EFEITO ANTIBACTERIANO IN SITU DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO ENCAPSULADO

EFEITO ANTIBACTERIANO IN SITU DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO ENCAPSULADO G. Balthazar 1, M.G. Cattelan 2, F.L. Hoffmann 3, V.L. Del Bianchi 4 1-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Brasil, Telefone: 55 (17) 3221-2714 Fax: 55 (17) 3221-2299 e-mail: (gabrielabalthazar@hotmail.com) 2-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Brasil, Telefone: 55 (17) 3221-2714 Fax: 55 (17) 3221-2299 e-mail: (mariliagcattelan@gmail.com) 3-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Brasil, Telefone: 55 (17) 3221-2714 Fax: 55 (17) 3221-2299 e-mail: (hoffmann@ibilce.unesp.br) 4- Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Brasil, Telefone: 55 (17) 3221-2259 Fax: 55 (17) 3221-2299 e-mail: (vanildo@ibilce.unesp.br) RESUMO O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito in situ do óleo essencial de orégano (OEO), encapsulado por gelificação iônica, e do sal (NaCl) no controle do desenvolvimento de Staphylococcus aureus. Para tanto, empregou-se um planejamento fatorial 2 2 com 3 repetições do ponto central. A variável resposta analisada foi a contagem de S. aureus (log UFC/g). Embora não tenha sido possível predizer de modo significativo o desenvolvimento de S. aureus em molho para salada, foi evidente o efeito antibacteriano in situ exercido pelo OEO, embora o mesmo não tenha ocorrido em função do teor de sal ou pela combinação dos dois fatores estudados. Assim, a encapsulação do OEO constituiu uma alternativa promissora para a manutenção das propriedades biológicas do composto natural avaliado. ABSTRACT This study aimed to evaluate the effect of oregano essential oil (OEO), encapsulated by ionic gelation, and salt (NaCl) in controlling the development of Staphylococcus aureus. It was employed a 2 2 factorial design with 3 repetitions of the central point. The dependent variable analyzed was S. aureus count (log CFU/g). Although it was not possible to predict significantly the development of S. aureus in salad dressing, it was evident the antibacterial effect exerted by the OEO, although the same has not occurred by the salt content or by the combination of the two factors studied. Thus, the encapsulation of OEO constituted a promising alternative for the maintenance of biological properties of the reported natural compound. PALAVRAS-CHAVE: encapsulação; orégano; antimicrobiano. KEYWORDS: encapsulation; oregano; antimicrobial. 1. INTRODUÇÃO

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, doenças veiculadas por alimentos são responsáveis por várias complicações e mortes em todo o mundo (Pesavento et al., 2015). A gastroenterite estafilocócica é uma intoxicação causada pela ingestão de alimentos contaminados com enterotoxinas produzidas geralmente por Staphylococcus coagulase e termonuclease positivas. Dentre o gênero Staphylococcus sp. destaca-se a espécie Staphylococcus aureus, produtora de enterotoxinas em temperaturas compreendidas entre 10 e 46 C, e apresentando temperatura ótima de desenvolvimento na faixa de 40 a 45 C. Tais características possibilitam que a espécie seja encontrada, mesmo que em pequenas quantidades, em quase todos os produtos de origem animal ou alimentos diretamente manipulados, que não foram submetidos ao tratamento térmico (Jay, 2005). Com o recente avanço de pesquisas acerca de possíveis efeitos nocivos de compostos químicos e artificiais amplamente empregados em alimentos, incluindo muitos utilizados como conservantes em alimentos, pesquisadores têm procurado alternativas como o uso de substâncias naturais visando prolongar a vida-de-prateleira dos alimentos e evitar o desenvolvimento de possíveis micro-organismos patogênicos humanos (Calo et al., 2015). Diversas especiarias possuem uso frequente em alimentos, sendo eficazes em sistemas in vitro contra distintas cepas microbianas. Dentre essas especiarias merece destaque o orégano (Origanum vulgare L.), cuja atividade antimicrobiana relaciona-se à presença de compostos fenólicos como o carvacrol e o timol, presentes em concentrações que variam de traços até cerca de 85 % da composição do produto (Pesavento et al., 2015). Por serem compostos voláteis, os óleos essenciais podem evaporar e/ou se decompor facilmente durante o processamento de alimentos, quando expostos ao calor, à pressão, à luz ou ao oxigênio, comprometendo a ação biológica do composto (Hosseini et al., 2013). Além disso, sabe-se que as propriedades antimicrobianas dos óleos essenciais são reduzidas quando estes compostos são empregados diretamente nos alimentos (Weiss et al., 2015). Uma das alternativas propostas para melhorar o efeito antimicrobiano dos óleos essenciais em alimentos é a encapsulação, visando proteger e controlar a liberação dos componentes biologicamente ativos e permitindo a estabilização do produto (Costa et al., 2012). Dentre os métodos de encapsulação existentes, a gelificação iônica tem sido amplamente estudada. O processo de gelificação iônica consiste na capacidade de polissacarídeos aniônicos (alginato, pectina, goma carragena, entre outros) de formar gel em presença de íons como o cálcio. Diante do exposto, esta pesquisa objetivou estudar o efeito do óleo essencial de orégano, encapsulado por gelificação iônica, no controle do desenvolvimento de Staphylococcus aureus em molho para salada. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Materiais As matérias-primas empregadas na elaboração dos molhos para salada foram adquiridas no mercado local de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil, consistindo em óleo de soja (Vila Velha - Louis Dreyfus Commodities Brasil), extrato de soja integral em pó (Mãe Terra Produtos Naturais Ltda.), leite em pó integral (Itambé Alimentos S/A), sal - cloreto de sódio (Lebre - Norte Salineira S/A) e água mineral Leve. Os meios de cultura utilizados foram provenientes da HiMedia Laboratories e o polisorbato 80, Tween 80, da empresa Sigma Aldrich. O óleo essencial de orégano (grau de pureza de 100%) foi adquirido da empresa Laszlo Aromaterapia Ltda. O alginato de sódio e o cloreto de cálcio foram comprados da empresa Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 2.2 Cultura bacteriana

A cepa Staphylococcus aureus (ATCC 25923) foi mantida em Ágar Padrão para Contagem (PCA) a 4 C, e reativada no mesmo meio de cultura, com incubação a 35 C por 24 horas. Para o estudo in situ, a carga bacteriana foi padronizada na concentração de 10 8 UFC/mL, a partir da escala 0,5 Mc Farland. 2.3 Óleo essencial de orégano Foram utilizadas as concentrações de 0,2, 0,3 e 0,4 % do óleo essencial de orégano, empregadas diretamente no sistema alimentício (molho para salada). 2.4 Encapsulação do óleo essencial de orégano Inicialmente 10 ml de OEO foram adicionados a 30 ml de uma solução estéril composta por alginato de sódio (1,0 %) e Tween 80 (0,5 %). A mistura foi homogeneizada por 45 minutos, a 300 rpm, com o auxílio de um agitador magnético. A emulsão alginato/óleo essencial de orégano foi, então, adicionada por gotejamento à solução de cloreto de cálcio na concentração de 1,0 %; para tanto, fez-se uso de uma agulha de 25 µm. As microcápsulas obtidas permaneceram na solução de CaCl 2 por 30 minutos para cura e, em seguida, foram lavadas duas vezes com água destilada estéril. O excesso de água foi removido empregando-se papéis filtros 80 g/m 2 (Qualy - J.Prolab Ind. e Com. de Prod. para Lab. Ltda). As cápsulas foram mantidas sob refrigeração, a 4 C, até o momento do uso. 2.5 Processamento dos molhos para salada O produto teste empregado no estudo era composto por óleo vegetal de soja (Vila Velha Louis Dreyfus Commodities Brasil S/A), leite em pó integral (Itambé Alimentos S/A), extrato de soja integral (Mãe Terra Produtos Naturais Ltda.), água, óleo essencial de orégano encapsulado e cloreto de sódio (Fino Sal). A formulação básica do produto foi obtida após estudos preliminares e resultou no produto cujas características sensoriais foram bem aceitas por consumidores, conforme dados obtidos por Cattelan (2015). O estudo foi conduzido empregando um planejamento fatorial 2 2 com 3 repetições do ponto central, conforme Tabela 1. Tabela 1 Planejamento fatorial empregado na produção dos molhos para salada à base de óleo essencial de orégano. Variáveis Variáveis Codificadas Reais a Tratamento Concentração de Concentração de Sal (%) X 1 X 2 cápsulas de OEO (%) 1-1 -1 0,2 1,14 2 +1-1 0,4 1,14 3-1 +1 0,2 1,29 4 +1 +1 0,4 1,29 5 0 0 0,3 1,22 6 0 0 0,3 1,22 7 0 0 0,3 1,22 a Percentagens de óleo essencial de orégano (OEO) encapsulado e de sal em relação a 100 g molho para salada (peso/peso). Fonte: elaborada pelos autores. 2.6 Efeito in situ da adição de óleo essencial de orégano encapsulado e de sal sobre o desenvolvimento de Staphylococcus aureus

log UFC/g As distintas formulações de molho para salada (Tabela 1) foram contaminadas com a cepa bacteriana S. aureus, na contagem de 10 8 UFC/g. Empregou-se a metodologia descrita por Lancette e Bennett (2001) para a contagem bacteriana, em que é empregado o Ágar Telurito de Potássio Gema de Ovo para a enumeração das unidades formadoras de colônia (UFC) por grama de produto alimentício. As análises foram efetuadas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos, do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos da UNESP de São José do Rio Preto, SP. 2.7 Análise dos dados O estudo do efeito in situ da adição de óleo essencial de orégano encapsulado e de sal sobre o desenvolvimento de S. aureus foi conduzido em duplicata, sendo o planejamento inteiramente casualizado. Os fatores estudados foram a influência da concentração de óleo essencial encapsulado e do sal (NaCl) sobre a inibição bacteriana. Foi efetuada a análise da estatística descritiva dos dados. Para estimar os efeitos dos fatores concentração de óleo essencial de orégano encapsulado e teor de sal sobre a inibição microbiana in situ e avaliar a predição ou não do modelo matemático empregou-se a análise de variância (ANOVA), fazendo uso do software Statistica 7.0 (StatSoft Inc., Oklahoma, EUA). A variável dependente avaliada foi a contagem bacteriana. O nível de significância adotado foi de 5 %. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foi possível evidenciar que os tratamentos 1 e 3 apresentaram, em média, as menores contagens bacterianas, enquanto o tratamento 2 exibiu a maior contagem de S. aureus (Figura 1). Sabendo que a contagem inicial de S. aureus em todos os tratamentos era de 10 8 UFC/g, verificou-se a redução na carga bacteriana variando entre 25,9 e 47,8 %, para os tratamentos 2 e 3, respectivamente. Em todos os tratamentos foi possível observar efeito antibacteriano. Figura 1 Contagem de Staphylococcus aureus (log UFC/g) nos diferentes tratamentos de molho para salada. 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 1 2 3 4 5 6 7 Tratamento Tratamentos de 1 a 7 correspondem às formulações de molho para salada contendo distintos teores de óleo essencial de orégano (OEO) encapsulado e sal. 1 = 0,2 % de OEO e 1,14 % de sal; 2 = 0,4 % de OEO e 1,14 % de sal; 3 = 0,2 % de OEO e 1,29 % de sal; 4 = 0,4 % de OEO e 1,29 % de sal; 5, 6 e 7 = 0,3 % de OEO e 1,22 % de sal. Percentagens de óleo essencial de orégano (OEO) encapsulado e de sal em relação a 100 g de molho para salada (peso/peso). Fonte: elaborada pelos autores.

A Tabela 2 resume a avaliação estatística para a variável dependente contagem de S. aureus ( log UFC/g), com os efeitos e coeficientes para as variáveis avaliadas. Os valores foram considerados significativos em um intervalo de confiança de 95 %. A partir das variáveis significativas, efetuou-se uma análise de variância (ANOVA) que encontra-se apresentada na Tabela 3. Tabela 2 Regressão múltipla para ajuste do modelo de primeira ordem e análise de variância da regressão para os dados de contagem microbiana (log UFC/g) de Staphylococcus aureus em molho para salada. Termo Coeficiente Erro Puro t-estimativa Valor P Média 5,1614 0,0203 56,32 0,001 OEO (Linear) 0,6525 0,0124 5,38 0,033 Sal (Linear) -0,2225 0,0124-1,84 0,208 OEO x Sal -0,0125 0,0176-0,10 0,927 Regressão (ANOVA) --- --- --- 0,058 Falta de ajuste --- --- --- 0,273 OEO: concentração de óleo essencial de orégano; Sal: concentração de sal; OEO x Sal: concentração de óleo essencial de orégano encapsulado x concentração de sal. Fonte: elaborada pelos autores. Tabela 3 Análise de variância para a variável contagem de Staphylococcus aureus (log UFC/g) em molho para salada. Fonte de Média F Soma Quadrática Graus de Liberdade Variação Quadrática F crítico * Regressão 1,9017 3 0,6399 7,62 9,28 Resíduos 0,2496 3 0,0832 Falta de ajuste 0,1320 1 0,1320 2,24 18,51 Erro Puro 0,1176 2 0,0588 Total 2,1513 6 *R 2 = 0,7680; Valores tabelados: F regressão (3, 3, 95). Fonte: elaborada pelos autores. Os dados da Tabela 2 denotam que somente a concentração de OEO encapsulado (P = 0,033) influenciou significativamente na contagem de S. aureus. Deste modo, é evidente que o efeito antibacteriano in situ foi exercido somente pelo OEO e não pela adição do sal ou pela combinação dos dois fatores estudados. Os termos não significativos foram incorporados à falta de ajuste do modelo matemático para o cálculo do valor do coeficiente de determinação (R 2 ) e a relação entre os valores de F calculado e F crítico. O coeficiente de determinação obtido foi de 0,7680, indicando que o modelo matemático gerado explicou 76,80 % da variável resposta contagem de S. aureus, em um intervalo de confiança de 95 %. De acordo com o teste F (Tabela 3), o modelo não pode ser considerado preditivo, visto que o valor F foi superior ao valor de F crítico. De acordo com Box et al. (1978), para que uma regressão seja útil para fins preditivos, a relação entre os valores do teste F e do F crítico deve ser superior a três. No presente estudo, a relação entre os valores foi de 0,82, ou seja, inferior ao proposto pelos estudiosos. Cattelan (2015), em estudo sobre o efeito combinado da adição de OEO puro e de sal (NaCl) em condimentos preparados, também não foi capaz de predizer matematicamente a contagem de S. aureus no sistema alimentício teste em função das variáveis empregadas, dado o baixo coeficiente de determinação obtido (R 2 = 0,4769). Porém, a autora relatou redução na contagem de Staphylococcus aureus de cerca de 20 %, quando empregada a mesma combinação de concentração de OEO e sal utilizada no tratamento 1 do presente estudo. Deste modo, nota-se que o emprego do OEO encapsulado resultou em maior controle do desenvolvimento da espécie bacteriana empregada.

A encapsulação de óleos essenciais é uma alternativa promissora para a manutenção das propriedades biológicas de compostos naturais. Recentemente, a combinação dos óleos essenciais e moléculas ativas tem atraído atenção especial, pois visa obter sistemas eficazes e de liberação controlada que possam ser empregados em diversos seguimentos industriais (El Asbahani et al., 2015). 4. CONCLUSÕES Embora não tenha sido possível descrever matematicamente a redução na contagem de Staphylococcus aureus pelo emprego de óleo essencial de orégano encapsulado quando em combinação com o sal, foi evidente a redução na contagem bacteriana em função do teor de OEO encapsulado. A encapsulação do OEO em matriz de alginato de sódio visando o controle do desenvolvimento da cepa utilizada no estudo mostrou ser promissora. São necessários, porém, estudos mais detalhados para maior compreensão da liberação controlada do agente bioativo visando o desenvolvimento de sistemas de bioconservação de alimentos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Box, G. E. P., Hunter, W. G., & Junter, J. S. (1978). Statistics for experimenters. An introduction to design, data analysis and model building. Nova York: Editora Wiley. Calo, J. R., Crandal, P. G., O Bryan, C. A., & Ricke, S. C. (2015). Essential oils as antimicrobials in food systems - A review. Food Control, 54, 111-119. Cattelan, M. G. (2015). Atividade antibacteriana de óleo essencial de orégano (Origanum vulgare): ações in vitro e in situ para preservação de alimento (Tese de doutorado). Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto. Costa, S. B., Duarte, C., Bourbon, A. I., Pinheiro, A. C., Serra, A. T., Martins, M. M., Januário, M. I. N., Vicente, A. A., Delgadillo, I., Duarte, C., & Costa, M. L. B. (2012). Effect of the matrix system in the delivery and in vitro bioactivity of microencapsulated Oregano essential oil. Journal of Food Engineering, 110, 190-199. El Asbahani, Miladi, K., Badri, W., Sala, M., Ait Addi, E. H., Casabianca, H., El Mousadik, A., Hartmann, D., Jilale, A., Renaud, F. N. R., & Elaissari, A. (2015). Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics, 483, 220-243. Hosseini, S. F., Zandi, M., Rezaei, M., & Farahmandghavi, F. (2013). Two-step method for encapsulation of oregano essential oil in chitosan nanoparticles: Preparation, characterization and in vitro release study. Carbohydrate Polymers, 95, 50-56. Jay, J. M. (2005). Microbiologia de Alimentos. Porto Alegre: Artmed. Lancette, G. A; & Bennett, R. W. (2001). Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins. In: Downes, F. P. andito, K. (ed.). Compendium of Methods for the Microbiologycal Examinations of Foods, 4 th ed. Washington: American Public Health Association. Pesavento, G., Calonico, C., Bilia, A. R., Barnabei, M., Calesini, F., Addona, R., Mencarelli, L., Carmagnini, L., Di Martino, M. C., & Lo Nostro, A. (2015). Antibacterial activity of Oregano, Rosmarinus and Thymus essential oils against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in beef meatballs. Food Control, 54, 188-199. Weiss, J.; Loeffler, M., & Terjung, N. (2015). The antimicrobial paradox: why preservatives lose activity in foods. Current Opinion in Food Science, 4, 69-75.