DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA FISIOLOGIA ANIMAL II AULA 5 Teste ELISA para o VIH PAULO SANTOS 2006 1
OBJECTIVOS Consolidar conhecimentos relativos às reacções do sistema imunitário contra infecções virais; produção de anticorpos e reacção antigénio-anticorpo: Aplicar a técnica de ELISA Conhecer as potencialidades e debilidades dos testes de diagnóstico para o VIH. PARTE A INTRODUÇÃO Todas as pessoas com dúvidas sobre se estão ou não infectadas pelo VIH, ou que se expuseram a situações de risco de infecção, devem realizar o teste serológico anti-vih. Não é fácil determinar se uma pessoa está infectada ou não com o vírus VIH, devido à ausência de sintomas em muitos casos. Por isso, a única forma de saber se está realmente infectada é fazer um teste específico. Também deve ter em consideração que o período de incubação da infecção leva a que haja uma altura em que estando infectado, o teste revela-se negativo, é o chamado período de janela imunológica. Existem vários tipos de teste que são mais ou menos fiáveis e que demoram mais ou menos tempo. Embora seja possível detectar partículas do VIH através de análises complexas, uma forma mais prática de obter o mesmo resultado consiste em tentar detectar anticorpos produzidos em reacção ao vírus. Estes anticorpos só são detectados pelo menos três meses depois da infecção; em certos casos podem demorar um ano ou mais a desenvolver-se. Assim, um resultado negativo não elimina necessariamente a hipótese de existência de uma infecção por VIH. O teste mais usual é o Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay). Utilizando alguns componentes do invólucro que envolve o vírus, são procurados no sangue da pessoa os anticorpos que o corpo naturalmente desenvolve em resposta à infecção com o VIH. Os resultados deste teste são rápidos, mas podem surgir os falsos positivos, isto é, uma pessoa que não tem o vírus da Sida, mas este é identificado. Por isso, se o resultado for positivo, deve ser sempre repetido e outros tipos de testes devem ser realizados, para que não restem quaisquer dúvidas. 2
A técnica de imunodetecção utilizada (ELISA) é uma técnica relativamente simples, que se baseia em quatro passos: A avaliação dos resultados poderá ser feita por visualização directa ou por quantificação através de um leitor de placas ELISA. Os poços que permanecem incolores são considerados negativos, ou seja, não possuem os anticorpos em estudo, enquanto que os poços onde se desenvolve a cor azul são considerados positivos. Se pretender quantificar terá de realizar previamente uma curva padrão, e analisar a placa com o auxilio de um leitor de placas ELISA. 1º- Adição do antigénio. O antigénio é adicionado aos poços existentes nas microplacas. Após um determinado período de tempo, necessário para que ocorra a ligação dos antigénios aos poços, procede-se à lavagem dos poços com detergente, para retirar os antigénios não ligados e também para bloquear ligações não especificas dos anticorpos ao plástico. 2º- Adição do anticorpo primário. A amostra contendo os anticorpos que se procuram detectar é adicionada aos poços e incubada, para permitir a ligação dos anticorpos aos antigénios. Os anticorpos não ligados são depois removidos por lavagem. 3º- Adição do anticorpo secundário. Uma solução, contendo o anticorpo secundário, que tem ligado uma enzima cromática, é adicionada aos poços e incubada, para permitir a ligação dos anticorpos secundários aos anticorpos primários. Os anticorpos secundários não ligados são depois removidos por lavagem. 4º- Adição do substrato para a enzima. Uma solução contendo o substrato para a enzima, que se encontra ligada ao anticorpo secundário, é adicionada aos poços e incubada durante um curto período de tempo, de modo a permitir o desenvolvimento da cor (1). (1) Reacção colorimétrica descrita em anexo 3
PARTE B PARTE EXPERIMENTAL Este trabalho experimental deverá ser realizado em grupo com 4 elementos. Procedimento 1. Identifique os tubos com a indicação do grupo a que pertence; 2. Marque a tira de 12 poços como indicado na figura seguinte; a. Qual o motivo pelo qual todos os poços estão em triplicado? 3. Proceda à ligação do antigénio aos poços transferindo 50 µl para cada um dos poços; Antigénio 4. Espere 5 minutos; a. Qual o objectivo desta incubação? 5. Lave os poços para retirar o antigénio não ligado; a. Vire a tira de poços sobre uma pilha de toalhas de papel e bata suavemente algumas vezes de modo a retirar todo o liquido; 4
b. Encha com cuidado cada poço com o tampão de lavagem, tendo cuidado para não entornar para o poço vizinho; c. Vire a tira de poços sobre uma pilha de toalhas de papel e bata suavemente algumas vezes de modo a retirar todo o liquido; d. Descarte as 2 toalhas do topo da pilha; 6. Repita o ponto anterior; 7. Coloque 50 µl do controlo positivo nos poços marcados com (+); 8. Coloque 50 µl do controlo negativo nos poços marcados com (-); 9. Coloque 50 µl do soro obtido em cada um dos grupos com poços respectivos (G1, G2, G3 ou G4); 10. Espere 5 minutos; Controlo ou soro a. Qual o objectivo desta incubação? 11. Lave todos os poços, repetindo o ponto 5 duas vezes; 2x 12. Coloque 50 µl do anticorpo secundário em cada um dos poços; 5
13. Espere 5 minutos; Anticorpo secundário a. Qual o objectivo desta incubação? 14. Retire os anticorpos secundários não ligados repetindo o ponto 5 três vezes; 3x 15. Coloque 50 µl do substrato enzimático em cada um dos poços; 16. Espere 5 minutos; Substrato enzimático a. Qual o objectivo desta incubação? 17. Observe e registe os resultados; 18. Proceda à leitura no Leitor de placas ELISA ao comprimento de onda de 655nm. 6
Resultados Assinale, na figura seguinte, quais os poços que apresentaram cor azul e responda às seguintes perguntas. 1. O soro do seu grupo continha anticorpos conta o VIH? 2. Se o resultado foi positivo, significa que tem SIDA? 3. Poderá obter um resultado falso positivo? 4. Poderá ter um resultado negativo quando já esteve em contacto com o vírus? 5. Indique outros testes onde a técnica de ELISA poderá ser utilizada. Bibliografia ELISA Immuno Explorer kit instruction manual. Bio-Rad, 2004 7
Anexo Detecção colorimétrica Os anticorpos secundários utilizados na técnica de ELISA estão ligados a enzimas. A detecção dos anticorpos secundários, que se encontram ligados aos anticorpos primários, é efectuada através de uma reacção enzima-substrato. Nesta aula prática o anticorpo secundário utilizado está ligado a uma peroxidase de rábano (Horseradish peroxidase, HRP). Na presença de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ), a HPR cataliza a oxidação do substrato 3,3,5,5 - tetrametilbenzideno (TMB). A oxidação do TMB pela HRP resulta na formação de um produto azul. HRP (enzima) + H 2 O 2 HRP-O + H 2 O TMB (incolor) HRP-O + H 2 O TMB carregado positivamente (azul) + HRP-O + H 2 O 8