Diagnóstico de cânceres usando imagens por geração de segundo harmônico Aloísio Miguel Garcia 1 Introdução Imagem de microscopia por geração de segundo harmônico é uma poderosa ferramenta para estudos biomédicos, especialmente em diagnóstico de câncer. Neste trabalho iniciamos um estudo, com resultados preliminares, de aperfeiçoamento do diagnóstico de tumores malignos de próstata em tecido humano usando a técnica de SHG, do inglês Second Harmonic Generation. O câncer de próstata é a sexta principal causa de morte em homens no mundo e diagnósticos precoces podem evitar muitas mortes. Uma das grandes vantagens de se usar a técnica de SHG, na caracterização dos tecidos biológicas, é que devido ao comprimento de onda de excitação ser próximo do infravermelho, alto comprimento de onda, o poder de penetração na amostra é maior. Essa maior penetração ocorre devido ao menor espalhamento Rayleigh, que é inversamente proporcional ao comprimento de onda à quarta potência. Outras vantagens são um foto-dano inferior e ausência de toxicidade. Esta última é devido a ausência de marcadores biológicos fluorescentes. Marcadores biológicos, ou corantes, são moléculas que absorvem e emitem luz para um determinado comprimento de onda de excitação. Esses corantes têm a capacidade de ligar especificamente em um determinado material biológico. Com isso podemos ter uma imagem de fluorescência
deste material biológico. Em SHG não precisamos de marcação biológica. Para induzir um sinal de SHG necessitamos de uma fonte de luz de alta intensidade e de um material que seja não centro-simétrico. Para isso usamos um laser pulsado de Ti-safira com alta potência de pico. SHG é um fenômeno óptico resultante da polarização nãolinear do material. A seguir uma pequena discussão da polarização não linear de um material. Box 1: P = P (1) + P (2) + P (3) + = ε 0 χ (1). E + ε 0 χ (2). E. E + ε 0 χ (3). E. E. E + Onde (P) é o vetor polarização induzido, (E) é o vetor campo elétrico, χ (i) é a i-ésima ordem do tensor susceptibilidade não-linear. A susceptibilidade não-linear é uma característica do material e seu valor é menor quanto maior a ordem do vetor polarização. SHG é um processo de segunda ordem, relatado na susceptibilidade nãolinear χ (2). O comprimento de onda do segundo harmônico é sempre a metade do comprimento de onda dos fótons incidentes. Portanto se incidirmos dois fótons de 800 nm, teremos um sinal de SHG em 400 nm. Isto equivale a um sinal de SHG com o dobro de frequência dos fótons incidentes. 2 Montagem experimental Para a obtenção das imagens de SHG, tecido de próstata humana foi preso em uma lamina de vidro e colocada no microscópio, e a imagem de SHG foi obtido através da montagem mostrada na figura 1.
A imagem do segundo harmônico é obtida usando o microscópio confocal FV-300 da Olympus, o laser sai da unidade de escaneamento, é transmitido pelo espelho dicroico que transmite o infravermelho e reflete o UV, e uma objetiva de 10X de aumento focaliza a luz sobre a amostra. O segundo harmônico gerado é coletado através da fotomultiplicadora: de modo análogo a microscopia confocal, o SHG é coletado pela mesma objetiva de focalização, o espelho dicroico transmite o infravermelho e reflete o visível. Um filtro 400/20 nm é colocado na frente da fotomultiplicadora PMT4, o resultado é a formação da imagem por varredura do plano focal do segundo harmônico da amostra. Figura 1: obtenção da imagem por geração de segundo harmônico usando o microscópio confocal. 3 Objetivo e resultados Utilizamos a técnica de SHG em tecidos cancerígenos e sadios de próstata humana. Portanto, já sabemos, que nos tecidos, são as fibras de colágeno tipo I que geram o sinal de segundo harmônico e que são estas, através de sua organização, que irão nos
mostrar se o tecido é cancerígeno. O colágeno, que é a proteína mais abundante nos vertebrados, constitui, nos tecidos, a rede estrutural da matriz extracelular e pode variar em estrutura, dependendo do tipo de colágeno. A quantidade e a distribuição de colágeno são importantes para as propriedades estruturais e mecânicas do tecido e desempenham um papel importante em diversas doenças, incluindo o câncer. Na figura 2 mostramos uma imagem que obtivemos de tecido de próstata humana, usando microscopia de SHG. Para gerar o sinal de segundo harmônico nessa amostra usamos um laser de Ti-safira sintonizável, comprimento de onda de incidência de 800 nm, gerando o SHG em 400 nm. Ainda não sabemos se esse tecido é cancerígeno ou não. Utilizamos este corte antes de saber o diagnóstico a ser feito por um patologista. Já sabemos que a orientação das fibras de colágeno e a intensidade de seu sinal de SHG vai dizer-nos se o tecido é cancerígeno. Essa técnica de SHG, para diagnóstico de tumores, é muito utilizado recentemente. Entretanto ela nunca foi utilizada em tecidos de próstata. O nosso objetivo é aplicar e aperfeiçoar essa técnica de SHG em muitos tecidos biológicos. Principalmente em tecidos de próstata humano. Por exemplo para garantir que estamos pegando todas as fibras de colágeno do tecido vamos girar a amostra em relação ao feixe de laser incidente. Como o sinal de SHG depende do ângulo de polarização das fibras em relação à direção do campo elétrico incidente, logo o ângulo que elas fazem com a direção da polarização do laser influencirá na intensidade do sinal de SHG.
Figura 2: A imagem da esquerda mostra um mapa sinal de autofluorescência do corte de tecido. A imagem da direita mostra o SHG obtido na mesma região. Note a presenca de sinal nas fibras de colágeno, que mostram a sua organização. Imagens em padrão de cinza: preto, significa zero e quanto mais claro, maior a intensidade do sinal 4 Conclusão No geral obtemos bons resultados. O próximo passo é o diagnóstico do patologista para concluir se o tecido é cancerígeno. Para que o diagnóstico seja mais preciso é interessante medir o sinal de SHG em várias profundidades. Com isso podemos ver se as fibras de colágeno mudam sua ornanização à medida que adentramos o tecido. Outra medida a ser feita no futuro é a coleta do sinal de SHG, das fibras de colágeno, em todas as direções de polarização. Para esta medida, vamos colocar um placa de ¼ de onda na montagem experimental. Com isso o laser chega na amostra circularmente polarizado.
3 Referência Bibliográficas Yanyue Huang and Zhengfei Zhuang. Second harmonic microscopy imaging and spectroscopy characterization in prostate pathological tissue. Wiley Periodicals, 36, 334 337 (2014). Alex J. Walsh, Rebecca S. Cook, Jae H Lee, Carlos L. Arteaga and Melissa C. Skala. Collagen density and alignment in responsive and resistant trastuzumabtreated breast cancer xenografts. Journal of Biomedical Optics 20(2), 026004 (February 2015). Karissa Tilbury, Chi-Hsiang Lien, Shean-Jen Chen and Paul Campagnola. Polarization Resolved SHG Imaging in Ovarian Cancer. Biomedical Optics (2014). N. R. Liu, G N Chen, S S Wu and R Chen. Distinguishing human normal or cancerous esophagus tissue ex vivo using multiphoton microscopy. Journal of Optics, 16 (2014). Adib KeiKhosravi, Jeremy S. Bredfeldt, Md. Abdul Kader Sagar and Kevin W. Eliceiri. Second-harmonic generation imaging of cancer. Methods in Cell Biology, 123 (2014).