrition, 36(3),175-224. Su, L., Yin, J.-J., Charles, D., Zhou, K., Moore, J. and Yu, L.L. (2007). Total phenolic contents, chelating capacities, and radical-scavenging properties of black peppercorn, nutmeg, roseship, cinnamom and oregano leaf, Food Chemistry, V100(2), 990-997. Yanishlieva, N.V., Marinova, E. and Pokorný, J. (2006). Natural antioxidants from herbs and spices, European Journal of Lipids Scienca and Technology, 108(9), 776-793.