CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE ÓLEO DE ORÉGANO COMO ANTIOXIDANTE NATURAL EM LINGUIÇA SUÍNA FRESCAL

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1 CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE ÓLEO DE ORÉGANO COMO ANTIOXIDANTE NATURAL EM LINGUIÇA SUÍNA FRESCAL R.O. Pretes 1, R.A.Serafim 2, M.Poças 3, L.S.Sakanaka 4, M.R.Pedrão 4, M.M.Yamaguchi 4 1- Graduanda em Tecnologia em Alimentos, Departamento Acadêmico de Alimentos, Câmpus Londrina, Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR - CEP: Londrina PR Brasil, Telefone: +55 (43) Fax: +55 (43) (raquel_prete@hotmail.com) 2- Mestrando, Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos (PPGTAL), Câmpus Londrina, UTFPR rodolfoserfim_ras@hotmail.com 3 Bolsista PIBIC, graduanda em Tecnologia em Alimentos, Departamento Acadêmico de Alimentos, Câmpus Londrina, UTFPR milenapocas@hotmail.com 4 Docentes do Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos PPGTAL, Câmpus Londrina, UTFPR. mmyamaguchi@utfpr.edu.br RESUMO O objetivo do presente trabalho foi avaliar a capacidade antioxidante do o óleo de orégano comercial e a aplicação deste nas formulações de linguiça suína frescal em substituição parcial do eritorbato de sódio. Para avaliar a capacidade antioxidante do orégano em linguiça frescal, o grau de oxidação lipídica foi determinado semanalmente pelo método TBARS. Com base no valor da capacidade antioxidante do eritorbato foi realizado o delineamento experimental, contando com uma formulação controle utilizando apenas eritorbato de sódio, a segunda com 70% de eritorbato e 30% de óleo essencial de orégano, a terceira com 50% de cada e o último 30% e 70%. Observou-se um efeito sinérgico entre os antioxidantes, obtendo diferença significativa (mg MDA/kg F1: 1,139±0,12; F2: 1,254±0,04; F3: 1,123±0,04) com o controle (1,457±0,06 mg MDA/kg) no final de 28 dias, demonstrando maior eficiência com a adição do óleo essencial de orégano do que apenas com eritorbato de sódio. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the antioxidant capacity of the commercial oregano oil and the application of the pork sausage formulations frescal in partial substitution of sodium erythorbate. To assess the antioxidant capacity of oregano in fresh sausages, the degree of lipid oxidation was determined weekly by the TBARS method. Based on the value of erythorbate antioxidant capacity was carried out the experimental design, with a formulation control using only erythorbate sodium, the second with 70% of erythorbate and 30% essential oil of oregano, the third with 50% each and the last 30% and 70%. There was a synergistic effect between antioxidants, obtaining significant difference (MDA mg / kg F1: ± 0.12; F2: ± 0.04; F3: ± 0.04) with the control (1.457 ± 0, 06 mg MDA / kg) at the end of 28 days, demonstrating greater efficiency with the addition of oregano essential oil than with sodium erythorbate. PALAVRAS-CHAVE: oxidação lipídica; Origanum vulgare; TBARS; ABTS. KEYWORDS: Lipid oxidation; Origanum vulgare; TBARS; ABTS. 1. INTRODUÇÃO A preocupação com a saúde e com uma alimentação cada vez mais saudável tem levado os consumidores à procura de alimentos com menos aditivos ou que estes sejam provenientes de fontes naturais. Devido a divulgação de estudos a respeito da toxicologia de aditivos sintéticos utilizados pela indústria, consumidores optam por alimentos minimamente processados ou do tipo frescal. No caso de produtos cárneos, por serem altamente perecíveis, procura-se maneiras de prolongar sua vida útil. Um dos maiores fatores que acarretam em diminuição do tempo de vida é a

2 oxidação lipídica, visto que produz compostos indesejáveis e perceptíveis sensorialmente, além de diminuir seu valor nutricional (Novello; Pollonio, 2013). A linguiça frescal, objeto deste trabalho, possui uma fração lipídica alta (até 30%), e tem elevada exposição ao oxigênio devido a moagem dos ingredientes, de modo que é de interesse tecnológico buscar meios para desacelerar sua oxidação, em especial o uso de antioxidantes naturais. A legislação brasileira estabelece limites de uso para antioxidantes sintéticos, dos quais apesar da eficiência, tem sido demonstrado por diversos estudos o efeito tóxico para a saúde humana (Lima et al., 2010). Alternativamente, os antioxidantes naturais vêm sendo aplicados em busca de eficiência e atoxicidade, entretanto, limitando sua quantidade para não ocorrer alteração de maneira indesejada da característica sensorial do alimento (Rosa et al., 2013; Brasil, 1998). Provindos de fontes vegetais variadas, estes antioxidantes em sua maioria são formados por compostos fenólicos, os quais apresentam um ou mais anéis aromáticos em sua estrutura, com características sensoriais marcantes no caso de temperos, como a sálvia, orégano, tomilho, entre outros, devendo ser levado em consideração sua contribuição ao sabor e aroma do produto (Brewer, 2011). Para a realização deste trabalho, foi avaliada a capacidade antioxidante do óleo essencial de orégano, adquirido comercialmente, de modo a embasar o delineamento para sua aplicação em linguiça suína frescal. O óleo de orégano foi utilizado em conjunto com o eritorbato de sódio, um antioxidante sintético de uso comum para este tipo de produto, a fim de verificar o comportamento, tendo em vista a substituição parcial do eritorbato na formulação. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 AVALIAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO O antioxidante natural em foco neste estudo foi o Óleo Essencial de Orégano comercial extraído por arraste de vapor das folhas de Origanum vulgare, proveniente dos Estados Unidos. Este foi avaliado quanto a sua capacidade antioxidante e estudado em comparação ao antioxidante sintético eritorbato de sódio, comercial puro. Compostos Fenólicos Totais - O conteúdo de compostos fenólicos foi realizado pelo método de Folin-Ciocalteau adaptado por Pereira (2009) do método descrito por Singleton (1965). Ele se baseia na quantificação espectrofotométrica de compostos fenólicos, em que o reagente na presença de certos agentes redutores forma os compostos molibdênio azul e tungstênio azul, com coloração que permite ser determinada sua concentração em espectrofotômetro no comprimento de onda de 740nm. O óleo essencial de orégano foi diluído em etanol, utilizando-se de diferentes concentrações (2mg/mL a 0,125mg/mL). Foi preparado em tubo de ensaio, em triplicata, cada amostra utilizando 0,5 ml e adicionando 2,5 ml do reagente de Folin-Ciocalteau 10% diluído em água destilada. Após 5 minutos foi acrescido de 2 ml de carbonato de sódio (Na 2 CO 3 ) a 4%. Agitou-se os tubos e armazenou por duas horas, ao abrigo de luz, em temperatura ambiente. Após o tempo de incubação mensurou-se a absorbância, usando água destilada como branco. Foi utilizado o ácido gálico (20 a 70 μg/ml), dissolvido em água destilada, para elaboração da curva padrão e os valores de compostos fenólicos totais foram expressos como equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/g de amostra). Capacidade sequestrante do radical ABTS - O método ABTS foi realizado conforme a metodologia desenvolvida por Re (1999). Preparou-se uma solução estoque de 2,2 -azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) a 7mM em água destilada, sendo armazenado em vidro âmbar sob refrigeração. O radical ABTS foi preparado utilizando 5 ml da solução estoque e 88 µl de solução de persulfato de sódio 140 mm em água destilada, sendo armazenado ao abrigo de luz, em temperatura ambiente por 16 horas.

3 Para realizar a leitura em espectrofotômetro foi utilizado o comprimento de onda de 734 nm, e o radical ABTS diluído em álcool etílico até atingir uma absorbância de 0,700 ± 0,05 preparado no momento da análise. Utilizou-se 30 µl de diluições do óleo essencial de orégano em tubos de ensaio realizados em triplicata, homogeneizando-os com 3 ml da solução radical ABTS em agitador de tubos. Os tubos foram mantidos ao abrigo da luz por 6 minutos e a leitura realizada em espectrofotômetro a 734nm, obtendo-se uma coloração verde-azulada que diminui conforme a quantidade de antioxidante presente. Foi utilizado uma curva padrão de Trolox (6-Hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilchroman-2-ácido carboxílico) e os resultados são expressos como TEAC (Capacidade antioxidante equivalente ao Trolox), de modo a TEAC corresponder em mmol Trolox por ml de óleo essencial de orégano. 2.2 APLICAÇÃO EM LINGUIÇA SUÍNA FRESCAL Foi desenvolvida uma formulação padrão de linguiça similar a um produto comercial (Tabela 1) e outras três formulações com variação apenas das concentrações de antioxidante. Tabela 1 Formulação padrão da linguiça frescal Ingredientes % Carne suína 72 Toucinho 23 Água 3 Sal 1,5 Sais de Cura* 0,21 Alho 0,15 Pimenta branca 0,02 Tempero verde 0,12 *Sais de cura comercial próprio para linguiça suína, sendo uma combinação de nitrito e nitrato de sódio. Devido à ausência de legislação sobre a quantidade de antioxidante natural e por simular um produto a ser comercializado, optou-se por uma substituição parcial de um antioxidante sintético, utilizando eritorbato de sódio, por ser comumente aplicado em embutidos crus. Esta substituição não foi determinada por volume e sim pela atividade antioxidante observada in vitro, ou seja, usou-se quantidade suficiente de óleo essencial de orégano para atingir a mesma atividade da quantidade de eritorbato de sódio a ser substituída. Tabela 2 Formulações de linguiça frescal com diferentes percentuais de óleo essencial de orégano (OEO) Formulação % de OEO % de Eritorbato de Sódio Controle Formulação Formulação Formulação Realizou-se um teste para determinar esta equivalência da atividade antioxidante in vitro por meio do método ABTS. Seguindo a quantidade de eritorbato de sódio indicada para óleos e gorduras,

4 de 0,1 g por kg de produto (0,01%), estabeleceu uma correlação com o óleo essencial de orégano. A partir deste resultado as formulações foram definidas, conforme a tabela 2. A carne suína e o toucinho foram moídos no momento do preparo da linguiça. A massa de linguiça foi preparada conforme a formulação e homogeneizada. Para cada formulação foi preparada um quilograma de massa para então adicionar o(s) antioxidante(s) conforme o delineamento experimental e realizou-se nova homogeneização. Cada formulação foi embutida separadamente e embalada em bandeja plástica com cobertura de filme PVC e armazenadas por 28 dias a 4 C. 2.3 AVALIAÇÃO DA OXIDAÇÃO LIPÍDICA Para avaliação da capacidade antioxidante do óleo de orégano sobre a oxidação lipídica da linguiça frescal foi realizada a análise das substâncias reativas ao ácido 2-tiobarbitúrico. Índice de substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) - Este teste foi conduzido conforme descrito por Stefanello (2015), onde quantificou-se o malonaldeído (MDA) proveniente da decomposição dos compostos primários da oxidação lipídica, o qual reage com o ácido 2- tiobarbitúrico formando um complexo cromogênio, e apresenta uma coloração vermelha. Esta coloração foi quantificada por espectrofotômetro no comprimento de onda de 531 nm. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Devido a variação da composição de óleos essenciais influenciados pela sazonalidade, colheita, temperaturas de secagem, entre outros (Tavares, 2005), em particular no orégano observado pela variação da quantidade de seus principais compostos timol e carvacrol (Oliveira, 2008), faz-se necessário avaliar o objeto em estudo. A quantificação dos compostos fenólicos traz uma perspectiva das propriedades bioativas da amostra, por sua relação com a atividade antioxidante (Bianchin, 2014). Para uma solução 1 mg/ml de óleo essencial de orégano apresentou 340,12±2,78 µg GAE (equivalente de ácido gálico) de compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante de 2.613,39 TEAC µm/ml. Para equiparar a atividade antioxidante do eritorbato de sódio (E) com a atividade do óleo essencial de orégano (OEO), realizou-se testes, com diferentes concentrações de eritorbato de sódio com valor de atividade antioxidante de µm/ml. Por meio deste estudo determinou-se a quantidade a ser usada nas formulações de modo a retirar 30, 50 e 70% de E e utilizar a quantidade necessária para o OEO apresentar a mesma atividade antioxidante. Analisando individualmente o comportamento das formulações durante o tempo (figura 1), observa-se que não houve diferença significativa no tempo inicial e na primeira semana em nenhum dos ensaios, obtendo valores significativos de oxidação a partir dos 14 dias de armazenamento até o fim do experimento, com exceção da formulação 2 (70% E 30%OEO). Conforme a figura 1, no tempo de 21 dias apenas a formulação com maior quantia de orégano diferiu significativamente das outras formulações, apresentando menor valor de malonaldeído. Conforme Pereira e Pinheiro (2013) e Serafini (2013), valores acima de 1 mg MDA/kg, a oxidação lipídica começa a ser notada sensorialmente, assim apenas a formulação 3 (30% E e 70% OEO) não apresentaria alteração sensorial, pois o valor de malonaldeído manteve-se abaixo de 1 mg. No tempo de 28 dias apenas o eritorbato diferiu significativamente de todas as formulações com valor de MDA maior. Permite-se concluir que a combinação de eritorbato de sódio com orégano mostrou maior eficiência do que utilizando apenas o eritorbato de sódio. Resultado similar foi encontrado por Figueiredo (2010) que aplicou combinações de eritorbato de sódio e urucum em carne suína moída onde os valores de TBARs foram significativamente menores quando aplicado em combinação do que a amostra controle composta apenas de eritorbato de sódio.

5 Figura 1 Gráfico do resultado da análise de TBARs durante o armazenamento de linguiça frescal E (eritorbato de sódio) OEO (óleo essencial de orégano). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) pelo Teste de Tukey. 4. CONCLUSÃO A adição do óleo de orégano em combinação ao eritorbato de sódio em linguiça frescal foi suficiente para reduzir de maneira significativa a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico durante o armazenamento de 28 dias em refrigeração. Não se levou em consideração uma possível sinergia ao fazer o delineamento fatorial, efeito este observado entre os dois antioxidantes, o qual necessita de maiores estudos para esclarecer de que forma ocorre. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bianchin, M. (2014). Atividade antioxidante de ervas aromáticas e pólen apícola e seus efeitos durante armazenamento de patê de frango. (Trabalho de Conclusão de Curso) Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Pato Branco. Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (1998). Regulamento Técnico: Atribuição de Função de Aditivos, Aditivos e seus Limites Máximos de uso para a Categoria 8 - Carne e Produtos Cárneos (Portaria n.1.004, de 11 de dezembro de 1998). Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brewer, M. S. (2011). Natural Antioxidants: Sources, Compounds, Mechanisms of Action, and Potential Applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 10, Figueiredo, B. C. (2010). Estudo da adição do urucum e eritorbato de sódio sobre a oxidação lipídica em carne suína. (Dissertação de Mestrado). Universidade Estadual de Campinas, Campinas. Lima, A.R.; Pereira, R.G.F.A.; Abrahão, S. A. (2010) Compostos bioativos do café: atividade antioxidante in vitro do café verde e torrado antes e após a descafeinação. Revista Química Nova, 33(1),

6 Novello, D.; Pollonio, M.A.R. (2013). Teores d e colesterol e oxidação lipídica em hambúrguer bovino com adição de linhaça dourada e derivados. Pesq. Agropec. Bras. 48(7), Oliveira, D. H. (2008). Caracterização química do óleo essencial de Origanum vulgare: análise da relação timol/carvacrol. In 17º Congresso de Iniciação Científica, Pelotas, Rio Grande do sul. Pereira, D.; Pinheiro, S. R. (2013). Elaboração de hambúrgueres com antioxidantes naturais oriundos de extratos etanólicos de alecrim (Rosmarinus officinalis L.). Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Pato Branco. Pereira, M. G. (2009). Aplicação de Antioxidantes Naturais em Carne Mecanicamente Separada (CMS) de Ave. (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria. Re, R. (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26, Rosa, C. S.; Kubota, E.; Stein, M.; Nogara, G. P.; Vizzotto, M. (2013). Avaliação do efeito de extrato de farinha de alfarroba (Ceratonia siliqua L.) na estabilidade oxidativa e cor de hambúrgueres congelados. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, 34(5), Singleton, V.L. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Viticulture, 16, Stefanello, F. S. (2015). Efeito da adição de extrato de cogumelo do sol em linguiça suína e avaliação da estabilidade oxidativa e microbiológica do produto. Semina: Ciências Agrárias, 36(1), Tavares, E.S. (2005). Análise do óleo essencial de folhas de três quimiotipos de Lippia alba (Mill.) N. E. Br. (Verbenaceae) cultivados em condições semelhantes. Rev. bras. farma., 15(1), 1-5.