Avaliação in vitro de Creolina e Cruzwaldina frente aos principais agentes causadores de importantes enfermidades na Medicina Veterinária O presente trabalho avaliou a sensibilidade in vitro de bactérias causadoras de importantes enfermidades na Medicina Veterinária frente aos desinfetantes Creolina e Cruzwaldina, ambos na concentração recomendada pelo fabricante. As cepas avaliadas para ambos os produtos foram: Candida albicans; Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; Listeria monocytogenes; Proteus vulgaris; Pseudomonas aeruginosa; Salmonella cholerasuis; Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus; Staphylococcus pseudintermedius; Streptococcus agalactiae e Streptococcus pyogenes. A determinação da eficácia dos produtos Creolina nas diluições de 2% e 4% e Cruzwaldina a 3% quanto à ação bactericida foi realizada através do método oficial preconizado pela Associação Oficial de Química Analítica e pela Fundação Oswaldo Cruz, denominado de método de Diluição-Uso. Os produtos em estudo apresentaram eficácia frente às principais cepas testadas. A. S. LIMA 1, M. M. PEREIRA 2, G. P. MACHADO 3 1 Alessandra Silva Lima, M.V., Msc., Gerente Médica - Eurofarma Laboratórios S/A, São Paulo, SP, BRASIL. alessandra.lima @eurofarma.com.br 2 Marina Mendonça Pereira, M.V., Analista de Pesquisa Clínica - Eurofarma Laboratórios S.A., São Paulo, SP, BRASIL. 3 Gláucio Pereira Machado, M.V., Diretor - Laboratórios Ecolyzer Ltda., São Paulo, SP, ESTADO, BRASIL. INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO INTRODUÇÃO A limpeza e a desinfecção são consideradas os principais métodos de prevenção de doenças nas propriedades rurais. É indispensável que se adote um programa de limpeza e desinfecção abrangente e de uso rotineiro, visando diminuir e manter baixa concentração de microrganismos patogênicos no ambiente, dificultando desta forma, a probabilidade de infecções. Um bom programa é a base para boa saúde animal, uma vez que, em condições de confinamento, a gravidade e a ocorrência das enfermidades estão diretamente relacionadas ao nível de contaminação do ambiente (Rui, 2011). Dentre os benefícios do programa de limpeza e desinfecção estão o aumento da produtividade; a diminuição na incidência de doenças infecciosas e parasitárias; diminuição do número de animais refugos (debilitados); diminuição de gastos com medicamentos bem como com os gastos com mão-de-obra (Spinosa et al., 2011). No comércio estão disponíveis diversos tipos de desinfetantes químicos, no entanto, o critério de escolha de um determinado ativo deve ser baseado no potencial que o mesmo apresenta para o combate ao agente que se deseja eliminar (Russel, 1996). Dentre os fatores que podem modificar a eficiência dos desinfetantes químicos, merecem especial destaque: concentração do desinfetante, tempo de contato, a temperatura, o ph, a dureza da água, o tipo de microrganismo e a presença de matéria orgânica. Embora a orientação técnica para o uso de desinfecção química, nas instalações zootécnicas e equipamentos, considere a importância da remoção prévia da matéria orgânica existente, é fato conhecido que em condições naturais, haverá sempre a presença de 14 A Hora Veterinária Ano 32, nº 193, maio/junho/2013
uma parcela variável de alguns componentes orgânicos tais como: sangue, leite, fezes, urina ou outras secreções e excreções eliminadas pelos animais, bem como as sobras de alimentos ou resíduos de cama utilizados pelos mesmos. Dentre os desinfetantes químicos mais comuns utilizados na medicina veterinária estão os fenóis e os cresóis. O fenol, um dos mais antigos germicidas, possui amplo espectro de ação e sua atuação não é prejudicada pela presença de matéria orgânica nem por sabões, portanto é o desinfetante de escolha na desinfecção de superfícies com contaminação fecal (Grezzi, 2008). Por funcionarem melhor que outros desinfetantes (detergentes, compostos quaternários de amônia, clorhexidina, soluções de cloro ou iodo) sob desafio de matéria orgânica são indicados para uso em pedilúvio, rodolúvio, cama, pisos de terra batida e outras áreas cuja matéria orgânica não pode ser completamente removida ou cuja limpeza é deficiente (OIE, 2000; Grezzi, 2008; Spinosa et al., 2011). Tanto o fenol como o cresol exerce ação bactericida, fungicida e viricida para alguns vírus (Spinosa et al., 2006; Grezzi, 2008). Além disso, ambos apresentam poder residual prolongado. A atuação do cresol também não é prejudicada pelo contato com matéria orgânica (Mendes et al., 2004; Spinosa et al., 2006). Dentre as indicações dos fenóis, Garcia (1999) no comunicado Embrapa nº 25 apresentou o resultado do estudo com vacas holandesas acometidas por pododermite (inflamação da região interdigital) utilizando no tratamento Creolina (composição a base de fenol) em solução aquosa, na concentração de 1-2% em pedilúvio com capacidade em torno de 10-20 litros. O tratamento foi realizado diariamente, durante três dias, no mínimo. Os resultados clínicos foram surpreendentes, todos os animais tratados responderam satisfatoriamente ao tratamento. É sabido que o pedilúvio realizado da forma correta pode diminuir em até 90% do aparecimento de problemas de casco. Segundo Pesce et al. (1992), uma vaca portadora de doença nos cascos pode ter perda, por lactação, entre 5% e 20% na produção leiteira, e para um bovino de corte, perda de até 25% no peso da carcaça. O Código Zoosanitário Internacional, ao abordar medidas de higiene e segurança sanitária na produção animal, alerta sobre a existência de poucos desinfetantes universais e da necessidade de controle da atividade dos produtos existentes. As metodologias de avaliação microbiológica de desinfetantes são constantemente questionadas, pois os protocolos laboratoriais para comprovação de eficácia de um composto ativo são diferentes das condições reais de uso (G. Reybrouck, 1992). A Associação Oficial de Química Analítica (AOAC) recomenda a metodologia da Diluição-Uso para determinar a eficácia dos desinfetantes comerciais (Association of Official Analytical Chemist, 1984; Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, 1985; Ministério da Saúde, Portaria nº 67, 1985) O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar a sensibilidade in vitro de bactérias causadoras de importantes enfermidades na medicina veterinária frente aos desinfetantes Creolina e Cruzwaldina, ambos na concentração recomendada pelo fabricante. MATERIAL E MÉTODOS A determinação da eficácia dos produtos Creolina nas diluições de 2% e 4% e Cruzwaldina a 3% quanto à ação bactericida foi realizado no Laboratório Ecolyzer, localizado na cidade de São Paulo/SP. Utilizou-se o método oficial preconizado pela Associação Oficial de Química Analítica e pela Fundação Oswaldo Cruz, denominado de método de Diluição-Uso. Este método consiste na contaminação de cilindros carreadores com o microrganismo a ser testado, cultivo em placas de petri e posterior transferência para 60 tubos de ensaio contendo o desinfetante na diluição preconizada (Figura 1). A amostra foi considerada satisfatória quando eliminou o microrganismo teste no mínimo em 59 dos 60 cilindros utilizados. A leitura dos resultados foi realizada através da presença ou ausência de crescimento bacteriano, verificada por turvação ou não do meio de cultura dos tubos incubados. A Hora Veterinária Ano 32, nº 193, maio/junho/2013 15
Figura 1. Transferência dos cilindros carreadores da placa de petri para os tubos de ensaio. As cepas avaliadas para ambos os produtos foram: Candida albicans (ATCC 10231); Escherichia coli (ATCC 11229); Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Listeria monocytogenes (ATCC 7644); Proteus vulgaris (ATCC 10740); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442); Salmonella cholerasuis (ATCC 10708); Salmonella typhimurium (ATCC 14028); Staphylococcus aureus (ATCC 6538); Staphylococcus pseudintermedius (ATCC 49444) Streptococcus agalactiae (ATCC 12386); Streptococcus pyogenes (ATCC 12345). Tabela 1. Resultados dos desinfetantes testados pelo Método de Diluição de Uso frente às cepas testadas, 2013 RESULTADOS Desde 1985, o Brasil adotou o método de Diluição-Uso, padronizada pela Associação Oficial de Química Analítica, como o método oficial na avaliação microbiológica de desinfetantes, para qualificar os produtos para efeito de registro, comercialização e comprovação de eficácia. A Tabela 1 apresenta os resultados de eficácia das amostras testadas. Foi considerada satisfatória a eficácia quando esta eliminou os microrganismos teste no mínimo em 59 dos 60 cilindros utilizados. DISCUSSÃO Tabela 2. Principais enfermidades relacionadas com as cepas estudadas, 2013 Manter os sistemas de produção livres ou controlados de patógenos, evita riscos à saúde pública e de grande impacto econômico (Sobestiansky, 2002; Sesti, 2004). As principais cepas relacionadas à contaminação ambiental e causadoras de importantes enfermidades na medicina veterinária foram testadas no presente estudo (Tabela 2). A Listeria monocytogenes é encontrada na natureza e no trato intestinal dos animais, logo, é comum a contaminação da carcaça e cortes de carne durante o abate e o processamento. Este microrganismo é considerado um patógeno emergente, podendo ocasionar listeriose em humanos através da ingestão de alimentos contaminados com o mesmo. A listeriose é uma zoonose de grande importância em saúde pública, visto que pode ocasionar aborto, septicemias e meningites. Entre as enfermidades de maior importância da medicina veterinária, destaca-se a mastite, doença responsável pelos maiores prejuízos à produção de leite mundial. Estimativa feita em vários países indicam perdas da ordem de 10 a 15% da produção leiteira devido à mastite. No Brasil a estimativa de perda por mastite subclínica é de aproximadamente US$ 317,00/ vaca/ano (Spinosa et al., 2011). A mastite por microrganismos ambientais é transmitida principalmente no intervalo entreordenhas, em ambientes com excesso de matéria orgânica, dejetos e umidade (Ribeiro et al., 2006). Pseudomonas aeruginosa são bactérias oportunistas, ubíquas, identificadas em diversas afecções, tanto nos humanos como nos animais, observadas especialmente em quadros de otite, cistite, endometrite, encefalite, linfadenite, mastite, dermatite, abscessos, pneumonia, enterite e septicemia (Radostits et al., 2007). No ambiente, são encontradas preferencialmente na água, no solo e, ocasionalmente, nas plantas. Nos animais, podem ser isoladas das mucosas e fezes (Quinn et al., 2005). As infecções pelo gênero Salmonella em animais de produção e de companhia estão associadas a grande variedade de manifestações clínicas entéricas e extraentéricas (Radostits et al. 2007). A diarreia neonatal de bezerros acarreta graves prejuízos à pecuária tanto pela mortalidade quanto pelos custos envolvidos com o tratamento 16 A Hora Veterinária Ano 32, nº 193, maio/junho/2013
e atraso no crescimento dos animais, sendo a salmonelose uma das causas mais importantes, com destaque para Salmonella typhimurium (Fecteau et al., 2003). Nos suínos, as infecções entéricas, tendo como principal agente a Salmonella cholerasuis, estão entre as doenças mais frequentes na produção suinícola, sendo responsáveis por expressivas perdas e significativo impacto econômico no setor. Os prejuízos são representados por redução do ganho de peso, mortalidade e gastos com antibioticoterapia (Mcorist, 2005). Dentre os diversos fatores responsáveis pela baixa produtividade do rebanho bovino, as doenças respiratórias se encontram em situação de destaque, principalmente pelo alto índice de morbidade entre os animais. A constante exposição do sistema respiratório aos microrganismos potencialmente patogênicos e as particularidades anatômicas de trato respiratório dos bovinos predispõe esta espécie às doenças inflamatórias pulmonares (Radostits et al., 2007). Entre as doenças respiratórias que acometem bovinos as pneumonias são as mais frequentes, principalmente em animais jovens (Hartel et al., 2004). Os episódios da doença, em geral, ocorrem até os dois anos de vida, sendo a maioria até o desmame. Por serem uma das principais causas de perdas econômicas na cadeia produtiva bovina, a gestão sanitária dos rebanhos deve ser prioridade na promoção da saúde dos animais e prevenção da pneumonia (Maillard et al., 2006). Dentre os principais agentes causadores da pneumonia, podemos destacar Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e o Staphylococcus aureus. A perda da atividade antimicrobiana na presença de matéria orgânica é amplamente registrada na literatura (Mcdonnel, Russel, 1999; Rodgers et al., 2001), variando com o princípio ativo do desinfetante e a linhagem desafiadora, demonstrando a importância da escolha por produtos a serem utilizados em programas de controle nas propriedades rurais no qual a ação não deve ser prejudicada pela presença de matéria orgânica. O conhecimento da presença de matéria orgânica e do material da superfície que se pretende desinfetar, bem como das características químicas dos desinfetantes, são fundamentais para a seleção dos produtos comerciais (Tamasi, 2003). Neste contexto, temos o fenol e o cresol descritos na literatura como eficaz mesmo na presença de componentes orgânicos tais como: sangue, leite, fezes, urina ou outras secreções e excreções eliminadas pelos animais, bem como as sobras de alimentos ou resíduos de cama utilizados pelos mesmos (Mendes et al., 2004). Os resultados do presente estudo apontaram a eficácia da Creolina na diluição de 4% em 100% frente às cepas testadas. A Creolina apontou eficácia para os principais agentes causadores de mastite como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli, agentes presentes no meio ambiente responsáveis por acometer as vacas leiteiras. Além disso, foi eficaz contra todas as cepas relacionadas com enterites bacterianas, diarreias e infecções digestivas, pneumonias e infecções respiratórias, metrite, infecções pós-parto, das vias genitais, urinárias e do umbigo, listeriose e onfalites. Na concentração a 2%, a Creolina demonstrou eficácia em 83% das cepas testadas, sendo que o produto foi ineficaz para a bactéria S. pseudintermedius, porém esta apresenta baixa prevalência dentre os agentes isolados no diagnóstico de mastite no Brasil. A Cruzwaldina é um desinfetante veterinário para desinfecção de instalações rurais, tais como: pocilgas, galinheiros, canis, estábulos e outros abrigos de animais, mostrou-se eficaz frente às principais cepas testadas, não sendo eficaz somente para três cepas relacionadas à mastite, porém a levedura Candida albicans e a bactéria S. pseudintermedius não apresentam alta prevalência dentre os agente isolados no Brasil. Entre os patógenos causadores de mastite, o Streptococcus agalactiae possuem posição de destaque, porém nem a Creolina nem a Cruzwaldina na diluição a 2% foi eficaz para esta cepa. Somente a Creolina na diluição a 4% apresentou resultado satisfatório. A Hora Veterinária Ano 32, nº 193, maio/junho/2013 17
CONCLUSÃO O presente estudo escolheu importantes cepas relacionadas a diferentes enfermidades comuns nas propriedades rurais para avaliar a eficácia bactericida in vitro de dois conceituados desinfetantes. Os produtos testados Creolina e Cruzwaldina apresentaram eficácia frente às principais cepas testadas. REFERÊNCIAS Association of Official Analytical Chemist. Official methods of analysis. 14th ed., Arlington, 1984. BRASIL, Portaria n 101, de 17 de agosto de 1993. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Métodos de Análise Microbiológica para Alimentos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 17 de agosto de 1993, Seção 1, p. 11937-11945 FECTEAU, M.V.; HOUSE, J.K; KOTARSKI, S.F. Efficacy of ceftiofur tratament of experimental salmonellosis in neonatal calves. Am. J. Vet. Res.,v.64, p.918-925, 2003. GARCIA J.T.C. Pododermite dos bovinos (Frieiras) - Uma alternativa de tratamento. Comunicado Embrapa, n. 25, 1999. GREZZI, G. 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Strains tested for both products were: Candida albicans, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Listeria, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella cholerasuis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Streptococcus agalactiae, and Streptococcus pyogenes. Determining the effectiveness of Creolina dilution in 2% and 4% and Cruzwaldina 3% as the bactericidal action was carried through the official method recommended by the Association of Official Analytical Chemistry and Oswaldo Cruz Foundation, named Dilution- Use Method. The products tested showed efficacy against the major strains tested. 18 A Hora Veterinária Ano 32, nº 193, maio/junho/2013